百里香葉片揮發(fā)性物質(zhì)物候節(jié)律

李兆祺，司家屹，楊秀云

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院, 山西 太谷 030801）

植物在次生代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生許多分子量低且易揮發(fā)的化學(xué)物質(zhì)，這類(lèi)物質(zhì)是植物與外界環(huán)境進(jìn)行相互作用的重要媒介[1-3]。植物釋放的揮發(fā)性物質(zhì)不僅對(duì)自身生長(zhǎng)、繁衍、抵抗逆境脅迫具有重要作用[4-6]，而且會(huì)在改變大氣質(zhì)量、預(yù)防人體疾病和調(diào)節(jié)情緒等方面產(chǎn)生一些影響[7]。近年來(lái)，我國(guó)園林綠化工作者在保證城市景觀效果的同時(shí)兼顧其康養(yǎng)價(jià)值[8]，部分植物揮發(fā)性次生代謝產(chǎn)物對(duì)人體有一定的保健作用，具有揮發(fā)性物質(zhì)的園林植物的開(kāi)發(fā)利用可為建設(shè)保健型園林綠地提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

百里香(Thymus mongolicus)是唇形科(Labiatae)百里香屬一種典型的草本芳香植物，其全株具有誘人的香氣，是重要的食用、藥用和蜜源植物，同時(shí)在保持生態(tài)和園林觀賞等方面也具有較高價(jià)值，是極具開(kāi)發(fā)潛力的芳香植物[9]。目前世界上記載的百里香有350余種，我國(guó)百里香種質(zhì)資源眾多，與國(guó)外品種相比，我國(guó)的百里香適應(yīng)性較強(qiáng)，病蟲(chóng)害較少，栽培成本低，但是有效成分芳香油的含量以及自然狀態(tài)下釋放的揮發(fā)性物質(zhì)含量低，觀賞價(jià)值也較國(guó)外低[10]。當(dāng)前國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)百里香的研究主要集中在花色、揮發(fā)性氣味、精油提取等方面[10-12]，對(duì)其不同物候期與揮發(fā)性物質(zhì)釋放量的關(guān)系的研究尚鮮少報(bào)道。因此，對(duì)百里香的揮發(fā)性物質(zhì)在不同物候條件下的釋放節(jié)律的研究，有利于我國(guó)百里香資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用以及營(yíng)造康養(yǎng)型植物景觀。

本研究采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HS-SPME-GC-MS)技術(shù)，分析不同物候期百里香葉片揮發(fā)性物質(zhì)的種類(lèi)與含量，旨在探明百里香揮發(fā)性物質(zhì)釋放節(jié)律，以期為百里香的進(jìn)一步推廣應(yīng)用及植物葉片揮發(fā)性物質(zhì)的相關(guān)研究提供基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2020年4月至9月在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林業(yè)站百里香種質(zhì)資源圃進(jìn)行。該地區(qū)位于112°57′23.11″ E，37°85′27.96″ N，屬溫帶大陸性季風(fēng)氣候。試驗(yàn)材料為引種自渾源地區(qū)的野生百里香植株。分別在生長(zhǎng)旺盛期(4月17日)、開(kāi)花期(5月14日)、結(jié)果期(8月20日)和衰敗期(9月27日)4個(gè)物候期間，于10:00采用多株混合取樣法，選取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害侵染的百里香成熟葉片，用蒸餾水沖洗干凈后，每份樣品稱取0.5 g，3次重復(fù)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 頂空固相微萃取

分別精確稱取0.5 g百里香葉片，剪碎置于20 mL萃取瓶?jī)?nèi)并迅速密封。萃取條件：萃取頭為DVB/CAR/PDMS，50 ℃震蕩15 min，吸附5 min，進(jìn)樣溫度為270 ℃，解吸附5 min，進(jìn)行GC-MS檢測(cè)。

1.2.2 GC-MS檢測(cè)

色譜條件：色譜柱為HP-5MS石英毛細(xì)管柱，載氣為高純氦氣，流速為1 mL·min-1，采用不分流進(jìn)樣方式，起始溫度為40 ℃，保持3 min，以5 ℃·min-1升溫至270 ℃，保持6 min。

