利用GS9粒型基因分子標(biāo)記改良水稻粒型的效應(yīng)研究

陳 春，郭新亞，王 磊，陳衛(wèi)軍

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 宿遷農(nóng)科所，江蘇 宿遷 223700）

0 引言

水稻（Oryza sativa L.）是世界上最重要的糧食作物之一，對保障糧食安全起到至關(guān)重要的作用。我國的水稻育種經(jīng)過水稻矮化育種、雜交水稻育種、超級稻育種3次綠色革命，水稻的單產(chǎn)已達(dá)到6892.5 kg/hm2的水平［1］。江蘇作為南方的水稻主產(chǎn)區(qū)，品種類型豐富，秈、粳稻亞種并存，每年粳稻的種植面積近200萬hm2，秈稻的種植面積在30萬hm2左右［2］。在過去的相當(dāng)長一段時(shí)間內(nèi)，我國的水稻育種以追求高產(chǎn)為主要方向，忽視了稻米品質(zhì)改良和抗性水平的提升。與國外相比，我國的稻米品質(zhì)研究起步較晚，大體上可以分為以下3個(gè)主要階段：第一階段是改革開放以前，國外已經(jīng)開展稻米品質(zhì)性狀的遺傳規(guī)律和遺傳效應(yīng)研究，同期內(nèi)我國對稻米品質(zhì)的研究還停留在簡單的外觀檢測方面，系統(tǒng)的遺傳學(xué)研究［3］還未起步；第二階段是改革開放之后到20世紀(jì)末，以稻米品質(zhì)性狀的經(jīng)典遺傳學(xué)研究為主要研究方向，初步明確了一些品質(zhì)性狀如粒型、堊白、直鏈淀粉含量等的遺傳規(guī)律，但是基因克隆與功能等方面［4-5］的研究還未開展；第三階段是進(jìn)入21世紀(jì)以來，稻米品質(zhì)性狀相關(guān)的分子遺傳研究進(jìn)入了快速發(fā)展階段［6］。在2001～2010年間，主要利用分子標(biāo)記對品質(zhì)性狀進(jìn)行遺傳連鎖、關(guān)聯(lián)分析和相關(guān)數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTLs）的定位分析研究［7-9］；從2010年至今，稻米品質(zhì)性狀相關(guān)的重要基因陸續(xù)被定位和克隆，同時(shí)功能基因的分子標(biāo)記輔助選擇和基因編輯技術(shù)被用于水稻育種研究，一批具有優(yōu)良性狀或者特殊功能的水稻新品種被選育出來，稻米品質(zhì)的遺傳改良研究進(jìn)入了快速發(fā)展階段［10］。稻米的品質(zhì)性狀直接決定水稻的商品性。稻米加工企業(yè)需要出米率高的（加工品質(zhì)）品種；優(yōu)質(zhì)的外觀品質(zhì)往往使稻米具備較高的商品附加值；好吃又健康（具有較高的營養(yǎng)品質(zhì)和蒸煮食味品質(zhì)）的稻米更受消費(fèi)者青睞。與東北粳稻相比，江蘇的粳稻具有豐產(chǎn)性好、單產(chǎn)水平高的優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)也存在稻米品質(zhì)一般、食味性較差的劣勢，其中外觀品質(zhì)是造成江蘇地區(qū)稻米品質(zhì)一般的主要原因，主要表現(xiàn)為堊白度、堊白粒率較高。隨著大眾生活水平和消費(fèi)水平的不斷提升，稻米消費(fèi)已由單純的“吃飽”轉(zhuǎn)變?yōu)椤俺院谩保藗儗?yōu)質(zhì)稻米的需求越來越多［11］。外觀品質(zhì)和食味品質(zhì)是衡量優(yōu)質(zhì)稻米的重要指標(biāo)。外觀品質(zhì)主要包含粒型、透明度、堊白度等指標(biāo)；食味品質(zhì)常常與直鏈淀粉含量、膠稠度、蛋白質(zhì)含量、糊化溫度等因素相關(guān)。粒型與堊白是稻米外觀品質(zhì)的重要構(gòu)成要素，其中粒型主要指籽粒的長度、寬度、長寬比等，直接決定了稻米的碾磨品質(zhì)和稻米消費(fèi)的商品性，同時(shí)該性狀的遺傳主要由核基因控制；堊白是指稻米胚乳中白色不透明部分，其遺傳調(diào)控較為復(fù)雜，受遺傳和環(huán)境等因素共同影響。一般認(rèn)為，少堊白或無堊白以及長粒型稻米的商品價(jià)值高［12］。

