不同高山杜鵑品種耐熱性評價(jià)研究

李小玲，華智銳，張 飛，王學(xué)軍*

（1.商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000；2.陜西天士力植物藥業(yè)有限責(zé)任公司，陜西 商洛 726000）

近年來，由于人類活動產(chǎn)生的溫室氣體，導(dǎo)致全球溫度逐年上升。陜西省地處祖國西北內(nèi)陸的中緯度地區(qū)，橫跨溫帶、暖溫帶和亞熱帶氣候，具有明顯的大陸性季風(fēng)氣候。隨著溫室效應(yīng)的加重，陜西出現(xiàn)高溫天氣的時(shí)間越來越長，4~10月均會出現(xiàn)高溫天氣［1］。連續(xù)且頻繁出現(xiàn)的高溫天氣對于植物來說是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)，嚴(yán)重影響了植物的正常生長。在植物生長的各種脅迫中，植物的生理結(jié)構(gòu)受高溫脅迫的影響較大，植物的正常生長不僅受到影響，嚴(yán)重時(shí)還會致死［2］。

杜鵑花隸屬于杜鵑花科的杜鵑花屬（Rhododendron）植物，它與龍膽花、報(bào)春花并稱為世界三大常見的高山花卉，同時(shí)也被評為中國十大名花之一，有較高的觀賞價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值［3］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界上共有杜鵑270種，中國是杜鵑花的分布中心，有259種，主要分布在我國的高海拔地區(qū)［4］。杜鵑主要分布在海拔500~2500 m的山上灌木叢或松林，它喜歡涼爽、潮濕和通風(fēng)的半陰涼環(huán)境，生長的適宜溫度為12~25 ℃，夏季溫度超過35 ℃時(shí)，新梢、新葉生長緩慢，處于半休眠狀態(tài)［5］。因此，對秦嶺杜鵑進(jìn)行高溫脅迫的研究，從而篩選出耐高溫的品種，對抵御高溫對秦嶺杜鵑造成傷害尤為重要，有利于其耐熱性的鑒定，從而促進(jìn)其推廣應(yīng)用。

本試驗(yàn)研究以秀雅杜鵑和照山白杜鵑為研究對象，利用人工模擬氣候鑒定法，測定2種高山杜鵑不同高溫脅迫下的熱害指數(shù)及其各項(xiàng)生理生化指標(biāo)，通過比較不同品種間耐熱性的差異，從而最終篩選出耐熱性強(qiáng)的杜鵑品種，為秦嶺杜鵑的引種和選育培養(yǎng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

于2021年4月中旬在商洛市鎮(zhèn)安縣木王國家森林公園海拔1500 m左右茨溝杜鵑花景區(qū)采挖生長健壯、無病蟲害的秀雅杜鵑和照山白杜鵑幼苗?；|(zhì)購自思博礦產(chǎn)品加工廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料預(yù)培養(yǎng) 預(yù)培養(yǎng)：將采挖的照山白杜鵑幼苗和秀雅杜鵑幼苗移栽至外口徑30 cm、高20 cm的花盆中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)（栽培基質(zhì)為泥炭土∶蛭石=1∶1），將人工氣候箱（HPG-400HX）的培養(yǎng)溫度設(shè)置為20 ℃，光照級別設(shè)置為1級，濕度設(shè)置為80%［6］，光照時(shí)間設(shè)置為12 h/d培養(yǎng)3 d，期間每天澆250 mL水以保持土壤濕潤。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將預(yù)處理完成的試驗(yàn)材料放入人工氣候箱中模擬高溫條件開始脅迫處理，設(shè)置脅迫溫度為白天25 ℃/夜晚17 ℃（對照），白天30 ℃/夜晚22 ℃（輕度高溫脅迫）、白天35 ℃/夜晚27 ℃（中度高溫脅迫）、白天40 ℃/夜晚32 ℃（重度高溫脅迫）4個(gè)溫度梯度處理，調(diào)配人工氣候箱（HPG-400HX空氣相對濕度為80%，光照級別為1級，光照時(shí)間設(shè)置為12 h/d，期間每天澆250~500 mL水以保持土壤濕潤，避免由于缺水導(dǎo)致水分脅迫影響數(shù)據(jù)的真實(shí)性，脅迫5 d后隨即采集當(dāng)年生功能葉片（成熟葉）去掉中脈，其中一部分用于丙二醛（MDA）和脯氨酸（Pro）含量的測定，另一部分用于保護(hù)酶SOD、CAT和POD活性或含量的測定。

