高效液相色譜法測定牛黃解毒片中膽酸和豬去氧膽酸的含量及其質(zhì)量分析

陳小紅，陳廣云

（淮安市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇淮安 223001）

牛黃解毒片具有清熱解毒的功效，是臨床常用的一味中藥，用于火熱內(nèi)盛，咽喉腫痛，牙齦腫痛，口舌生瘡，目赤腫痛。牛黃解毒片由人工牛黃﹑雄黃﹑石膏﹑大黃﹑黃芩﹑桔梗﹑冰片及甘草八味藥材組成，其中人工牛黃具有清熱解毒，化痰定驚的功效。人工牛黃由牛膽粉﹑膽酸﹑豬去氧膽酸﹑?；撬岍p膽紅素﹑膽固醇﹑微量元素等加工制成［1］。膽酸是一種有機(jī)酸，對于支氣管炎和慢性支氣管炎有一定的治療效果，可以保護(hù)患者的胃腸道黏膜，防止黏膜受損還可以降低血脂，治療高血脂，緩解膽囊炎等作用。豬去氧膽酸是一種有機(jī)化合物，是從豬膽汁中提取的一種膽烷酸，具有治療膽道炎，膽囊炎，膽石癥和其它非阻塞性膽汁淤積的功效，還能夠促進(jìn)腸道脂肪分解和脂溶性維生素吸收，同時(shí)可以降低血中的膽固醇，治療﹑預(yù)防冠心病和高血壓，因此測定牛黃解毒片中膽酸和豬去氧膽酸的含量具有重要意義。

目前對牛黃解毒片中膽酸﹑豬去氧膽酸的研究采用雙波長薄層掃描法，此方法操作方便﹑設(shè)備簡單﹑顯色容易，展開速率快，但有時(shí)分離效果不理想，結(jié)果不準(zhǔn)確，重現(xiàn)性較差?！吨袊幍洹?020 年版牛黃解毒片只分析了黃芩苷的含量，并沒有考察膽酸﹑豬去氧膽酸的含量。不同廠家﹑不同批次的牛黃解毒片所用人工牛黃的品質(zhì)有差異，進(jìn)而造成膽酸及豬去氧膽酸的含量有差異，筆者采用HPLC（高效液相色譜）法，蒸發(fā)光散射檢測器檢測，測定牛黃解毒片中膽酸［2–8］和豬去氧膽酸［9–14］的含量，通過其兩者之和來評價(jià)牛黃解毒片質(zhì)量的分類情況。該方法簡單，重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確，適用于測定膽酸和豬去氧膽酸的含量，從而達(dá)到控制牛黃解毒片的質(zhì)量，為臨床用藥提供指導(dǎo)性建議。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Aglient 1260 型，OpenLAB工作站，安捷倫科技（中國）有限公司。

數(shù)控超聲波清洗器：KH7200DE 型，昆山市禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

超純水機(jī)：ELGA PureLab Classic 型，英國埃爾格公司。

電子天平：（1）XSDU205 型，感量為0.01 mg，（2）XP6 型，感量為0.001 mg，瑞士梅特勒–托利多儀器公司。

膽酸對照品：批號為100078–201415，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.9%，中國食品藥品檢定研究院。

豬去氧膽酸對照品：批號為100087–200610；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97.3%，中國食品藥品檢定研究院。

甲醇﹑乙腈：色譜純，德國默克公司。

甲酸：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

牛黃解毒片樣品：批數(shù)為60，樣品編號為1～60，市售。

1.2 色譜條件

色 譜 柱：Welch Ultimate LP–C18柱（250 mm×4.60 mm，5 μm，Welch 公司）；流動(dòng)相：甲醇–乙腈–0.1%甲酸溶液（體積比為63∶17∶20）；檢測器：蒸發(fā)光散射檢測器；流量：0.8 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：20 μL。

1.3 對照品混合溶液的制備

精密稱取膽酸對照品2.586 mg﹑豬去氧膽酸對照品2.505 mg，置于10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至標(biāo)線，搖勻，配成膽酸﹑豬去氧膽酸質(zhì)量濃度分別為0.258 6﹑0.250 5 mg/mL 的對照品混合溶液。

