PCV 與PEDV混合感染的實驗室檢測

楊克禮，陳文杰，郭 銳，周丹娜，袁芳艷，劉澤文，劉 威，高 婷，田永祥*

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 畜禽細(xì)菌病防治制劑創(chuàng)制重點實驗室/湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，湖北 武漢 430064；2.畜禽病原微生物學(xué)湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430064）

豬 圓 環(huán) 病 毒（Porcine circovirus， PCV）是 目前已知最小的病毒之一，在分類學(xué)上屬于圓環(huán)病毒科（Circoviridae）、圓環(huán)病毒屬（Circovirus）［1］，是危害我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要致病病毒。在2019年以前，豬圓環(huán)病毒包含豬圓環(huán)病毒l型（Porcine cirovirus type l， PCV1）、豬圓環(huán)病毒2型（Porcine cirovirus type 2， PCV2）和豬圓環(huán)病毒3型（Porcine cirovirus type 3， PCV3）3個基因型［2-3］。研究證實：PCV1無致病性；PCV2和PCV3是豬圓環(huán)病毒病的主要病原體，可引發(fā)斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（Post-weaning multisystemic wasting syndrome， PMWS）和豬皮炎與腎病綜合征（Porcine dermatitis nephropathy syndrome， PDNS）等臨床疾病；PCV3除引起母豬繁殖障礙、皮炎腎病綜合征外，還會引起仔豬腹瀉等［2-3］，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失［4］。2019年研究人員在我國湖南省患有呼吸系統(tǒng)疾病、腹瀉和豬皮炎與腎病綜合征的豬群中首次檢測到了另一種新型豬圓環(huán)病毒——PCV4（Porcine cirovirus type 4），其 與 PCV1~PCV3型 具有明顯的遺傳差異［5］。隨后有學(xué)者先后在河南、山西［6］、廣西［7］和江蘇［8］等地發(fā)現(xiàn)PCV4出現(xiàn)了流行。

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea， PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus， PEDV）引起的一種嚴(yán)重危害豬群的病毒性傳染病。發(fā)病豬臨床特征性表現(xiàn)主要有嘔吐、水樣腹瀉、嚴(yán)重脫水等［9］；各年齡段豬只均可感染，以仔豬受害最重，死亡率在80%以上［10-11］。該病主要由帶毒豬及其糞便經(jīng)糞-口途徑傳播。近年來，豬流行性腹瀉的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。自2010年以來，我國流行的PEDV毒株發(fā)生了變異，特別是S基因出現(xiàn)了多處插入和缺失，與經(jīng)典毒株CV777相比毒力增強了［12］；高毒力PEDV變異株的出現(xiàn)嚴(yán)重影響了我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展［13］。

近年來，我國多地報道了有豬圓環(huán)病毒2型和豬流行性腹瀉病毒2種甚至多種病原混合感染的情況［14-16］。為了解湖北省內(nèi)規(guī)?；B(yǎng)豬場豬圓環(huán)病毒和豬流行性腹瀉病毒的混合感染情況，筆者對來自該省內(nèi)16個規(guī)?；B(yǎng)豬場的650份組織樣品進(jìn)行了實驗室檢測，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV、d NTPs和Taq DNA聚合酶均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；病毒DNA/RNA提取試劑盒購自Axygen公司；瓊脂糖及其他試劑均購自商業(yè)公司。

1.2 樣品來源

2020年6~12月，從湖北省內(nèi)16個規(guī)?；B(yǎng)豬場采集送檢的病豬組織樣品包括血液、脾臟和淋巴結(jié)等共490份，腹瀉樣品（包括病豬的腸及內(nèi)容物）160份，共650份，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 樣品處理及病毒DNA/RNA的提取

將組織樣品按1∶5的比例（W/V）加入適量、pH 7.2的PBS液，置無菌勻漿器中，研磨勻漿，反復(fù)凍融3~5次，以8000~10000 r/min離心3~5 min，取上清液400 μL，按病毒DNA/RNA提取試劑盒說明書中的方法提取核酸，立即用于檢測或置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 cDNA的合成

cDNA的 合 成 體 系 為20 μL體 系，其 中 含5×M-MLV反 轉(zhuǎn) 錄Buffer 4 μL、10 mmol/L dNTPs 2 μL、M-MLV反 轉(zhuǎn) 錄 酶1 μL （100 U）、random Primer 1 μL （30 μmol/L）、Rnasin 1 μL、模板RNA 2 μL，用DEPC水補至20 μL。滅活（42 ℃ 2 h，95 ℃ 5 min）反轉(zhuǎn)錄酶，即得cDNA，立即用于檢測或置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PCV及PEDV的檢測

利用本研究室前期建立的豬圓環(huán)病毒多重PCR檢測方法［1］檢測PCV1、PCV2和PCV3。其引物序列如下： PCV1-F，5′-GAAAGTGAGCGGGAA GAT-3′； PCV1-R，5′-CTGATTGCTGGTAA TCAA-3′； PCV2-F，5′-CACATCGAGAAAG CGAAAGGAAC-3′； PCV2-R，5′-TGCGGGCCA AAAAAGGTACAGTT-3′； PCV3-F，5′-A GCAGTGCTCCCCATTGA-3′； PCV3-R，5′-TGGGCCCGACCAAATCCGG-3′。

