基于RNA-seq篩選NSUN2調(diào)控的A549細(xì)胞差異表達(dá)基因

雷靜靜， 馮 光， 唐鋮鋮， 路宏朝

(陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 漢中 723000)

NSUN2(NOP2/Sun RNA methyltransferase family member)屬于NOL1/NOP2/sun家族蛋白，其編碼的蛋白是一種m5c RNA甲基轉(zhuǎn)移酶，主要負(fù)責(zé)tRNA和mRNA的甲基化修飾[1]。NSUN2可以對(duì)多種RNA的各種甲基化位點(diǎn)進(jìn)行甲基化，以產(chǎn)生多種細(xì)胞生理調(diào)控功能。研究證實(shí)，m5C的甲基化水平與血管發(fā)育畸形、血管瘤發(fā)生存在相關(guān)性。如多種m5C甲基化在內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育、血管鈣化、腹主動(dòng)脈瘤發(fā)生過程中扮演重要角色[2]。NSUN2已被證明可使原癌基因SHC在轉(zhuǎn)錄水平甲基化，并在氧化或高葡萄糖應(yīng)激條件下使SHC翻譯水平增強(qiáng)，加速人血管內(nèi)皮細(xì)胞的衰老[3]。NSUN2對(duì)細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)的mRNA進(jìn)行甲基化修飾，促進(jìn)該黏附分子的翻譯水平升高，并導(dǎo)致白細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附性增加，從而加大白血病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[4]。此外，NSUN2的異常表達(dá)與大量腫瘤疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)[5]。Yuan等發(fā)現(xiàn)NSUN2參與蛋白酶激活受體2(Grb2)介導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞遷移過程。Grb2相關(guān)結(jié)合蛋白作為miR-125b的靶向調(diào)控基因是一種典型的促腫瘤細(xì)胞遷移蛋白，在結(jié)直腸癌中NSUN2的高表達(dá)抑制miR-125b從而促進(jìn)Grb2相關(guān)結(jié)合蛋白的表達(dá)，引起癌細(xì)胞的遷移速率增強(qiáng)[5-7]。在乳腺癌細(xì)胞中DNA的低甲基化水平與NSUN2過表達(dá)也相關(guān)，NSUN2過表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，而NSUN2敲除則抑制該過程[8]。NSUN2基因的敲除導(dǎo)致RNA生物合成過程一定程度受阻，且影響生物體正常的轉(zhuǎn)錄后修飾途徑。分析發(fā)現(xiàn)，NSUN2與大多數(shù)腦細(xì)胞的發(fā)育及能量代謝的維持有關(guān)，該基因的敲除將導(dǎo)致新生個(gè)體腦組織發(fā)育不全或智力受損[9]。NSUN2還具有可以直接甲基化CDK1(cyclin-dependent kinase 1)的mRNA調(diào)控其蛋白表達(dá)，影響細(xì)胞周期，進(jìn)而對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用[10]。Wang等[11]研究發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)和體外水平，NSUN2可甲基化修飾P27基因mRNA的5’UTR，從而抑制P27基因的翻譯；但是對(duì)mRNA的3’UTR的甲基化則會(huì)起到促進(jìn)P27基因的翻譯過程。因此，深入探究NSUN2生物學(xué)功能，以及在不同腫瘤疾病的作用機(jī)制可為尋找新的腫瘤治療靶點(diǎn)提供有力依據(jù)。

本研究通過構(gòu)建慢病毒干擾的NSUN2載體，轉(zhuǎn)染到非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞，篩選獲得NSUN2敲低的細(xì)胞株，采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的方法對(duì)干擾細(xì)胞株基因表達(dá)譜進(jìn)行分析，篩選差異表達(dá)基因。對(duì)差異表達(dá)基因的功能和參與的相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行富集分析，篩選出可能受NSUN2調(diào)控的潛在關(guān)鍵基因，探究NSUN2對(duì)非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展的潛在分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549購(gòu)自賽百慷公司。50 mL A549細(xì)胞培養(yǎng)基：含45 mL胎牛血清和5 mL雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，將其放入37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 主要試劑