1.2.3 生理指標(biāo)的測定 MDA含量的測定參照張樂華等［7］的硫代巴比妥酸法；Pro含量的測定采用茚三酮法，參照王凱紅等［8］的方法；SOD活性的測定采用四氮唑藍(lán)（NBT）法，參照李合生［9］的方法；POD活性的測定采用分光光度計(jì)法，參照Wu等［10］的方法，以1 min吸光度（A）的變化值表示酶活力的大小，即以每分鐘OD470值變化0.01為1個(gè)酶活力單位；CAT活性的測定采用紫外分光光度法［11］，以1 min吸光度值（A）減小0.1定義為1個(gè)酶活力單位（U）。

1.2.4 熱害指數(shù)的計(jì)算 熱害指數(shù)的計(jì)算：高溫脅迫期間，每隔5 d定時(shí)對其全部植株生長狀況進(jìn)行觀察，同時(shí)對其高溫脅迫的熱害程度情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和記錄；根據(jù)高溫脅迫對植物的傷害嚴(yán)重程度，可劃分為5個(gè)級別，其中0級無熱傷害癥狀；1級指1~2片葉子受到熱傷害，即葉片開始變黃枯萎；2級指2~4片葉子變黃，1片葉子枯死；3級指2片葉子枯死；4級指2片葉子以上枯死；5級指整個(gè)植株枯死［12］。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析 所有數(shù)據(jù)測定重復(fù)3次，取其3次的平均值。用Excel 2010軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用SPSS 18.0軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫對不同杜鵑品種熱害指數(shù)的影響

由圖1得知，3個(gè)溫度脅迫過程中，25 ℃條件下植株生長正常，形態(tài)沒有發(fā)生變化；30 ℃條件下處理5 d后，秀雅杜鵑和照山白杜鵑的熱害指數(shù)分別為0.167、0.333，其中秀雅杜鵑僅1株的形態(tài)未表現(xiàn)出明顯變化，而照山白杜鵑已經(jīng)出現(xiàn)葉片枯死現(xiàn)象。35 ℃條件處理5 d后，秀雅杜鵑熱害指數(shù)為0.333，表現(xiàn)為植株葉片反卷、下垂，葉子變黃；照山白杜鵑熱害指數(shù)為0.389，表現(xiàn)為枯死現(xiàn)象加重，老葉褐化。而40 ℃條件下處理5 d后，照山白熱害指數(shù)達(dá)到0.445，表現(xiàn)為葉片嚴(yán)重反卷、下垂，老葉脫落、新葉葉緣、葉尖出現(xiàn)黃色壞死斑。