引入粒型調(diào)控基因，采取分子標(biāo)記輔助選擇，定向改良籽粒的粒型，是一種行之有效的育種手段。近年來與水稻粒型相關(guān)的功能基因的克隆與遺傳研究迅速開展，一批具有重要功能性狀的基因被發(fā)現(xiàn)和利用，如GS3、GW2、GW5、GS5、AGG3和qGL3等［13］。這些粒型調(diào)控主效基因在粒長、粒寬、粒厚等方面控制籽粒形狀。例如：GS3粒型調(diào)控基因，其突變體導(dǎo)致G蛋白的γ亞基功能的缺失，促進(jìn)細(xì)胞伸長，進(jìn)而產(chǎn)生長粒性狀［14］；GW2通過將其底物錨定在蛋白酶體進(jìn)行降解，負(fù)調(diào)控細(xì)胞分裂，該基因的突變使得本應(yīng)降解的底物不能被特異性識(shí)別，從而促使穎花外殼細(xì)胞分裂，增加穎花外殼寬度，因而胚乳變大，最終粒寬增加，粒重和產(chǎn)量水平相應(yīng)提高［15］。Zhao等［16］利用圖位克隆在水稻第9染色體上精細(xì)定位到控制粒長的新基因GS9。過表達(dá)GS9導(dǎo)致形成圓形籽粒，該基因的功能缺失突變體gs9籽粒細(xì)長，但不影響植株的生長發(fā)育、粒重及最后產(chǎn)量；這種粒型可以顯著減少堊白的產(chǎn)生，從而減少米粒堊白。GS9編碼1種沒有已知保守功能域的蛋白質(zhì)，它通過改變細(xì)胞分裂來調(diào)節(jié)籽粒形狀。GS9和卵形家族蛋白OsOFP14、OsOFP8之間的相互作用受OsGSK2激酶（1種油菜素類固醇信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子）的調(diào)節(jié)。遺傳互補(bǔ)分析結(jié)果表明，GS9的功能獨(dú)立于其他已知籽粒粒型調(diào)控基因，例如：GW5和GS3是2個(gè)已經(jīng)報(bào)道的可以控制水稻粒型的基因，為了分析它們與GS9之間的調(diào)控關(guān)系，將NIL-gs9分別和GW5、GS3的NIL雜交，后代在一定程度上表現(xiàn)出更為細(xì)長的粒型，表明GS9、GW5和GS3對粒型的調(diào)控具有加性效應(yīng)，但對其他粒型調(diào)控基因沒有影響，表明GS9是獨(dú)立于其他粒型決定基因、新發(fā)現(xiàn)的1種粒型調(diào)控基因。

泗稻17號(hào)是由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院宿遷農(nóng)科所新育成的水稻品種，于2019年通過了江蘇省審定（審定編號(hào)：蘇審稻20190011）。該品種產(chǎn)量水平高,穩(wěn)產(chǎn)性較好，生育期適中，綜合抗性強(qiáng)，抗倒伏能力好，熟期轉(zhuǎn)色快。目前，泗稻17號(hào)已被大面積示范推廣，但是由于該品種的外觀品質(zhì)一般，不能滿足目前江蘇稻米消費(fèi)市場對優(yōu)質(zhì)、高端大米的需求，勢必會(huì)制約該品種長久的推廣應(yīng)用。本研究利用日本晴背景的NIL-gs9作為供體親本，以泗稻17號(hào)作為受體和輪回親本，利用分子標(biāo)記輔助選擇的方法，將粒型調(diào)控基因GS9定向轉(zhuǎn)入泗稻17號(hào)中，以期實(shí)現(xiàn)粒型的快速遺傳改良，提高泗稻17號(hào)的外觀品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