1.4 樣品溶液制備

取樣品20 片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量（約相當(dāng)于人工牛黃16.5 mg），置于25 mL 容量瓶中，加甲醇適量，超聲處理30 min（功率為500 W，頻率為40 kHz），放冷，用甲醇稀釋至標(biāo)線，搖勻，用微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為樣品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

精密吸取對照品溶液5 μL，樣品溶液20 μL，按1.2 色譜條件分別進(jìn)樣測定，對照品混合溶液﹑樣品溶液色譜圖如圖1﹑圖2 所示。

圖1 對照品混合溶液色譜圖

圖2 樣品溶液色譜圖

結(jié)果表明，對照品混合溶液﹑樣品溶液中膽酸﹑豬去氧膽酸分離度均大于2.0，拖尾因子分別為1.02﹑1.03，理論板數(shù)按膽酸﹑豬去氧膽酸計(jì)均大于6 000，系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)符合要求。

2.2 提取條件選擇

以編號為6 的牛黃解毒片樣品為待測對象，以甲醇﹑乙醇﹑60%甲醇溶液﹑65%乙醇溶液四種溶劑提取膽酸﹑豬去氧膽酸，結(jié)果表明，提取溶劑為甲醇時(shí)，效果最好，故選用甲醇為提取溶劑。以甲醇為提取溶劑，分別采用回流法﹑超聲法提取膽酸﹑豬去氧膽酸，結(jié)果表明，兩者提取效果相當(dāng)，但回流法需要時(shí)間較長，超聲法所用時(shí)間較短且操作簡便，故選用超聲法提取樣品。將樣品分別置25 mL﹑50 mL 容量瓶中提取，比較不同體積的提取效果，發(fā)現(xiàn)并無顯著性差異，本著節(jié)約試劑﹑節(jié)約成本的原則，提取溶劑體積選擇25 mL?？疾鞓悠诽崛r(shí)間30 min﹑1 h，兩者提取色譜峰面積接近，表明30 min 提取完全，故選擇超聲時(shí)間30 min。

2.3 色譜條件優(yōu)化

分別考察甲醇–乙腈–0.1%甲酸溶液（體積比為68∶17∶15）﹑甲醇–乙腈–0.1%甲酸溶液（體積比為68∶12∶20）﹑甲醇–乙腈–0.1%甲酸溶液（體積比為65∶14∶21）﹑甲醇–乙腈–0.1%甲酸溶液（體積比為63∶17∶20）四種流動(dòng)相體系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以甲醇–乙腈–0.1%甲酸溶液（68∶17∶15）為流動(dòng)相時(shí)，膽酸﹑豬去氧膽酸出峰時(shí)間較快，膽酸﹑豬去氧膽酸分離度為1.1；以甲醇–乙腈–0.1%甲酸溶液（68∶12∶20）為流動(dòng)相時(shí)，兩個(gè)色譜峰的拖尾因子分別為1.1﹑1.2；以甲醇–乙腈–0.1%甲酸溶液（65∶14∶21）為流動(dòng)相時(shí)，膽酸﹑豬去氧膽酸色譜峰交叉重疊，不能達(dá)到基本分離；以甲醇–乙腈–0.1%甲酸溶液（63∶17∶20）為流動(dòng)相時(shí)，膽酸﹑豬去氧膽酸色譜峰分離良好，拖尾因子在規(guī)定范圍內(nèi)，理論板數(shù)均大于6000，且保留時(shí)間適中，故選用甲醇–乙腈–0.1%甲酸溶液（63∶17∶20）為流動(dòng)相。

2.4 線性方程與檢出限

精密吸取1.3 中對照品溶液2﹑5﹑8﹑10﹑15﹑20μL，注入液相色譜儀，在1.2 色譜條件下測定色譜峰面積，以色譜峰面積的對數(shù)Y為縱坐標(biāo)，膽酸﹑豬去氧膽酸質(zhì)量的對數(shù)（X）為橫坐標(biāo)，繪制工作曲線，計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。用甲醇不斷稀釋對照品混合溶液，在1.2 色譜條件下測定，以S/N為3 時(shí)對照品濃度為檢出限。膽酸﹑豬去氧膽酸的線性方程﹑線性范圍﹑相關(guān)系數(shù)及檢出限見表1。