胎牛血清(GEMINI)、Opti-MEM(Gibco)、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)、嘌呤霉素(TaKaRa)、青霉素和鏈霉素雙抗(Invitrogen)、RIPA裂解液(新賽美)、ECL(DIYIBio)、PVDF膜(Millipore)、BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司)、5×蛋白上樣緩沖液(上海碧云天生物技術(shù)公司)、三色預(yù)染蛋白Marker(Thermo Fisher Scientific)、羊抗兔IgG(Abcam)、NSUN2單克隆抗體(proteintech)、HRP-抗GAPDH鼠單克隆抗體(proteintech)。

1.3 NSUN2慢病毒干擾和對(duì)照細(xì)胞系的構(gòu)建

將NSUN2干擾載體/無關(guān)序列載體(實(shí)驗(yàn)室保存)、輔助質(zhì)粒和脂質(zhì)體2000混勻，制備DNA/脂質(zhì)體的混合懸液，室溫靜置20 min。將DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。分別于轉(zhuǎn)染48 h、72 h后收取細(xì)胞上清，經(jīng)離心后收集病毒，侵染A549細(xì)胞，侵染24 h更換新鮮培養(yǎng)基。然后用2 μg/mL嘌呤霉素(Puro)對(duì)細(xì)胞連續(xù)篩選7 d，獲得穩(wěn)定干擾的細(xì)胞株，將對(duì)照組細(xì)胞命名為NC，干擾組為sh-NSUN2。

1.4 Western Blot檢測(cè)NSUN2蛋白表達(dá)水平

收集NC組和sh-NSUN2組的細(xì)胞，采用RIPA裂解液(武漢博士德公司)對(duì)兩組細(xì)胞進(jìn)行裂解，制備蛋白樣品。采用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，加入蛋白上樣緩沖液(5×)，水浴煮沸5～10 min。制備體積分?jǐn)?shù)10% SDS-PAGE凝膠，將制備的蛋白質(zhì)樣品上樣，電泳后，通過轉(zhuǎn)膜把凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。脫脂奶粉封閉，一抗4 ℃孵育過夜，根據(jù)NSUN2和GAPDH的屬性選擇相應(yīng)的二抗孵育，室溫2 h。TBST清洗3次，加入ECL顯色液反應(yīng)、曝光、記錄結(jié)果。

1.5 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和差異基因表達(dá)

收集NC組和sh-NSUN2組細(xì)胞各收集三大皿，用PBS清洗兩遍，分別加入1 mL Trizol裂解液裂解3 min，放入1.5 mL離心管編號(hào)后置于干冰中，送往深圳華大基因有限公司完成轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。具體操作：采用Trizol提取NC組細(xì)胞和sh-NSUN2組細(xì)胞的總RNA，測(cè)定濃度，RNA經(jīng)質(zhì)量鑒定合格后進(jìn)行建庫，利用Illumina測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。使用DEGseq在線軟件以|log2(Fold change)|≥1且P≤0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步篩選差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)。

1.6 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

測(cè)序產(chǎn)出大量原始數(shù)據(jù)(raw data)，為保證測(cè)序分析的質(zhì)量，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，去掉接頭和低質(zhì)量的reads之后，獲得高質(zhì)量數(shù)據(jù)(clean data)。

1.7 DEGs的RT-qRCR驗(yàn)證

用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，按照EvoM-MLV RT Kit with gDNA Clean試劑盒說明書將其反轉(zhuǎn)錄為。選取差異表達(dá)基因3個(gè)，以人源GAPDH為內(nèi)參基因，用Primer5設(shè)計(jì)所用引物，引物名稱及序列見表1。反應(yīng)體系配制及條件按SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit試劑盒說明書進(jìn)行，每個(gè)樣本重復(fù)3次，用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的表達(dá)量。

表1 定量引物序列

1.8 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)GO、KEGG以及GSEA分析

登錄華大基因組學(xué)系統(tǒng)https：//biosys.bgi.com，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO注釋、KEGG通路分析和GSEA分析。