質(zhì)譜條件：離子源為EI源，離子傳輸線溫度為250℃，離子源溫度為230 ℃，質(zhì)量掃描范圍50～550 amu。

1.2.3 揮發(fā)性成分定性定量方法

定性方法：根據(jù)GC-MS檢測(cè)得到的質(zhì)譜信息，采用計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)與NIST質(zhì)譜庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，對(duì)揮發(fā)物成分進(jìn)行鑒定。

定量方法：以右旋龍腦(純度 ≥ 99%，湖南晃龍公司生產(chǎn))為外標(biāo)，根據(jù)右旋龍腦標(biāo)準(zhǔn)品的濃度(y)和峰面積(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(y= 0.000 000 000 13x+0.042 083 942 95，R2= 0.991)，揮發(fā)物的含量 = 濃度 ×內(nèi)標(biāo)體積/樣本質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2010和SPSS 19.0軟 件對(duì)所測(cè)數(shù) 據(jù)整理分析，用平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤差表示測(cè)定結(jié)果，采用Duncan法對(duì)不同采樣時(shí)期各類(lèi)揮發(fā)性物質(zhì)含量多重比較，采用Origin 9.0軟件繪圖。

2 結(jié)果

2.1 不同物候期百里香葉片釋放的揮發(fā)性物質(zhì)種類(lèi)及含量分析

百里香葉片在4個(gè)物候期中共檢測(cè)出69種揮發(fā)性物質(zhì)，但是不同物候期釋放的揮發(fā)性物質(zhì)在種類(lèi)上存在著明顯的差異(表1)。百里香葉片的揮發(fā)性物質(zhì)種類(lèi)隨著物候期的變化呈下降趨勢(shì)。其中，生長(zhǎng)旺盛期的種類(lèi)最多為53種，開(kāi)花期和結(jié)果期分別為50種和43種，而衰敗期僅有28種。

表1 不同物候期百里香葉片釋放的揮發(fā)性物質(zhì)及含量Table 1 Volatile components and amounts released from Thymus mongolicus leaves at different phenological periods

續(xù)表1 (1)Table 1 (Continued)

續(xù)表1 (2)Table 1 (Continued)

在各物候期的百里香葉片中釋放種類(lèi)最多的揮發(fā)性物質(zhì)均為烯烴類(lèi)化合物，表現(xiàn)為生長(zhǎng)旺盛期(23種) ＞ 開(kāi)花期(21種) ＞ 結(jié) 果期(20種) ＞ 衰敗期(13種)；醇類(lèi)揮發(fā)性物質(zhì)在生長(zhǎng)旺盛期釋放種類(lèi)相對(duì)較多(10種)，而在開(kāi)花期和結(jié)果期均釋放了7種，衰敗期釋放了6種；芳香烴類(lèi)揮發(fā)性物質(zhì)種類(lèi)在開(kāi)花期最多(7種)，在衰敗期最少(4種)；酯類(lèi)揮發(fā)性物質(zhì)的種類(lèi)在生長(zhǎng)旺盛期、開(kāi)花期、結(jié)果期和衰敗期分別為5種、3種、2種和1種。此外，酮類(lèi)揮發(fā)性物質(zhì)在各個(gè)物候期的釋放種類(lèi)均相對(duì)較少，衰敗期僅釋放了1種揮發(fā)物，其余物候期釋放了4種揮發(fā)物。

不同物候期百里香葉片釋放的揮發(fā)性物質(zhì)總量不同(圖1)，隨著物候期推移呈先升后降的變化趨勢(shì)，表現(xiàn)為開(kāi)花期和結(jié)果期含量相對(duì)較高，分別為163.90和157.21 μg·g-1；而生長(zhǎng)旺盛期和衰敗期相對(duì)較低，分別為104.47和75.42 μg·g-1，顯著低于開(kāi)花期和結(jié)果期的含量(P＜ 0.05)。

