分散液液微萃取–高效液相色譜法測定尿液中的阿替洛爾

劉紅莉，苗會娟，張晨軒

(1.河北省藥品職業(yè)化檢查員總隊，石家莊 050000； 2.河北省藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)研究院，石家莊 050000)

阿替洛爾是一種β 受體阻滯劑，用于治療高血壓﹑心絞痛和心肌梗死等疾病，在體內(nèi)難以降解［1］。目前，阿替洛爾常用的檢測方法有光譜方法﹑薄層色譜法﹑毛細(xì)管電泳﹑氣相色譜法和液相色譜法等［2］。高效液相色譜法具有樣品準(zhǔn)備時間短﹑無需衍生化﹑多種物質(zhì)可同時分析等優(yōu)點(diǎn)，已成為測定阿替洛爾含量的重要手段。建立尿液中β 受體阻滯劑的快速檢測方法具有較高的應(yīng)用價值和較強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)需求。樣品處理是檢測過程不可缺少的步驟，也是最耗時的環(huán)節(jié)。微萃取技術(shù)是一種新型的前處理技術(shù)，因其簡便﹑快速﹑廉價﹑高回收率和高富集因子等優(yōu)點(diǎn)，在提取痕量藥物方面已經(jīng)引起廣泛關(guān)注［3］。分散液液微萃取基于由水相﹑非極性萃取溶劑﹑極性分散溶劑組成的三元溶劑組分體系，通過微升體積的萃取劑分散在溶液中，瞬間完成萃取［4–5］。分散液液微萃取因其簡便﹑溶劑消耗少﹑濃縮能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在尿液和血液等多種生物基質(zhì)中均有應(yīng)用［6］。然而，分散液液微萃取具有萃取劑毒性大﹑萃取劑不易收集等缺點(diǎn)。離子液體是一種新型溶劑，它是由有機(jī)陽離子與各種陰離子結(jié)合成的液體鹽［7］。離子液體具有優(yōu)異的性能，如高熱穩(wěn)定性﹑較寬的液態(tài)溫度范圍﹑相對較高的粘度以及能夠溶解多種化合物［8］。離子液體也以其良好的溶劑化性質(zhì)而聞名，蒸氣壓可忽略不計，而且毒性相對較低，被認(rèn)為是良好的綠色溶劑［9］。離子液體迄今已成功用于多種微萃取技術(shù)，將離子液體與分散液液微萃取技術(shù)相結(jié)合，替代分散液液微萃取中所使用的高毒性萃取劑具有重要意義［10］。

離心步驟是收集萃取劑時最耗時的步驟，一般需要十分鐘以上［11］。在離心后，萃取劑相和樣品溶液相的界面不易觀察，萃取劑相不易充分收集，從而影響整個方法的提取收率。利用萃取劑和樣品溶液凝固點(diǎn)的差異，通過降溫，將其中一相轉(zhuǎn)化為固體，可以簡化耗時的離心步驟，基于固液分離的原理高效充分地收集到萃取劑相，提高萃取效率。

筆者建立了離子液體–分散液液微萃取結(jié)合高效液相色譜–二極管陣列檢測器測定尿液中阿替洛爾的方法。通過離子液體在樣品中的分散實(shí)現(xiàn)了對阿替洛爾的萃取，優(yōu)化了萃取條件，并將此方法應(yīng)用于分析尿液樣本中的痕量藥物阿替洛爾。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：安捷倫1260 型，美國安捷倫科技有限公司。

阿替洛爾：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為97%，阿拉丁生化科技股份有限公司。

1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為97%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

甲醇﹑乙腈和丙酮：色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB–C18型色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美國安捷倫科技有限公司）；進(jìn)樣體積：20 μL；流動相：乙腈–0.1 moL/L磷酸緩沖溶液（pH 3.1），體積比為40∶60，流量為1.2 mL/min；檢測波長：228 nm。

1.3 樣品處理

將80 μL 的離子液體萃取劑1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽和800 μL 的乙腈分散劑混合溶液快速注入含有5 mL 未經(jīng)處理待測尿液的離心管中，離子液體1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽均勻的分散在樣品溶液中并完成萃取。將離心管轉(zhuǎn)移到4 ℃的冰箱后，充分收集固化在離心管下層的1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽，待其在室溫融化后進(jìn)樣至高效液相色譜儀中進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取條件的優(yōu)化

為了獲得最佳的提取條件，進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)來研究提取條件對提取效率的影響，包括萃取劑的種類和體積﹑分散劑的種類和體積以及鹽等影響因素。

2.1.1 萃取劑選擇

在分散液液微萃取過程中，選擇合適的萃取劑是影響提取效率的首要因素。萃取劑應(yīng)具有比水密度大﹑在水中溶解度低﹑對目標(biāo)分析物的萃取能力強(qiáng)等特點(diǎn)［12］?；谝陨蠗l件，筆者選取離子液體1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽和1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽作為萃取劑。結(jié)果表明，1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽作為萃取劑表現(xiàn)出更高的萃取效率。因此選擇1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽作為萃取劑。

2.1.2 萃取劑體積選擇

萃取劑的使用量是影響萃取回收率的重要因素，萃取劑過少會降低萃取效率，萃取劑過多會降低方法的靈敏度［13］。選取離子液體體積分別為50﹑60﹑70﹑80﹑90﹑100 μL 進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見圖1。

圖1 離子液體體積對萃取效率的影響

由圖1 可知，隨著離子液體用量從50 μL 增加到80 μL，萃取效率顯著提高，繼續(xù)增加萃取劑的體積，萃取效率保持不變。因此，選擇80 μL 的1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽作為萃取劑。