圖1 高溫脅迫對不同杜鵑熱害指數(shù)的影響

2.2 高溫脅迫對不同杜鵑品種相關(guān)生理生化指標(biāo)的影響

2.2.1 高溫脅迫對不同杜鵑MDA含量的影響 膜脂過氧化作用的產(chǎn)物MDA會對細(xì)胞膜起到毒害作用，其含量的高低可作為植物遭受傷害的重要指標(biāo)［13］。由圖2可得出，高溫脅迫條件下秀雅杜鵑和照山白杜鵑的MDA含量呈先上升后下降趨勢。由此可知，與對照相比，秀雅杜鵑在30 ℃和35 ℃處理下，葉片中MDA含量僅上升2%，沒有表現(xiàn)出顯著性差異（P>0.05），40 ℃處理下，其葉片中MDA含量較對照顯著下降42%（P<0.05）。照山白杜鵑在30 ℃處理下，葉片中的MDA含量無顯著差異；在35 ℃處理下，葉片中的MDA含量達(dá)到峰值，其含量較對照顯著上升了31%（P<0.05）；在40 ℃處理下，其葉片含量急劇下降了52%（P<0.05）。以上結(jié)果說明，在高溫脅迫下，照山白杜鵑葉片中的MDA含量的影響大于秀雅杜鵑，且在35~40 ℃高溫脅迫下，2種杜鵑葉片的細(xì)胞膜均受損，導(dǎo)致MDA含量的大量積累，植株受到傷害。

圖2 高溫脅迫對不同杜鵑MDA含量的影響

2.2.2 高溫脅迫對不同杜鵑Pro含量的影響 由圖3可知，2種杜鵑葉片中的Pro含量均隨溫度升高呈先升后降的變化趨勢。隨著高溫脅迫的加重，Pro含量表現(xiàn)出明顯的差異性。30 ℃處理?xiàng)l件下，秀雅杜鵑葉片的Pro含量顯著上升（P<0.05），比對照增加了30%；35 ℃處理?xiàng)l件下，其葉片中的Pro已經(jīng)出現(xiàn)下降趨勢，僅比對照增加了7%；40 ℃處理?xiàng)l件下，秀雅杜鵑葉片的Pro含量達(dá)到最低（P<0.05），與對照相比顯著降低了16%；30 ℃處理?xiàng)l件下，照山白杜鵑葉片中的Pro含量較對照增加了8%，35 ℃處理后，照山白杜鵑葉片的Pro含量達(dá)到最高（P<0.05），與25 ℃對照相比增加了39%；40 ℃處理?xiàng)l件下，照山白杜鵑葉片的Pro含量達(dá)到最低（P<0.05），與25 ℃對照相比，顯著降低了11%。由此可知，Pro含量對高溫脅迫的損傷有積極反應(yīng)，并能主動清除自由基，避免細(xì)胞損傷。

圖3 高溫脅迫對不同杜鵑Pro含量的影響

2.2.3 高溫脅迫對不同杜鵑抗氧化酶活性的影響 由圖4、圖5、圖6可知，2種杜鵑葉片中的POD、CAT、SOD活性均隨溫度升高呈先升后降的變化趨勢，且變化顯著（P<0.05）。在40 ℃高溫脅迫下，2種杜鵑POD活性均表現(xiàn)出明顯的差異性（P<0.05）。在30 ℃和35 ℃處理?xiàng)l件下，秀雅杜鵑葉片的POD活性均沒有表現(xiàn)出明顯的差異（P>0.05），與對照相比，秀雅杜鵑葉片中POD活性分別增加了2%、1%；40 ℃處理?xiàng)l件下，其葉片的POD活性達(dá)到最低（P<0.05），與對照相比顯著降低了68%；照山白杜鵑在30 ℃處理后，2組間無顯著差異（P>0.05），35 ℃處理后，其葉片的POD活性表現(xiàn)出明顯的差異（P<0.05），與對照相比降低了37%；40 ℃處理?xiàng)l件下，其葉片的POD活性達(dá)到最低（P<0.05），與對照相比顯著降低了44%。