百里香葉片各類(lèi)揮發(fā)性物質(zhì)含量在不同物候期間存在差異(圖1)。其中，烯烴類(lèi)揮發(fā)性物質(zhì)在生長(zhǎng)旺盛期、開(kāi)花期、結(jié)果期和衰敗期含量分別為43.12、85.82、83.52和11.69 μg·g-1，開(kāi)花期和結(jié)果期的含量顯著高于其他時(shí)期(P＜ 0.05)。醇類(lèi)揮發(fā)性物質(zhì)在結(jié)果期含量最高，為27.30 μg·g-1，衰敗期含量最低，僅為8.96 μg·g-1。芳香烴類(lèi)揮發(fā)性物質(zhì)含量在開(kāi) 花 期(54.84 μg·g-1)、衰 敗 期(53.40 μg·g-1)和 結(jié) 果期(43.32 μg·g-1)差異不顯著(P＞ 0.05)，但3個(gè)時(shí)期均顯著高于生長(zhǎng)旺盛期含量(29.14 μg·g-1)。酮類(lèi)揮發(fā)性物質(zhì)在結(jié)果期(3.01 μg·g-1)釋放量最大，顯著高于其他物候期。酯類(lèi)揮發(fā)性物質(zhì)在生長(zhǎng)旺盛期(2.32 μg·g-1)的釋放量高于開(kāi)花期(0.80 μg·g-1)、結(jié)果期(0.51 μg·g-1)與衰敗期(0.13 μg·g-1)。其他類(lèi)揮發(fā)性物質(zhì)在生長(zhǎng)旺盛期釋放量(12.27 μg·g-1)均高于其他時(shí)期。

圖1 4個(gè)物候期百里香葉釋放的揮發(fā)性物質(zhì)含量Figure 1 Volatile components released from Thymus mongolicus leaves in the four phenological periods

2.2 百里香葉片4個(gè)物候期主要揮發(fā)性物質(zhì)的物候節(jié)律性變化

4個(gè)物候期的百里香葉片共有揮發(fā)性物質(zhì)有23種，其中含量高于3.00 μg·g-1的揮發(fā)性物質(zhì)有11種，主要是烯烴類(lèi)、醇類(lèi)及芳香烴類(lèi)物質(zhì)。

百里香葉片中烯烴類(lèi)揮發(fā)性物質(zhì)在不同物候期的變化情況如圖2所示。γ-松油烯在開(kāi)花期的釋放量相對(duì)較高，為44.96 μg·g-1，明顯高于其他各個(gè)時(shí)期；莰烯、雙環(huán)[3.1.0]六角-2-烯、月桂烯和檜烯均在結(jié)果期釋放量相對(duì)較高，分別為14.94、13.13、9.09和3.31 μg·g-1，其次為開(kāi)花期，含量分別為7.35、7.50、7.84和1.83 μg·g-1。反式石竹烯的含量表現(xiàn)為開(kāi)花期(9.50 μg·g-1) ＞ 生長(zhǎng)旺盛期(7.68 μg·g-1) ＞ 結(jié)果期(2.81 μg·g-1) ＞ 衰敗期(0.97 μg·g-1)；而β-蒎烯含量最大值則出現(xiàn)在結(jié)果期，為4.09 μg·g-1。

圖2 共有主要揮發(fā)物中烯烴類(lèi)揮發(fā)性物質(zhì)含量Figure 2 Analysis of volatile alkenes among the common major volatiles

百里香葉片中主要的醇類(lèi)和芳香烴類(lèi)揮發(fā)性物質(zhì)在不同物候期的變化情況如圖3所示。桉葉油 醇 的 含 量 表 現(xiàn) 為 結(jié) 果 期(18.90 μg·g-1) ＞ 開(kāi) 花 期(13.92 μg·g-1) ＞ 衰 敗 期(7.06 μg·g-1) ＞ 生 長(zhǎng) 旺 盛 期(4.89 μg·g-1)；右旋龍腦在生長(zhǎng)旺盛期含量最大(6.41 μg·g-1)，衰敗期最小(0.90 μg·g-1)，開(kāi)花期和結(jié)果期分別釋放了3.99和4.81 μg·g-1；鄰-異丙基甲苯的含量表現(xiàn)為衰敗期(52.93 μg·g-1) ＞ 開(kāi)花期(46.84 μg·g-1) ＞結(jié)果期(36.94 μg·g-1) ＞ 生長(zhǎng)旺盛期(25.71 μg·g-1)；2-甲氧基-4-甲基-1-(1-甲基乙基)苯在衰敗期含量最低(0.25 μg·g-1)，與開(kāi)花期(7.02 μg·g-1)、結(jié)果期(5.02 μg·g-1)和生長(zhǎng)旺盛期(2.92 μg·g-1)含量差異較大。