1.9 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Origin 2017軟件繪圖。所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，采用單因素方差分析對(duì)多組間均數(shù)進(jìn)行比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，以P<0.05或P<0.01表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 干擾NSUN2基因蛋白表達(dá)量分析

待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到80%時(shí)，用攜帶shRNA-NC、shRNA-NSUN2序列的慢病毒侵染A549細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，加入嘌呤霉素(puro)進(jìn)行篩選。獲得穩(wěn)定干擾shRNA-NSUN2的A549細(xì)胞株。Western blot結(jié)果表明NSUN2蛋白表達(dá)量明顯降低(見圖1(a))，經(jīng)灰度分析，發(fā)現(xiàn)干擾效率是79.2%，差異極顯著(見圖1(b))。說明本研究成功獲得了穩(wěn)定干擾NSUN2基因的A549細(xì)胞株。

(a)Western blot檢測(cè)NSUN2蛋白表達(dá)量 (b)NSUN2蛋白灰度分析 圖1 NSUN2蛋白表達(dá)水平

2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量評(píng)估、差異表達(dá)基因的篩選及聚類

測(cè)序錯(cuò)誤率受儀器系統(tǒng)誤差、人為操作誤差等多方面影響。為了使分析結(jié)果更加可靠，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行了整理和篩選，將NC-shRNA組與NSUN2-shRNA組細(xì)胞樣各3個(gè)重復(fù)樣品數(shù)據(jù)基本情況整理見表2，其中NC-shRNA1/2/3過濾后的Reads占比均大于99%，NSUN2-shRNA1/2/3過濾后的Reads占比均大于98%。所有樣品Q20均大于98%，Q30均大于94%。綜上，本次NC-shRNA組與NSUN2-shRNA組細(xì)胞樣樣品測(cè)序生成的數(shù)據(jù)均符合轉(zhuǎn)錄組分析相關(guān)要求。

表2 過濾后Reads質(zhì)量統(tǒng)計(jì)

為探究敲低NSUN2的表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞的影響，首先對(duì)shRNA-NC細(xì)胞和shRNA-NSUN2細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選A549細(xì)胞中NSUN2敲低表達(dá)后的差異表達(dá)基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，在敲低NSUN2的A549細(xì)胞中共有8117個(gè)DEGs，其中上調(diào)基因4089個(gè)，下調(diào)基因4028個(gè)，如圖2所示。以|log2(Fold change)|≥1且P≤0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步篩選DEGs，敲低組中共鑒定出1236種DEGs，其中957個(gè)基因上調(diào)，279個(gè)基因下調(diào)，差異基因的具體分布情況如圖2(a)所示。對(duì)篩選獲得的差異表達(dá)顯著的基因進(jìn)行聚類分析，如圖2(b)所示，重復(fù)組的DEGs基本一致，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組之間也存在明顯的差異，說明本研究使用的樣品分組合理，測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

(a)差異基因火山圖 (b)差異基因表達(dá)量聚類熱圖圖2 差異基因表達(dá)數(shù)量統(tǒng)計(jì)分析

圖3 GO富集分析結(jié)果

2.3 差異基因GO功能富集

進(jìn)一步對(duì)DEGs進(jìn)行GO分析，探究其生物學(xué)功能。將差異基因按照細(xì)胞組分(CC)、生物學(xué)過程(BP)和分子功能(MF)進(jìn)行分類，選擇每個(gè)GO分類中富集最顯著的前20個(gè)term，如圖3所示。與對(duì)照組相比，NSUN2敲低組的差異表達(dá)基因參與多種生物學(xué)過程，在細(xì)胞組分范疇內(nèi)，主要富集在質(zhì)膜部分、細(xì)胞外基質(zhì)、內(nèi)膜系統(tǒng)、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞連接、分泌泡囊等方面(見圖3(a))；在生物學(xué)過程中，包括外部刺激反應(yīng)、生物學(xué)過程調(diào)節(jié)、細(xì)胞粘著、信號(hào)傳遞等(見圖3(b))；在分子功能類別上，主要富集離子通道、蛋白質(zhì)結(jié)合、RNA聚合酶II調(diào)控區(qū)等(見圖3(c))。說明在A549細(xì)胞中敲低NSUN2將影響多種細(xì)胞組件的基因表達(dá)。