杜鵑葉片的CAT活性變化見圖5，秀雅杜鵑和照山白杜鵑分別在35 ℃、30 ℃時(shí)酶活性達(dá)到頂峰，其活性分別為：7.40，4.27 U/（g·min），較對照分別增加了33%、23%，其中秀雅杜鵑CAT活性增加顯著（P<0.05），而照山白杜鵑增加不顯著（P>0.05）。脅迫40 ℃時(shí)，其活性分別為4.90、1.87 U/（g·min），分別比對照下降了12%、29%，2種杜鵑葉片中CAT活性表現(xiàn)出顯著差異（P<0.05）。25 ℃處理?xiàng)l件下，2種杜鵑葉片中SOD活性分別是42、50 U/（g·min）。經(jīng)30 ℃高溫脅迫后，其葉片中的SOD活性表現(xiàn)出顯著差異（P<0.05），與對照相比分別顯著增加了47%、19%（P<0.05）。經(jīng)35 ℃高溫脅迫后，其活性與對照相比顯著降低了70%、73%（P<0.05）。說明高溫脅迫已經(jīng)超過了其自身承受能力，并對葉片的抗氧化防御系統(tǒng)造成了破壞。

圖4 高溫脅迫對不同杜鵑POD活性的影響

圖5 高溫脅迫對不同杜鵑CAT活性的影響

圖6 高溫脅迫對不同杜鵑SOD活性的影響

3 討論與結(jié)論

3.1 高溫脅迫對杜鵑熱害指數(shù)的影響

在逆境環(huán)境下，植物受傷害強(qiáng)弱最直接的表現(xiàn)是植物外觀形態(tài)的變化，它能將植物在各種逆境環(huán)境下的生長狀況直觀地表現(xiàn)出來［14］。杜鵑花屬植物大多生長在涼爽而潮濕的山地環(huán)境，這些地區(qū)全年最高氣溫不超過28 ℃，而位于海拔1500~3000 m的秀雅杜鵑和照山白杜鵑也不例外，它們喜歡涼爽、潮濕、通風(fēng)和半陰的環(huán)境［15］。

在本試驗(yàn)中，2種杜鵑在30 ℃（輕度高溫脅迫）、35 ℃（中度高溫脅迫）和40 ℃（重度高溫脅迫）處理后均受到了傷害，這符合了杜鵑的高溫適應(yīng)性較差。根據(jù)2種杜鵑生長的形態(tài)指標(biāo)可得出，25 ℃左右是杜鵑生長的最適溫度，這與趙冰等［16］的研究結(jié)果一致；30 ℃會對植物造成輕微傷害，35 ℃和40 ℃高溫處理則會對植株造成嚴(yán)重傷害，這與鄭宇等［14］對杜鵑的研究結(jié)果一致。

3.2 高溫脅迫對高山杜鵑耐熱生理生化指標(biāo)的影響

植物細(xì)胞與外界環(huán)境之間的媒介是細(xì)胞膜。當(dāng)發(fā)現(xiàn)外界自然環(huán)境對此類植物有害時(shí)，首先危害出現(xiàn)在植物膜生態(tài)系統(tǒng)中，其膜脂過氧化作用為主要危害。膜脂過氧化作用的最終產(chǎn)物是MDA，因此植物在高溫脅迫的環(huán)境中，其葉片中的MDA濃度可有效反映細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的程度［17-18］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，30 ℃條件下，2種杜鵑葉片MDA含量較對照均沒有顯著差異；35 ℃處理后2種杜鵑葉片中的MDA含量均達(dá)到最高，且照山白杜鵑MDA含量顯著上升（P<0.05），而秀雅杜鵑沒有表現(xiàn)出顯著差異；40 ℃處理后，2種杜鵑葉片中的MDA含量均降至最低且表現(xiàn)出明顯差異（P<0.05），且照山白杜鵑MDA含量降低幅度大于秀雅杜鵑，這與潘向東等［17］的結(jié)果一致。在此次試驗(yàn)中，秀雅杜鵑和照山白杜鵑葉片中的Pro含量均隨溫度脅迫的加重而表現(xiàn)出先升后降的趨勢，秀雅杜鵑在30 ℃脅迫下Pro含量達(dá)到頂峰，且表現(xiàn)出顯著差異（P<0.05），照山白杜鵑在35 ℃脅迫下Pro含量達(dá)到頂峰，且表現(xiàn)出顯著差異（P<0.05），但在40 ℃處理下2種杜鵑Pro含量均顯著降低（P<0.05）。而周廣等［18］的研究發(fā)現(xiàn)，Pro含量隨脅迫溫度的上升而呈上升趨勢，這種現(xiàn)象可能是由于本試驗(yàn)的處理方法、處理時(shí)間和脅迫溫度的不同所造成的，也可能與不同杜鵑品種對高溫應(yīng)激反應(yīng)的不同有關(guān)。具體原因有待進(jìn)一步試驗(yàn)調(diào)查。