圖3 共有主要揮發(fā)物中醇類(lèi)和芳香烴類(lèi)揮發(fā)性物質(zhì)含量Figure 3 Analysis of volatile alcohols and aromatic hydrocarbons among the common major volatiles

3 討論與結(jié)論

植物揮發(fā)性物質(zhì)的合成與釋放是植物自身代謝調(diào)控和各類(lèi)環(huán)境因子綜合作用的結(jié)果[13]。隨著物候的變化，外界環(huán)境因子發(fā)生改變，植物也相應(yīng)進(jìn)入不同的生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期，其揮發(fā)性物質(zhì)作為生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的一種細(xì)胞調(diào)控信號(hào)，伴隨自身代謝調(diào)控和物候期的變化呈現(xiàn)出相應(yīng)的動(dòng)態(tài)特征，形成了節(jié)律性的差異[14]。蔣冬月等[15]對(duì)比了黃金香柳(Melaleuca bracteata)季節(jié)動(dòng)態(tài)變化和日變化規(guī)律發(fā)現(xiàn)，6月檢測(cè)到的揮發(fā)性物質(zhì)種類(lèi)相對(duì)較多，認(rèn)為這主要是由于夏季溫度升高，光照時(shí)間變長(zhǎng)，植物代謝途徑發(fā)生了活躍的變化，從而釋放相對(duì)較多的揮發(fā)性物質(zhì)。楊素華等[16]研究了樟樹(shù)(Cinnamomum camphora)葉片揮發(fā)性物質(zhì)的年季變化規(guī)律發(fā)現(xiàn)，植株5月份釋放的揮發(fā)性物質(zhì)種類(lèi)最多。李娟等[17]研究側(cè)柏(Platycladus orientalis)揮發(fā)性物質(zhì)季節(jié)變化規(guī)律發(fā)現(xiàn)，側(cè)柏?fù)]發(fā)物含量隨季節(jié)變化表現(xiàn)為夏季 ＞ 春季 ＞秋季 ＞ 冬季。郭阿君等[18]對(duì)火炬樹(shù)(Rhus tyhpina)葉片揮發(fā)性物質(zhì)季節(jié)動(dòng)態(tài)變化規(guī)律進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，不同季節(jié)火炬樹(shù)揮發(fā)性物質(zhì)種類(lèi)及相對(duì)含量存在差異。春、秋兩季以萜烯類(lèi)化合物為主，夏季烴類(lèi)化合物比例稍高于萜烯類(lèi)，同時(shí)包含少量的酮類(lèi)和醇類(lèi)化合物。本研究表明，百里香春季生長(zhǎng)旺盛期種類(lèi)最多，與其代謝速率相對(duì)較強(qiáng)，且葉片需要進(jìn)行多種途徑的代謝活動(dòng)以滿足生長(zhǎng)發(fā)育的需求有關(guān)；在植株進(jìn)入生殖生長(zhǎng)期后，葉片功能發(fā)生了變化，需要通過(guò)降低代謝速率以滿足生殖生長(zhǎng)的養(yǎng)分需求，從而導(dǎo)致次生代謝產(chǎn)物種類(lèi)的減少[19]。不同時(shí)期的葉片積累物質(zhì)由于植物生理需求的不同而產(chǎn)生變化，因此進(jìn)入衰敗期后，生殖生長(zhǎng)期間大量的養(yǎng)分消耗和外界氣候因子變化的雙重影響使植物次生代謝活動(dòng)進(jìn)一步減緩，造成這一時(shí)期百里香葉片中揮發(fā)性物質(zhì)種類(lèi)顯著降低[20]。

