結(jié)核病?？漆t(yī)院患者胸腔積液中病原菌分布及耐藥情況分析

王東萍 何瑤 趙京黎 程紅燕 江躍 包訓(xùn)迪

胸膜腔感染是臨床上引起滲出性胸腔積液的主要原因,流行病學(xué)數(shù)據(jù)提示胸腔感染發(fā)病率呈逐年增加的趨勢(shì)[1-2]。胸膜腔感染病原學(xué)診斷和藥敏對(duì)于患者的病因診斷、精準(zhǔn)治療、改善預(yù)后有重要價(jià)值。目前，我國關(guān)于胸膜腔感染完整的病原學(xué)研究數(shù)據(jù)不足，且存在地域差異，亦無相關(guān)指南指導(dǎo)抗菌藥物的選擇。本研究回顧性分析了安徽省級(jí)結(jié)核病醫(yī)院2020年臨床培養(yǎng)陽性的胸腔積液，探討了本院胸膜腔感染病原菌的分布規(guī)律和耐藥特征，以便為胸腔感染的診療提供依據(jù)。

資料與方法

一、研究對(duì)象

收集2020年1月-12月安徽省胸科醫(yī)院的胸腔積液患者，分析臨床資料和胸腔積液病原菌鑒定及藥敏結(jié)果，同一病例重復(fù)檢出同一種微生物僅納入第一株。

二、儀器與試劑

梅里埃Bact/ALERT 3D全自動(dòng)血培養(yǎng)儀，BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)儀，美國碧迪公司Phoenix100細(xì)菌鑒定藥敏儀，Bruker MALDI-TOF MS質(zhì)譜鑒定儀及各儀器的配套試劑。珠海銀科結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性檢測(cè)試劑盒，杭州創(chuàng)新生物結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群特異性早期分泌蛋白(MPB64)膠體金法檢測(cè)試劑盒。質(zhì)控菌株:大腸埃希菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC29213、銅綠假單胞菌ATCC27853，均購自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心，結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(H37RV)由國家結(jié)核病參比室惠贈(zèng)。

三、標(biāo)本培養(yǎng)鑒定及藥敏試驗(yàn)

1 細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定藥敏 無菌采集標(biāo)本后2 h內(nèi)送至微生物室，分別注入?yún)捬鹾托柩跹囵B(yǎng)瓶，接種量每瓶2～10 mL，立即放入Bactec 3D全自動(dòng)血培養(yǎng)儀內(nèi)。陽性標(biāo)本均使用Phoenix100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀或Bruker MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定。Phoenix100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏儀進(jìn)行MIC藥物敏感性試驗(yàn)，按照美國實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)2019 年版標(biāo)準(zhǔn)對(duì)藥敏數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)核菌培養(yǎng)方法及鑒定藥敏 標(biāo)本處理嚴(yán)格按照《結(jié)核病細(xì)菌學(xué)診斷操作規(guī)程》和BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)操作說明進(jìn)行分枝桿菌培養(yǎng)。放入BACTEC MGIT 960孵育箱孵育, 培養(yǎng)過程中儀器自動(dòng)報(bào)告結(jié)果。如果6周末仍未生長，則報(bào)告培養(yǎng)陰性。對(duì)培養(yǎng)陽性菌株用噻吩-2-羧酸肼(TCH)和對(duì)硝基苯甲酸(PNB)初步分型，聯(lián)合早期分泌蛋白(MPB64)膠體金法試劑盒或Bruker MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀進(jìn)行菌種鑒定。藥敏試驗(yàn)采用珠海銀科結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，最低抑菌濃度(MIC)判讀耐藥的標(biāo)準(zhǔn)按照臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical Laboratory Standards Institute,CLSI)CLSI M24-A2判定。