PCR反應(yīng)采用50 μL體系，包含10×PCR Buffer 5.0 μL、Taq聚合酶（5 U/μL） 0.5 μL、dNTPs （10 mmol/L） 4.0 μL、上下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL、DNA模板5.0 μL，余下體積用DEPC水補足。

PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性4 min； 94 ℃變性45 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，共進(jìn)行35個循環(huán)；最后72 ℃延伸8~10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳20~30 min，于紫外觀測儀中觀察記錄結(jié)果。

PCV4的檢測參照Sun等［7］報道的方法進(jìn)行。PEDV的檢測參照Ishikawa等［17］報道的方法進(jìn)行。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

對16個養(yǎng)殖場的PCV1、PCV2、PCV3、PCV4或PEDV單一病原感染的陽性率，PCV1、PCV2、PCV3、PCV4或PEDV雙重感染的陽性率，以及PCV1、PCV2、PCV3、PCV4或PEDV多重感染的陽性率分別進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一病原感染的檢測結(jié)果

對來自16個規(guī)?；i場的650份組織病料，應(yīng)用豬圓環(huán)病毒多重PCR檢測方法、PCV4 PCR檢測方法［7］、PEDV RT-PCR檢測方法［17］分別進(jìn)行PCV1-3、PCV4和PEDV的病原學(xué)檢測，單一病原感染的檢測結(jié)果詳見表1。部分樣品的檢測結(jié)果見圖1、圖2。由表1可知：除PCV4未檢出陽性外，PCV1、PCV2、PCV3或PEDV單一感染的樣品陽性率分別為1.08%、4.15%、2.46%和6.46%；豬場PCV1、PCV2、PCV3或PEDV單一感染的最高陽性 率分別為4.35%、11.11%、8.33%和13.04%。

表1 單一病原感染的檢測統(tǒng)計結(jié)果

圖1 部分樣品PCV的多重PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

圖2 部分樣品PEDV的RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

2.2 雙重感染的檢測結(jié)果

對來自16個豬場的650份組織樣品，應(yīng)用豬圓環(huán)病毒多重PCR檢測方法、PCV4 PCR檢測方法和PEDV RT-PCR檢測方法分別進(jìn)行豬圓環(huán)病毒和豬流行性腹瀉病毒的病原學(xué)檢測，對雙重感染的樣品數(shù)分別進(jìn)行統(tǒng)計，陽性數(shù)（陽性率）結(jié)果如表2所示：PEDV+PCV1感染的陽性數(shù)（陽性率）為2（0.31%），PEDV+PCV2為23（3.54%），PEDV+PCV3為5（0.77%），PCV1+PCV2為4（0.62%），PCV2+PCV3為10（1.54%），PCV3+PCV1為2（0.31%）。在所檢測的16家規(guī)模化豬場中，由PEDV、PCV引起的雙重感染主要是PEDV+PCV2和PCV2+PCV3 2種，其樣品陽性率分別為3.54%和1.54%，分別占雙重感染陽性樣品總數(shù)的50.00%（23/46）和21.74%（10/46）。

2.3 多重感染的檢測結(jié)果

對來自16個豬場的650份組織樣品，應(yīng)用豬豬圓環(huán)病毒多重PCR檢測方法、PCV4 PCR檢測方法和PEDV RT-PCR檢測方法分別進(jìn)行豬圓環(huán)病毒和豬流行性腹瀉病毒的病原學(xué)檢測，對多重感染的樣品數(shù)分別進(jìn)行統(tǒng)計，多重感染陽性數(shù)（陽性率）的結(jié)果（表3）如下：PEDV+PCV1+PCV2感染的陽性數(shù)（陽性率）為3（0.46%），PEDV+PCV2+PCV3為13（2.00%），PEDV+PCV1+PCV3為3（0.46%），PCV1+PCV2 +PCV3為4（0.62%），PEDV+PCV1+PCV2 +PCV3為4（0.62%）。在所檢測的16家規(guī)?；i場中，由PCV、PEDV引起的多重感染主要是PEDV+PCV2+PCV3，其樣品陽性率為2.00%，占多重感染陽性樣品總數(shù)的48.15%（13/27）。

表2 PCV、PEDV雙重感染的檢測統(tǒng)計結(jié)果

表3 PEDV、PCV多重感染的檢測統(tǒng)計結(jié)果

2.4 不同感染類型場的陽性率統(tǒng)計結(jié)果

為了解不同感染類型場的陽性率，按不同感染類型對陽性場數(shù)及陽性率分別進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果見表4。由表4可知：單一感染的場陽性率以PEDV最高，達(dá)87.50%，其次為PCV2，達(dá)81.25%；雙重感染的場陽性率以PEDV+PCV2最高，達(dá)75.00%，其次為PCV2+PCV3，達(dá)50%；多重感染的場陽性率以PEDV+PCV2+PCV3最高，達(dá)68.75%。