有關(guān)研究表明，次生代謝產(chǎn)物在植物的生理調(diào)節(jié)、生存競(jìng)爭(zhēng)、自身保護(hù)以及協(xié)調(diào)與環(huán)境之間的關(guān)系等方面起著重要作用[21]。隨季節(jié)的變化，外界的光、空氣、土壤、溫度和濕度等各種生態(tài)環(huán)境因素以及生物自身的調(diào)控均會(huì)發(fā)生改變，從而影響到植物的次生代謝過(guò)程。已有研究證實(shí)植物中揮發(fā)性物質(zhì)的釋放量與光照、空氣、土壤、溫度、濕度以及蒸騰速率等環(huán)境因子密切相關(guān)[22-27]。在本研究中，百里香葉片揮發(fā)性物質(zhì)總釋放量在開(kāi)花期和結(jié)果期顯著高于其他各生長(zhǎng)時(shí)期，而生長(zhǎng)旺盛期、衰敗期揮發(fā)性物質(zhì)含量較低，這是多重因素協(xié)同作用產(chǎn)生的結(jié)果，是植物通過(guò)自身代謝調(diào)控以適應(yīng)外界環(huán)境變化的表現(xiàn)。百里香開(kāi)花期與結(jié)果期處于5月下旬到10月之間，此階段光照時(shí)間長(zhǎng)，植物葉片可以充分進(jìn)行光合作用，為植物次生代謝提供了充足的反應(yīng)前體物質(zhì)與能量，并且在一定范圍內(nèi)，溫度升高會(huì)使參與次生代謝有關(guān)的酶活性增強(qiáng)，促進(jìn)揮發(fā)性物質(zhì)釋放量的提高[28]。此外，一些學(xué)者證實(shí)，強(qiáng)烈的蒸騰作用使植物葉片氣孔張大，氣孔的開(kāi)合度對(duì)植物體揮發(fā)性物質(zhì)的釋放具有調(diào)控作用[29-30]。本研究在不同物候期選取百里香的葉片部位進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得揮發(fā)性物質(zhì)含量存在差異的結(jié)果，與葉片氣孔開(kāi)度的大小也具有一定的關(guān)聯(lián)。

烯烴類(lèi)、醇類(lèi)、酮類(lèi)揮發(fā)物是一類(lèi)富含碳原子的次生代謝產(chǎn)物，其在衰敗期釋放量最低，主要是由于植株在進(jìn)入衰敗期前經(jīng)歷了生殖生長(zhǎng)期，大量的碳水化合物、激素等養(yǎng)分被消耗，且由于進(jìn)入衰敗期時(shí)，外界日照時(shí)長(zhǎng)、溫度等生態(tài)環(huán)境因子也發(fā)生了顯著的降低[31]。在本研究中也發(fā)現(xiàn)相似結(jié)果，在百里香葉片中測(cè)得的烯烴類(lèi)物質(zhì)在開(kāi)花期釋放量最高，醇類(lèi)和酮類(lèi)物質(zhì)在結(jié)果期釋放量最高，百里香進(jìn)入衰敗期后，葉片中測(cè)得的烯烴類(lèi)、酮類(lèi)和醇類(lèi)揮發(fā)性物質(zhì)的含量均降到最低。百里香葉片中芳香烴類(lèi)揮發(fā)物在衰敗期的釋放量相對(duì)較高。芳香烴類(lèi)的揮發(fā)物質(zhì)是由苯丙烷代謝途徑產(chǎn)生的，與植物抗性聯(lián)系密切，已有研究證實(shí)，光照、溫度、病蟲(chóng)害、機(jī)械損傷、外源激素等都能夠誘導(dǎo)苯丙烷代謝途徑相關(guān)酶系的活性增加[32-35]，酶活性的增加在一定程度上促進(jìn)了其調(diào)控產(chǎn)物的積累量。由于衰敗期受到外界的光照、溫度、土壤水分含量等環(huán)境因子的刺激，植物會(huì)通過(guò)生理代謝上的策略，即加速次生代謝來(lái)應(yīng)對(duì)和克服脅迫條件[30]。因此，揮發(fā)性物質(zhì)的釋放與有關(guān)酶活性的研究對(duì)揭示百里香揮發(fā)性物質(zhì)釋放的物候節(jié)律也尤為必要。

本研究表明，在4個(gè)物候期從百里香葉片中共檢測(cè)出69種揮發(fā)性物質(zhì)，其中生長(zhǎng)旺盛期釋放種類(lèi)最多為53種，其次為開(kāi)花期50種，結(jié)果期和衰敗期分別有43種和28種。百里香葉片揮發(fā)性物質(zhì)總釋放量在開(kāi)花期和結(jié)果期顯著高于生長(zhǎng)旺期和衰敗期。其中含量高于3.00 μg·g-1的揮發(fā)性物質(zhì)有11種，主要是烯烴類(lèi)、醇類(lèi)及芳香烴類(lèi)物質(zhì)隨物候期變化表現(xiàn)出差異性特征。