四、定義

社區(qū)獲得性感染(Community-acquired infection，CAI)社區(qū)獲得性感染是指在醫(yī)院外所患的感染性疾病。醫(yī)院獲得性感染(Hospital-acquired infection，HAI)：對(duì)于無明確潛伏期的感染，入院48小時(shí)后或出院后48小時(shí)內(nèi)發(fā)生的感染為醫(yī)院內(nèi)感染；有明確潛伏期的感染，自入院時(shí)起超過平均潛伏期后或自出院時(shí)在平均潛伏期內(nèi)發(fā)生的感染為醫(yī)院內(nèi)感染。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用WHONET5.6 軟件進(jìn)行耐藥性統(tǒng)計(jì)分析。采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較，單元格的期望計(jì)數(shù)小于5的，組間比較采用Fisher確切概率法；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般資料

2020年共收到1422位患者送檢的胸水標(biāo)本，最終有255例患者培養(yǎng)陽性，檢出率為17.9%(95%CI15.94%,19.93%)，其中男性199例(78.04%)，年齡(10～93)歲，平均(52.12±20.13)歲; 女性56 例(21.96%)，年齡(16～91)歲，平均(46.13±19.70)歲。255例患者中170例患者檢出結(jié)核分枝桿菌(168例檢出結(jié)核分枝桿菌，2例同時(shí)檢出結(jié)核分枝桿菌和普通細(xì)菌)，陽性檢出率66.67%(95%CI60.84%,72.49%);84例(32.94%；95%CI27.13%,38.75%)檢出分枝桿菌以外的微生物；1例(0.39%)同時(shí)檢出非結(jié)核分枝桿菌和分枝桿菌以外的微生物。

二、病原菌分布

255例患者共檢出292株病原菌，其中結(jié)核分枝桿菌170株，分枝桿菌以外的微生物121株，非結(jié)核分枝桿菌1株，經(jīng)鑒定共屬53個(gè)菌種。凝固酶陰性葡萄球菌共17株包括表皮葡萄球菌7株，溶血葡萄球菌5株，沃氏葡萄球菌2株，人葡萄球菌2株，山羊葡萄球菌1株，其中有12株凝固酶陰性葡萄球菌是與其他病原菌共同檢出的；21株鏈球菌包括星座鏈球菌8株，口腔鏈球菌4株，咽峽炎鏈球菌3株，大鼠鏈球菌、澳大利亞鏈球菌、緩癥鏈球菌、無乳鏈球菌、血鏈球菌、中間鏈球菌各1株；G+桿菌包括假白喉棒桿菌、發(fā)酵乳桿菌、紋帶棒桿菌、乳桿菌屬各1株。革蘭陰性(G-)55株(18.84%)來自于18個(gè)種。結(jié)果見(表1)。

表1 胸水樣本病原菌種類分布

三、主要G+菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性

G+菌普遍對(duì)萬古霉素、替考拉寧、利奈唑胺敏感。耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌(Methicillin resistant coagulase negative Staphylococcus，MRCNS)檢出率82.35%；4 例金黃色葡萄球菌中檢出耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)2株(50%)。結(jié)果見(表2)。

表2 主要革蘭陽性菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率(%)

四、主要G-菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率

10株銅綠假單胞菌有2株對(duì)碳青霉烯類耐藥，7株肺炎克雷伯菌中有2株產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶(ESBLs)，2株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(CRKpn)菌株。6株陰溝腸桿菌檢出1株耐碳青霉烯陰溝腸桿菌(CREcl)。結(jié)果見(表3)。

表3 主要革蘭陰性桿菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率(%)

五、合并感染者檢出病原菌種類

有23例(9.02%)合并感染者，其中13例伴有支氣管胸膜瘺或食管胸膜瘺。社區(qū)獲得性感染13例，檢出病原菌30株。醫(yī)院獲得性感染10例，2例患者為胸腔介入術(shù)后院內(nèi)感染，8例為肺部手術(shù)后感染，共檢出病原菌30株。在所有分離菌中，最常見的病原體依次是革蘭氏陰性菌(45%)、凝固酶陰性葡萄球菌(20%)和真菌(10%)。60株菌經(jīng)鑒定屬于36個(gè)種，社區(qū)獲得性感染和醫(yī)院獲得性感染檢出病原菌類型比較，均P>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。藥敏僅醫(yī)院獲得性感染檢出2例耐多藥菌(1例ESBLs大腸埃希菌，1例MRSA)(見表4)。