日本晴（NIL-gs9），屬中長粒型，作為供體親本。泗稻17號(hào)，屬橢圓粒型，作為受體親本和輪回親本。將這2個(gè)親本材料雜交配組，標(biāo)記檢測GS9/gs9單株，并將其與泗稻17號(hào)回交。對每個(gè)回交世代進(jìn)行分子標(biāo)記檢測，篩選含有GS9/gs9的雜合基因型群體，并與輪回親本回交3次。通過農(nóng)藝性狀調(diào)查，選擇主要農(nóng)藝性狀與泗稻17號(hào)類似的后代材料，進(jìn)行1次自交，獲得BC3F2分離群體。

1.2 單株選擇和粒型考察

于2018～2020年在海南三亞南繁基地和江蘇泗陽育種基地進(jìn)行大田種植。改良材料采取單苗栽插，單穗收獲；利用圖像分析系統(tǒng)，檢測籽粒的長度、寬度、長寬比等。在田間篩選主要農(nóng)藝性狀優(yōu)于或接近泗稻17號(hào)的改良材料，主要考察生育期、株高、每穗總粒數(shù)、每穗實(shí)粒數(shù)、千粒重、結(jié)實(shí)率、稻瘟病抗性等指標(biāo)。本研究篩選到3株中長粒型、植株健壯、生育期適中、豐產(chǎn)性較好的改良后代，并以此為研究對象分析改良效果。

1.3 分子標(biāo)記鑒定

采集幼嫩的水稻葉片，采取CTAB法［5］提取DNA，利用合成的Indel標(biāo)記IN0919對親本材料進(jìn)行多態(tài)性檢測和后代材料的目標(biāo)基因篩選。IN0919標(biāo)記序列為IN0919-F（5′-CGTTTAGGCTGGCTGC-3′）和IN0919-R（5′-CAGTTGGTGGTTT CGTAGAG-3′）。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，共循環(huán)33次；最后在72 ℃下再延伸5 min。在PCR擴(kuò)增完畢后，吸取20 μL PCR產(chǎn)物，點(diǎn)樣于3%的瓊脂糖凝膠，置于裝有1×TAE電泳緩沖液的電泳槽中，在100 V穩(wěn)壓下電泳1 h左右，最后在凝膠掃描成像系統(tǒng)下記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本和后代群體間的標(biāo)記多態(tài)性和檢測效果

利用GS9基因的功能性標(biāo)記對供體親本、受體親本進(jìn)行多態(tài)性檢測，結(jié)果（圖1）顯示：IN0919在供體親本和受體親本間存在明顯的多態(tài)性；在雜交的后代群體中，IN0919的擴(kuò)增片段呈現(xiàn)出3種帶型，即1號(hào)供體親本帶型（A）、2號(hào)受體親本帶型（C）和3號(hào)雜合帶型（B），表明利用IN0919功能標(biāo)記能夠有效地篩選符合目標(biāo)性狀的后代材料。