表4 PCV、PEDV不同感染類型場的陽性率統(tǒng)計結(jié)果

3 討論

近年來，中國豬病流行出現(xiàn)了新的特點：傳統(tǒng)疫病時有發(fā)生，并出現(xiàn)新的遺傳變異和流行特點；新的疫病經(jīng)常暴發(fā)，并呈現(xiàn)迅速蔓延之勢；新發(fā)和再發(fā)傳染病的暴發(fā)和流行使養(yǎng)豬業(yè)面臨新的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。豬圓環(huán)病毒、豬流行性腹瀉病毒等傳統(tǒng)病原仍是當(dāng)前危害中國養(yǎng)豬業(yè)的主要病原，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失［15］。自2010年以來，由PEDV變異株所致仔豬腹瀉的發(fā)病率、死亡率可達(dá)100%，危害程度遠(yuǎn)高于PEDV經(jīng)典毒株［11］。2016年發(fā)現(xiàn)的豬圓環(huán)病毒3型、2019年發(fā)現(xiàn)的豬圓環(huán)病毒4型均被證實在中國豬群中廣泛存在和流行［3，5，7］。

豬圓環(huán)病毒是引起感染豬產(chǎn)生免疫抑制的主要疾病，豬只在感染后機體免疫功能下降，疫苗免疫失敗，從而并發(fā)或繼發(fā)感染其他病原微生物［1］。本研究發(fā)現(xiàn)，豬圓環(huán)病毒除可與豬流行性腹瀉病毒混合感染外，其3個基因型也常發(fā)生混合感染，且發(fā)生率較高，其中PCV2+PCV3的陽性率達(dá)1.54%，占雙重感染陽性樣品總數(shù)的21.74%；此陽性率雖然較前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)的PCV2+PCV3混合感染的陽性率19.38%［18］有所下降，但PCV2+PCV3混合感染的場陽性率達(dá)50.00%，說明其仍在湖北省內(nèi)的養(yǎng)殖場流行，應(yīng)注意加強防控。本次對650份組織樣品的檢測未發(fā)現(xiàn)PCV4的流行，究其原因，可能是湖北省尚未發(fā)生該病，亦可能是檢測的養(yǎng)殖場數(shù)量有限，未能采集到PCV4的感染組織。

PEDV是危害養(yǎng)豬業(yè)的主要病原之一。自2010年以來，由PEDV所引起的仔豬腹瀉給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的經(jīng)濟損失［13，21］。隨著PEDV變異株的流行，我國多地出現(xiàn)了PEDV混合感染的報道［16］。徐麗華等［19］對浙江省546份樣本的病原學(xué)檢測結(jié)果表明，PEDV的陽性率為71.25%，雙重混合感染以PEDV+PoRV為主；郭曉秋等［20］報道了豫南地區(qū)218個規(guī)模豬場仔豬腹瀉主要的病原體是PEDV（94.5%），其中混合感染非常普遍，以PEDV+PCV2混合感染為主的雙重感染最為嚴(yán)重。本研究發(fā)現(xiàn)湖北省內(nèi)PEDV的混合感染以PEDV+PCV2和PEDV+PCV2+PCV3為主，分別占雙重感染陽性樣品總數(shù)的50.00%和多重感染陽性樣品總數(shù)的48.15%，與郭曉秋等［20］的報道結(jié)果相似。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)PCV2陽性母豬所產(chǎn)仔豬在感染PEDV后，PEDV陽性細(xì)胞的數(shù)量顯著高于PCV2陰性母豬所產(chǎn)仔豬的，說明PCV2影響了PEDV的復(fù)制，在PCV2和PEDV之間可能發(fā)生了協(xié)同作用［22］，這可能是臨床上PEDV和PCV2混合感染病例較多的主要原因。

本次對湖北省內(nèi)650份組織樣品的檢測結(jié)果表明，湖北省PEDV病原單一感染的陽性率為6.46%，混合感染的陽性率為8.15%，均大大低于王顥然等［16］報道的湖北省PEDV單一感染陽性率70.37%和混合感染陽性率57.41%，這可能是因為在后非洲豬瘟?xí)r代規(guī)?；B(yǎng)殖場管理人員的生物安全意識增強，實施了更加科學(xué)合理的生物安全防控措施，使得各類疫病的發(fā)病率均有不同程度的降低。盡管如此，考慮到免疫壓力和PCV、PEDV在進(jìn)化過程中的遺傳多樣性，今后仍然需要加強對PCV、PEDV的防控。在針對非洲豬瘟、PEDV及PCV進(jìn)行預(yù)防的同時，還要注意其他病原與PEDV、PCV發(fā)生混合感染。平時應(yīng)加強對PEDV、PCV和其他病原體的檢測，針對養(yǎng)殖場的實際情況，制定科學(xué)合理的免疫程序，按時對豬舍進(jìn)行日常消毒，使豬群處于良好的生長環(huán)境，提高豬群的免疫力，減少各類病原的感染。