表4 合并胸膜感染菌微生物學(xué)特征比較

六、結(jié)核分枝桿菌藥敏

170株結(jié)核分枝桿菌中有91株結(jié)核菌進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，檢出耐多藥結(jié)核(MDR-TB)4株(4.40%)，未檢出泛耐藥結(jié)核(XDR-TB)。四個(gè)一線抗結(jié)核藥耐藥率分別為：異煙肼9.89%、利福平5.49%、鏈霉素15.83%、乙胺丁醇1.10%。二線抗結(jié)核藥左氧氟沙星、卷曲霉素、利福布汀、克拉霉素、氯法齊明均未見耐藥，卡那霉素、阿米卡星、力克肺疾的耐藥率均為1.10%。

討 論

本研究胸腔感染男性(78.04%)發(fā)病率遠(yuǎn)高于女性。國內(nèi)大型綜合性醫(yī)院報(bào)道細(xì)菌和結(jié)核感染胸膜炎男性發(fā)病率均在70.00%左右[3-4]。Dyrhovden[5]等的研究也發(fā)現(xiàn)了胸腔膿胸性別分布不均，口腔型細(xì)菌性膿性胸腔積液在男性中發(fā)病率非常高，男性占優(yōu)勢(shì)可能因其嚴(yán)重牙源性感染的頻率較高。

本研究共分離到121 株分枝桿菌以外的微生物，分布于51個(gè)菌種，G+菌(18.49%)和G-菌(18.84%)所占比例接近，這與CARSS[6]監(jiān)測(cè)結(jié)果一致。本研究G+球菌中鏈球菌屬和葡萄球菌屬均較多，此與CARSS數(shù)據(jù)胸水G+菌以金黃色葡萄球菌為主不同。國外研究發(fā)現(xiàn)最常見菌鏈球菌分離率為(31.5%～37%)，且檢出的鏈球菌屬多為口咽部正常菌群，很少與肺炎有關(guān)，葡萄球菌分離率為(23.4%～24.9%)[8,10-11]，本監(jiān)測(cè)結(jié)果與國外文獻(xiàn)報(bào)道有相似之處。17株凝固酶陰性葡萄球菌中有12株是與其他病原菌共同檢出的，均曾經(jīng)留置胸腔引流管，推測(cè)此類菌與長期留置胸腔引流管操作有相關(guān)性。國內(nèi)外的研究亦提示凝固酶陰性葡萄球菌在醫(yī)源性因素感染中占一定比例(3.64%～13.2%)[7,11]。本研究中55株G-桿菌來自于18個(gè)種，最常見的銅綠假單胞菌在胸水中僅占 3.42%，其后依次是肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、噬麥芽窄食單孢菌、鮑曼不動(dòng)桿菌。CARSS網(wǎng)監(jiān)測(cè)與本研究略有差異，胸水G-菌中前5位是大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、陰溝腸桿菌[7]。

藥敏結(jié)果顯示，主要G+菌未檢出對(duì)萬古霉素、利奈唑胺、替考拉寧耐藥。鏈球菌屬對(duì)青霉素、阿莫西林/克拉維酸及第三代頭孢全部敏感，對(duì)紅霉素、克林霉素、四環(huán)素耐藥率高較高。MRSA和MRCNS檢出率分別為50%和82.35%，且金葡菌對(duì)多種常用抗菌藥物耐藥菌率也要低于凝固酶陰性葡萄菌，本研究結(jié)果略高于CARSS網(wǎng)監(jiān)測(cè)結(jié)果MRSA(33.7%～43.4%)和MRCNS(71.4%～75.3%)[6]。G-桿菌中銅綠假單胞菌對(duì)多種抗菌藥物的耐藥率相對(duì)穩(wěn)定，耐藥率均不超過40%。肺炎克雷伯菌產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶(ESBLs)占28.6%，除對(duì)氨基糖苷類和四環(huán)素敏感性較好外，肺炎克雷伯菌的耐藥率均超過50%。腸桿菌目中CRKpn檢出率28.6%，CREcl檢出率16.7%，本研究結(jié)果CRKpn檢出率遠(yuǎn)高于CARSS監(jiān)測(cè)結(jié)果(7.1%～17.1%)[6]。碳青酶烯類藥物一般仍可作為多數(shù)腸桿菌目和銅綠假單胞菌引起的胸腔感染的經(jīng)驗(yàn)用藥，但肺炎克雷伯菌CRE檢出率較高，應(yīng)引起高度重視。