圖1 標(biāo)記IN0919在受體與供體親本間的多態(tài)性

2.2 選育的主要過程和功能標(biāo)記輔助選擇

于2018年夏季在宿遷正季以泗稻17號(hào)為母本，與含有g(shù)s9基因的日本晴進(jìn)行雜交配組；同年冬天在海南開展南繁加代；從F1代開始以泗稻17號(hào)為輪回親本，進(jìn)行連續(xù)回交3次。對每一個(gè)世代材料開展主要農(nóng)藝性狀的鑒定和篩選，選擇劍葉挺舉、株高適中（90～100 cm）、生育期適中（145～150 d）、稻瘟病抗性水平較高（達(dá)5級以上）、抗倒伏能力強(qiáng)的后代材料。對符合育種目標(biāo)的后代材料，利用功能標(biāo)記開展基因型鑒定。在3次回交之后，得到了 BC3F1代材料；篩選主要農(nóng)藝性狀與泗稻17號(hào)相近、含有粒型調(diào)控基因gs9、中長粒型的后代材料，并進(jìn)行1次自交；在BC3F2代分離群體中進(jìn)行農(nóng)藝性狀的篩選和標(biāo)記檢測，選擇中長粒型、主要農(nóng)藝性狀良好的單株18株（圖2）。

圖2 選育系譜圖

2.3 F2群體的粒長分離情況

分析NIL-gs9與泗稻17號(hào)的F2代分離群體中單株的粒長、粒寬。短粒單株數(shù)量與長粒單株數(shù)量分別為317和112株，短粒與長粒的比例為2.83∶1，經(jīng)卡方檢測，符合1對基因3∶1的理論分離比。分析分離群體的粒寬變化，粒寬的變化范圍為2.3～2.6 mm，無明顯規(guī)律。表明在回交群體背景下GS9能夠表現(xiàn)出單個(gè)主效基因的效應(yīng)，有效地提高后代材料的粒長，但對粒寬無明顯的改良效應(yīng)。

2.4 粒型基因的改良效應(yīng)

在泗稻17號(hào)和NIL-gs9的后代分離群體中（圖3），篩選出1個(gè)符合育種預(yù)期目標(biāo)且為中長粒型的優(yōu)良單株SC104。將SC104的籽粒脫粒后隨機(jī)抽取100粒種子，統(tǒng)計(jì)粒長、粒寬和長寬比，其粒長的變化范圍為5.45～5.78 mm，平均值為5.61 mm，與輪回親本泗稻17號(hào)（平均粒長5.10 mm）相比平均增長了0.51 mm，增長幅度較大；粒寬的變化范圍為2.76～2.84 mm，平均值為2.78 mm，與輪回親本（平均粒寬2.81 mm）相比無顯著變化；籽粒長寬比的變化范圍為1.94～2.10，平均值為2.01，與輪回親本泗稻17號(hào)的長寬比（1.80）相比，變化顯著，增加幅度很大（圖4）。上述結(jié)果表明：水稻粒型功能基因GS9能夠有效地延長稻米粒長，保持粒寬基本不變，顯著提高籽粒的長寬比，達(dá)到改良稻米粒型的目的。