表1 膽酸、豬去氧膽酸的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.5 精密度試驗(yàn)

精密稱取60 號樣品（約相當(dāng)于人工牛黃16.5 mg）6 份，按1.4 方法制備樣品溶液，在1.2 色譜條件下測定，結(jié)果見表2。由表2 可知，膽酸﹑豬去氧膽酸質(zhì)量濃度測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.4%﹑0.7%，表明該方法精密度良好。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別于0﹑2﹑4﹑8﹑10﹑12 h測定對照品混合溶液，測定膽酸﹑豬去氧膽酸峰面積，結(jié)果見表3。由表3可知，膽酸﹑豬去氧膽酸峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.4%﹑0.6%，表明對照品混合溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.7 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

精密稱取6 號樣品細(xì)粉（約相當(dāng)于人工牛黃16.5 mg）6 份，分別置于50 mL 量瓶中，精密加入等量的膽酸﹑豬去氧膽酸對照品，按1.4 方法制備樣品溶液，在1.2 色譜條件下測定，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見表4。

表4 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

由表4 可知，膽酸﹑豬去氧膽酸平均回收率分別為98.16%﹑97.83%，說明該方法具有較高的準(zhǔn)確度。

2.8 樣品測定

取60 批牛黃解毒片樣品，按1.4 方法制備樣品溶液，在1.2 色譜條件下測定，結(jié)果見表5。

表5 每片牛黃解毒片中膽酸、豬去氧膽酸的含量測定結(jié)果

續(xù)表5

由表5 可知，牛黃解毒片中膽酸﹑豬去氧膽酸總量為0.2174 ～0.721 6 mg/片，不同廠家﹑不同批號的牛黃解毒片所含兩者總量差異較大，膽酸與豬去氧膽酸的比值也存在一定的差異。

3 質(zhì)量分析

對60 批牛黃解毒片中所含膽酸﹑豬去氧膽酸及兩者之和，通過SPSS 22.0 版軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。采用平方Euclidean 距離法，計(jì)算不同樣品間的相似度，聚類分析結(jié)果見圖3。

由圖3 可知，60 批牛黃解毒片樣品整體聚為一類，考慮到其差異性較大，大致分為四類：一類包括編號為1，2，3，4，5，8，12，14，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，28，41，42，58 的23 批樣品；二類包括編號為6，7，9，10，11，13，15 的7 批樣品；三類包括編號為29，30，37，38，39，40，46，47，48，49 的10 批樣品；四類包括編號為27，31，32，33，34，35，36，43，44，45，50，51，52，53，54，55，56，57，59，60 的20 批樣品。

圖3 聚類分析樹狀圖

對60 批牛黃解毒片樣品中所含膽酸﹑豬去氧膽酸兩者比值，通過SPSS 22.0 版軟件進(jìn)行K平均值聚類分析。采用比值平均值法，考察不同廠家﹑不同批次樣品間的差異，K平均值聚類分析結(jié)果見表6。

表6 最終叢集中心

60 批牛黃解毒片樣品大體分為兩類：一類膽酸﹑豬去氧膽酸比值均值為0.79，有38 批樣品；二類膽酸﹑豬去氧膽酸比值均值為1.11，有22 批樣品；表明這兩類樣品所用人工牛黃存在一定的差異性。

4 結(jié)論

（1）文獻(xiàn)中膽酸﹑豬去氧膽酸含量的測定基本采用薄層掃描法，此方法存在一定的缺點(diǎn)，故在參考相應(yīng)資料［15–16］后采用HPLC–ELSD 法測定其含量，該方法操作簡便，準(zhǔn)確度高，可有效控制牛黃解毒片的質(zhì)量。

（2）不同廠家﹑不同批號的牛黃解毒片中含膽酸及豬去氧膽酸總量存在較大差異，可能與其所用人工牛黃品質(zhì)及生產(chǎn)工藝有相應(yīng)關(guān)系。

（3）人工牛黃中膽酸與豬去氧膽酸的比值是一定的，每個(gè)廠家膽酸與豬去氧膽酸的比值不盡相同，可能合成人工牛黃時(shí)膽酸與豬去氧膽酸的投料有一定的差異，影響了人工牛黃的質(zhì)量，進(jìn)而影響牛黃解毒片的質(zhì)量。