2.1.3 分散劑選擇

在分散液液微萃取過程中，萃取劑在分散劑的幫助下形成小液滴，增加與樣品的接觸面積，從而實(shí)現(xiàn)高效的萃?。?4］。本實(shí)驗(yàn)選取了甲醇﹑乙腈和丙酮三種分散劑，比較其分散效果。結(jié)果表明，乙腈的分散能力顯著高于甲醇和丙酮的分散能力，當(dāng)乙腈作為分散劑時，提取效率較高。因此，選擇乙腈作為萃取劑1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽的分散劑。

2.1.4 分散劑體積選擇

分散劑的體積也是影響萃取效率的重要因素。由于萃取劑是疏水的，只有足量的分散劑才能保證萃取劑在樣品溶液中均勻分散，否則，由于分散劑體積不足，不能形成穩(wěn)定的乳液體系，導(dǎo)致萃取效率下降［15］。選取分散劑的體積分別為200﹑400﹑600﹑800﹑1000﹑1200 μL 進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見圖2。由圖2可知，分散劑用量從200 μL 增加到800 μL，萃取效率逐漸升高，繼續(xù)增加分散劑的量，萃取效率逐漸降低。因此選擇800 μL 的乙腈作為分散劑。

圖2 乙腈體積對萃取效率的影響

2.1.5 鹽的影響

加入鹽會降低阿替洛爾在水溶液樣品中的溶解度，促使阿替洛爾分配到有機(jī)相中，產(chǎn)生鹽析效應(yīng)［16］。另外，加入鹽會改變離子強(qiáng)度，可能影響離子液體對阿替洛爾的萃取性能。本實(shí)驗(yàn)選取氯化鈉的添加量分別為0﹑200﹑400﹑600﹑800﹑1 000﹑1 200 mg 進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，隨著氯化鈉用量的增加，萃取效率沒有顯著的升高。因此本實(shí)驗(yàn)在分散液液微萃取過程中不添加氯化鈉。

2.1.6 pH 選擇

阿替洛爾在樣品溶液中的存在形態(tài)常受pH 值的影響，pH 值影響阿替洛爾的分配系數(shù)從而改變阿替洛爾的提取效率。本實(shí)驗(yàn)調(diào)節(jié)樣品溶液的pH值分別為3﹑5﹑7﹑9﹑11 進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，隨著pH 值的變化，阿替洛爾的萃取效率沒有出現(xiàn)顯著的變化。因此本實(shí)驗(yàn)在分散液液微萃取前無需調(diào)節(jié)樣品的pH 值。

2.2 線性方程與檢出限

為了評估本方法的分析性能，在最佳萃取條件下進(jìn)行了線性﹑定量限和檢出限的評價。用甲醇配制質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的阿替洛爾標(biāo)準(zhǔn)儲備液，并逐級稀釋制備不同濃度的加標(biāo)尿液樣品(0.01﹑0.02﹑0.1﹑0.2﹑1 μg/mL)考察本方法的線性關(guān)系，繪制了平均色譜峰面積對樣品質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。阿替洛爾在0.01～1 μg/mL 范圍內(nèi)與色譜峰面積具有良好的線性關(guān)系，以阿替洛爾的質(zhì)量濃度(x，μg/mL)為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，線性方程為y=328.6x+1.211，相關(guān)系數(shù)為0.995。以信噪比(S/N)分別為3 和10 計算，得檢出限和定量限分別為0.003﹑0.010 μg/mL。

為了評估本方法的重復(fù)性，連續(xù)5 天對阿替洛爾樣品進(jìn)行重復(fù)測定，計算日間精密度。同一天內(nèi)在5 個不同時間對阿替洛爾樣品進(jìn)行重復(fù)測定，計算日內(nèi)精密度。日間試驗(yàn)的回收率分別為93.0%﹑94.2%﹑99.7%﹑103.8%﹑105.7%，精密度為5.7%(n=5)；日內(nèi)試驗(yàn)的回收率分別為94.1﹑94.4﹑99.8﹑101.8﹑103.2，精密度為4.3%(n=5)，結(jié)果表明，所建立的方法具有良好的重復(fù)性。

2.3 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)

將本方法應(yīng)用于尿液中阿替洛爾的定量分析以評估其準(zhǔn)確性和適用性。尿液樣品通過分散液液微萃取法提取，用高效液相色譜儀進(jìn)行定量分析。在最佳萃取條件下進(jìn)行了0.01﹑0.1﹑1 μg/mL 三個濃度的加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)。標(biāo)準(zhǔn)色譜圖與樣品加標(biāo)色譜圖分別見圖3﹑圖4，加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)結(jié)果如表1 所示。由表1 可知，阿替洛爾在尿樣中的回收率為94.1%～101.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.4%～3.9%（n=5），結(jié)果表明本方法具有良好的準(zhǔn)確性和適用性。

表1 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)結(jié)果

圖3 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖4 樣品加標(biāo)色譜圖

3 結(jié)語

提出了一種結(jié)合離子液體和分散液液微萃取優(yōu)點(diǎn)的新型樣品處理技術(shù)，并采用固液分離方法收集萃取劑，應(yīng)用高效液相色譜儀檢測尿液中的阿替洛爾。在該方法中，萃取劑離子液體1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽以微小液滴的形式分散到樣本溶液中，快速高效地完成了萃取，同時避免使用高揮發(fā)性和高毒性的傳統(tǒng)萃取溶劑。無需耗時的離心步驟便可實(shí)現(xiàn)萃取劑的高效收集。在最優(yōu)的萃取條件下，本方法表現(xiàn)出了良好的線性﹑靈敏度﹑提取效率和重復(fù)性。離子液體–分散液液微萃取是一種簡單﹑快速﹑高效的前處理方法，可用于生物樣本中痕量藥物的分析。