圖3 標(biāo)記對BC3F2群體部分單株的基因型檢測結(jié)果

圖4 親本和改良單株的水稻粒型對比

3 小結(jié)與討論

江蘇省作為南方地區(qū)最大的粳稻種植區(qū)，從2000年開始，在品種選育和新品種審定過程中重視稻米品質(zhì)改良，目前對外觀品質(zhì)未達(dá)到國標(biāo)3級優(yōu)質(zhì)稻谷標(biāo)準(zhǔn)的品種不予以審定，這有力地促進(jìn)了江蘇粳稻品質(zhì)性狀的改良和提升，選育了一批稻米品質(zhì)達(dá)1級的優(yōu)質(zhì)稻谷品種。同時(shí)在食味品質(zhì)研究方面更是形成了江蘇特色，以“南粳”系列為代表的半糯性品種，以其獨(dú)特的“香、糯、軟、彈”特性，多次在全國優(yōu)良食味品評中獲獎(jiǎng)；宿遷農(nóng)科所選育的“泗稻301”在2019年全國優(yōu)良食味品評中斬獲第1名。但是由于水稻的品質(zhì)是由多種性狀組成的綜合性狀，與環(huán)境存在較為復(fù)雜的互作關(guān)系，這也導(dǎo)致在稻米性狀的改良過程中難以兼顧所有品質(zhì)性狀。例如南粳9108［17］具有優(yōu)良的食味品質(zhì)，但是其暗胚乳影響稻米的外觀。同時(shí)江蘇水稻在灌漿結(jié)實(shí)期常常遭遇高溫天氣，這也會(huì)導(dǎo)致稻米的堊白粒率和堊白度的增加，從而影響外觀品質(zhì)。一般認(rèn)為稻米的堊白與粒型密切相關(guān)，細(xì)長籽粒的堊白度和堊白粒率較低。借助分子標(biāo)記輔助選擇的手段，定向改良籽粒的粒型，增加粒長，能夠選育出具有優(yōu)良外觀品質(zhì)的水稻新品種。例如：方珊茹等［18］利用連鎖標(biāo)記進(jìn)行回交導(dǎo)入和農(nóng)藝性狀選擇，將GS3長粒等位基因及其他外觀品質(zhì)性狀基因注入目標(biāo)親本，獲得了粒長、長寬比和粒重均得到改良的株系。張劍霞［19］利用SF28標(biāo)記將GS3長粒等位基因和Xa23聚合到珍汕97和II-32B中，獲得了粒長性狀得到改良的株系。因此，通過借助分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)定向?qū)肓Ｐ驼{(diào)控基因，從而改變籽粒粒型，提高外觀品質(zhì)，是迅速改良品質(zhì)的行之有效的方法。

GS9是最新被克隆的控制水稻粒型的主效QTL，具有延長粒長、改良品質(zhì)、提高粒重的功能。通過分子標(biāo)記輔助選擇和常規(guī)育種相結(jié)合的方式，將GS9定向?qū)肽繕?biāo)親本，可顯著提高籽粒的粒長和長寬比，從而改良稻米的外觀品質(zhì)，因此該基因極具應(yīng)用價(jià)值。本研究利用最新克隆的粒型主效基因GS9，采用IN0919標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，對水稻粒型進(jìn)行了定向改良，延長了粒長，顯著增加了籽粒的長寬比，改良單株的粒型為中長粒型，長寬比約為2.0，與常規(guī)粳稻籽粒的長寬比（約為1.8）比較，改良效果顯著。但是由于GS3供體親本材料日本晴（NIL-gs9）的劍葉細(xì)長披散，穗型松散，因此，后代材料在株型、劍葉夾角、穗型等農(nóng)藝性狀方面與目前主流的選育目標(biāo)差異較為顯著。擬在后續(xù)的改良過程中適當(dāng)降低株高，提高籽粒的結(jié)實(shí)率，篩選株型更為緊湊的后代材料，以期能夠?qū)崿F(xiàn)生產(chǎn)應(yīng)用的目的。

4 展望

種子是農(nóng)業(yè)的“芯片”，育種水平和技術(shù)的迅速提升，以及特異性種質(zhì)資源的發(fā)掘與利用，為我國種質(zhì)持續(xù)創(chuàng)新提供了有力保障，也為我國的糧食安全和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供了重要保障。伴隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，一大批具有重要功能性狀的基因被發(fā)掘和利用，稻米品質(zhì)性狀的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)也日趨清晰。目前分子標(biāo)記輔助選擇與常規(guī)育種相結(jié)合的方法已成為江蘇水稻育種界采取的主要方法。但是常常是針對某一性狀開展定向改良，而水稻的一些性狀往往屬于綜合性狀，對單一基因的改良往往達(dá)不到預(yù)期目標(biāo)。因此，未來應(yīng)在綜合豐富的優(yōu)勢基因遺傳效應(yīng)的基礎(chǔ)上，開展分子設(shè)計(jì)育種，對稻米的品質(zhì)性狀進(jìn)行精準(zhǔn)改良，從而實(shí)現(xiàn)外觀品質(zhì)和食味品質(zhì)的同步提升。