2.4 基因富集分析

為進(jìn)一步明確NSUN2通過哪些信號(hào)通路影響A549細(xì)胞的生物學(xué)功能，對(duì)數(shù)據(jù)集首先進(jìn)行基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis，GSEA)。按照富集分?jǐn)?shù)(NES)排序NSUN2敲低組富集的前10個(gè)信號(hào)通路如圖4(a)所示。其中，排在第一位和第二位的分別是整合素β1信號(hào)通路(見圖4(b))和整合素α9β1信號(hào)通路(見圖4(c))。進(jìn)一步利用KEGG通路綜合分析在差異基因表達(dá)中的基因所可能參與的主要生化功能代謝機(jī)制過程形成途徑和主要信號(hào)傳遞通路，結(jié)果表明，差異基因表達(dá)中的基因在325條主要信號(hào)傳遞通路中，顯著富集(P<0.05)的通路有87個(gè)，按P值由小到大選擇前15個(gè)通路，以散點(diǎn)圖的形式展示(見圖4(d))。結(jié)果發(fā)現(xiàn)富集的通路主要集中在免疫系統(tǒng)、癌癥、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂質(zhì)代謝、信號(hào)分子相互作用等方面。其中，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中主要包括PI3K-Akt信號(hào)通路和Jak-STAT信號(hào)通路；信號(hào)分子相互作用中包括細(xì)胞黏附分子(CAMs)，細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用，細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用3條信號(hào)途徑。結(jié)合GSEA和KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，在A549細(xì)胞中NSUN2敲低表達(dá)后，差異基因主要富集在整合素介導(dǎo)的信號(hào)通路。研究發(fā)現(xiàn)，整合素是跨膜糖蛋白受體，通過與配體的相互作用直接或者結(jié)合作用來控制介導(dǎo)人類細(xì)胞與人體蛋白、細(xì)胞與其他蛋白質(zhì)以及其他人體細(xì)胞外生物基質(zhì)之間相互粘連和互相黏附，及雙向消息信號(hào)的相互傳導(dǎo)等生理過程，從而有效地控制細(xì)胞的正常生長(zhǎng)、增殖、分化和功能轉(zhuǎn)移[12]。進(jìn)一步推測(cè)NSUN2可能通過整合素信號(hào)通路影響非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過程。

(a)GSEA排名前10的信號(hào)通路富集分析結(jié)果

(b)整合素β1信號(hào)通路 (c)整合素α9β1信號(hào)通路

2.5 RT-qRCR驗(yàn)證分析

基于GSEA和KEGG富集分析結(jié)果，進(jìn)一步篩選整合素介導(dǎo)信號(hào)通路中的3個(gè)差異基因(ITGβ1、ITGα5、ITGα9)進(jìn)行表達(dá)水平檢測(cè)。RT-qPCR結(jié)果顯示，NSUN2干擾表達(dá)后，ITGβ1、ITGα5的表達(dá)水平顯著下調(diào)，然而ITGα9的表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化(見圖5)。結(jié)果顯示與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果(表3)基本一致，說明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果較為準(zhǔn)確，同時(shí)在A549細(xì)胞中NSUN2敲低表達(dá)后，影響整合素信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)。

3 結(jié)論與討論

圖5 轉(zhuǎn)錄組篩選的差異基因RT-qPCR驗(yàn)證

在過去幾年里，RNA修飾技術(shù)被研究人員發(fā)現(xiàn)對(duì)許多腫瘤的形成和發(fā)展都有重要作用。其中，RNA的甲基化是最常見的，NSUN2是一種RNA的m5c甲基轉(zhuǎn)移酶。NSUN2是MYC誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞增殖的介質(zhì)[13]，是一種在細(xì)胞增殖中快速正確組裝紡錘體及其完整性的穩(wěn)定劑[14]。NSUN2還可以通過多種途徑促進(jìn)人體中癌細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)[13]，并且可以在腫瘤細(xì)胞抵抗氧化壓力時(shí)起到重要的應(yīng)激調(diào)控功能[15]。然而，在肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)過程中，NSUN2如何調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)功能尚不明確。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，比較了對(duì)照組細(xì)胞和敲低NSUN2的A549細(xì)胞中基因表達(dá)的情況，篩選出1236個(gè)表達(dá)顯著的差異基因，其中上調(diào)有957個(gè)，下調(diào)有279個(gè)，推測(cè)NSUN2可能通過調(diào)控這些差異基因的表達(dá)介導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展。