POD、CAT、SOD等都是植物體內(nèi)清除活性氧的重要保護(hù)酶。大量研究表明，在植物遭受高溫脅迫后，隨著體內(nèi)活性氧的增加其保護(hù)酶的活性也表現(xiàn)出增加的變化趨勢，植物的耐熱性與其活性密切相關(guān)［19］。本試驗(yàn)表明，2種杜鵑在高溫脅迫后，其葉片中的POD活性均表現(xiàn)出先升后降的趨勢，與其他保護(hù)酶相比，POD酶活性的增幅較小。在30 ℃、35 ℃處理下秀雅杜鵑葉片中POD活性僅比對照增加了2%、1%，沒有表現(xiàn)出顯著差異。但在40 ℃處理下，其活性急劇下降為對照的68%（P<0.05）；照山白杜鵑在30 ℃脅迫下，其葉片中POD活性增加了15%，但在35 ℃脅迫下，其葉片中POD活性已經(jīng)出現(xiàn)下降趨勢，且較對照顯著降低（P<0.05）；在40 ℃處理下，其葉片中的POD活性降至最低，較對照顯著降低了44%，這與王宏輝等［20］的結(jié)果一致。在本試驗(yàn)中，30 ℃處理下，2種杜鵑葉片中SOD活性顯著上升（P<0.05），與對照分別增加了47%、19%，但在40 ℃處理下其含量分別顯著下降了77%、79%，這與揚(yáng)華等［21］的結(jié)果一致。試驗(yàn)結(jié)果表明，在35 ℃處理下，2種杜鵑葉片中的CAT活性表現(xiàn)出顯著差異，秀雅杜鵑CAT活性顯著增加，而照山白杜鵑較對照顯著下降。2種杜鵑葉片的CAT、SOD酶活性均隨著脅迫溫度的升高而顯著增加，且在30 ℃輕度脅迫時(shí)較照山白杜鵑SOD活性而言，秀雅杜鵑活性增幅較大；在35 ℃中度脅迫后秀雅杜鵑CAT酶活性仍然處于上升階段且達(dá)到峰值，但照山白杜鵑其活性卻較對照顯著降低。秀雅杜鵑在30 ℃輕度脅迫下SOD酶活性，在35 ℃中度脅迫條件下其POD、CAT酶活性均顯著大于照山白杜鵑，這更加證實(shí)了和照山白杜鵑相比秀雅杜鵑具有較強(qiáng)的耐熱性且在高溫脅迫下保護(hù)酶活性較高，從而有利于植株減輕或抵抗高溫脅迫所造成的傷害，也符合秀雅杜鵑種植范圍大于照山白杜鵑的事實(shí)。

綜上所述，杜鵑花在遭受高溫脅迫后，葉片的相關(guān)生理生化指標(biāo)會發(fā)生一定的變化，其變化趨勢與耐熱性密切相關(guān)。秀雅杜鵑具有較強(qiáng)的耐熱性，其保護(hù)酶活性在高溫脅迫下普遍較高，且SOD活性增幅較大，對高溫脅迫所造成的傷害起到較高的保護(hù)作用；照山白杜鵑耐熱性較弱，其保護(hù)酶活性在高溫脅迫下相對較低，對高溫脅迫所造成的傷害保護(hù)作用較低。