真菌是引起胸腔感染的致病菌之一，本研究念珠菌和曲霉菌共占3.42%，國內(nèi)較少三甲醫(yī)院開展絲狀真菌藥敏，臨床可根據(jù)國內(nèi)外相關(guān)指南選擇藥物。據(jù)報(bào)道大部分胸膜腔感染為合并有厭氧菌的混合性感染，但在常規(guī)的胸水培養(yǎng)中很難檢測(cè)到[1]。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)兼性厭氧與厭氧菌混合生長會(huì)使厭氧菌分離困難，樣本處理延遲也可導(dǎo)致嚴(yán)格厭氧菌分離受損。英國牛津的一項(xiàng)多中心前瞻性研究表明，用血培養(yǎng)瓶培養(yǎng)感染性胸水陽性率可從37.7%提高到58.5%，且接種量不影響分離率[12]。故推薦感染性胸水血培養(yǎng)瓶的床旁接種，這對(duì)提高檢出率是有價(jià)值的。

本研究合并感染者23例(9.02%)，共檢出60株菌，屬36個(gè)菌種。病例中有13例伴有支氣管胸膜瘺或食管胸膜瘺，增加了復(fù)數(shù)菌感染的風(fēng)險(xiǎn)。張蕾[7]等報(bào)道80例胸腔閉式引流術(shù)后的患者共分離出110株病原菌。國外文獻(xiàn)報(bào)道胸膜腔感染有9.8%～20% 的患者檢出復(fù)數(shù)菌感染[8-10]。分離菌中，合并感染中最常見的病原體是革蘭氏陰性菌(45%)、凝固酶陰性葡萄球菌(20%)和真菌(10%)。有報(bào)道社區(qū)獲得性胸膜感染的常見病原菌為鏈球菌、肺炎鏈球菌和厭氧菌，而醫(yī)院獲得性感染的常見病原菌為金黃色葡萄球菌、革蘭陰性菌[8]。本研究由于菌株數(shù)量有限、菌種分散，社區(qū)獲得性感染和醫(yī)院獲得性感染檢出病原菌類型比較，均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有待于后期擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

91株胸膜腔來源的結(jié)核菌對(duì)一線和二線抗結(jié)核藥耐藥率均低于第五次流調(diào)結(jié)果。共檢出MDR 4株(4.40%)，未檢出XDR，顯著低于全國第五次結(jié)核病流調(diào)報(bào)告[13]MDR-TB率6.8%、XDR-TB率2.1%，不同標(biāo)本類型來源的結(jié)核菌對(duì)抗癆藥的敏感率可能存在差異。Skouras[14]等報(bào)道胸膜結(jié)核分枝桿菌分離株對(duì)至少一種一線抗結(jié)核藥物耐藥率為10%，異煙肼耐藥率為6%～10%，MDR-TB和XDR-TB的耐藥率分別為1%～3%和0～1%，報(bào)道與本文較接近。但國內(nèi)外關(guān)于胸膜結(jié)核分枝桿菌耐藥性的數(shù)據(jù)均很少，有待后續(xù)研究。

綜上，本研究初步分析了結(jié)核病?？漆t(yī)院胸腔感染的流行病學(xué)特征和耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，所涵蓋微生物種類多。結(jié)核菌檢出仍占首位，但胸膜腔來源的結(jié)核菌對(duì)一線和二線抗結(jié)核藥耐藥率均較低。鏈球菌屬是胸腔感染常見的普通細(xì)菌。肺炎克雷伯菌等腸桿菌目細(xì)菌CRE檢出率高，需加強(qiáng)監(jiān)測(cè)。臨床治療應(yīng)重視病原學(xué)檢查，結(jié)合本地感染和耐藥流行趨勢(shì)，正確選擇抗菌藥物以提高治愈率。