表3 整合素信號(hào)通路差異基因

GSEA和KEGG pathway富集分析發(fā)現(xiàn)在A549細(xì)胞中NSUN2敲低表達(dá)后，差異基因主要富集在整合素介導(dǎo)的信號(hào)通路中。目前的臨床研究結(jié)果表明，在惡性腫瘤中，整合素具有雙向信號(hào)傳遞的功能，直接或者間接地影響惡性腫瘤的細(xì)胞形成、遷移、浸潤(rùn)和細(xì)胞變異等多個(gè)環(huán)節(jié)[16]。整合素在大多數(shù)惡性腫瘤中的表達(dá)影響腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移，并有助于其存活[17]。本研究篩選出與整合素信號(hào)途徑相關(guān)的差異基因，發(fā)現(xiàn)ITGβ1、ITGα5的表達(dá)水平與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果相一致。研究發(fā)現(xiàn)整合素β1(ITGβ1)在乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤中均高表達(dá)，ITGβ1促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的存活、遷移和侵襲[18]。此外，ITGβ1的高表達(dá)和p53的低表達(dá)是非小細(xì)胞肺癌的不良預(yù)后因素[18]。整合素α9(ITGα9)在多種腫瘤中表達(dá)發(fā)生改變，它高表達(dá)于肺癌，特別是小細(xì)胞肺癌，可能是預(yù)后不良的指標(biāo)[19]。在結(jié)腸癌細(xì)胞中，整合素α9β1通過非受體酪氨酸激酶(Src)活化誘導(dǎo)型-氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)促進(jìn)細(xì)胞遷移，且機(jī)制中不涉及FAK、Erk和Racl的活化[20]。整合素α9胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域?qū)φ纤卅?β1誘導(dǎo)的Src活化以及后續(xù)的信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞遷移至關(guān)重要[21]。此外，整合素α9β1可以通過有效加強(qiáng)腫瘤上皮-間質(zhì)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能來促進(jìn)惡性腫瘤的生長(zhǎng)發(fā)育和細(xì)胞轉(zhuǎn)移。氧化二甲基查爾酮c可以有效阻止A375細(xì)胞的惡性增殖、遷移和細(xì)胞入侵，可能與抑制整合素β1的磷酸化、阻斷ERK通路相關(guān)[22]。另外，在惡性腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移中血管生成發(fā)揮著重要的作用，而整合素參與調(diào)節(jié)著血管的生成。例如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)被確定為腫瘤血管生長(zhǎng)中的核心因子，當(dāng)整合素分子和配體相結(jié)合后，可通過介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和黏附，促進(jìn)新生血管成熟和穩(wěn)定[23]。整合素α5β1在轉(zhuǎn)移的前列腺癌細(xì)胞中高度表達(dá)，且與動(dòng)脈血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和動(dòng)脈血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體呈負(fù)相關(guān)，說明整合素α5β1與動(dòng)脈血管生成及轉(zhuǎn)移密切有關(guān)[24]。

綜上所述，本研究通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序聯(lián)合生物信息學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)了NSUN2在肺癌細(xì)胞中調(diào)控的DECs，并且進(jìn)一步分析了鑒定的DEGs在肺癌細(xì)胞中可能參與的生物學(xué)過程及相關(guān)通路。其中整合素β1信號(hào)通路和整合素α9β1信號(hào)通路富集較為顯著，因此，我們將在下一步的研究中著重關(guān)注整合素信號(hào)通路影響非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過程，為揭示NSUN2在肺癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)作用和相關(guān)分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。