中國與美國RFLP 1-4-4 lineage1C 變異株同一分支PRRSV 的全基因組序列分析

許 滸，李 超，相麗潤，湯艷東，趙 靜，龔幫俊，李宛生，付 軍，彭金美，王 倩，周國輝，冷超糧，安同慶，蔡雪輝*，張洪亮*，田志軍*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150069；2.南陽師范學(xué)院，河南 南陽 473061）

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）是引起豬繁殖與呼吸綜合征的主要病原，給養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。該病毒分為歐洲型和美洲型兩個基因型[1]。2006 年以前中國大陸的主要流行株是以CH-1a 為代表的經(jīng)典PRRSV，2006 年高致病性PRRSV（HP-PRRSV）在我國出現(xiàn)并迅速成為了我國的主要流行株，該類病毒Nsp2 蛋白中存在30（1+29）個氨基酸的不連續(xù)缺失[2]。2012 年我國報道了類NADC30 PRRSV，該類病毒Nsp2蛋白中存在131（111+19+1）氨基酸的不連續(xù)缺失[3]，該類病毒具有同源性低、重組頻繁和致病性差異較大的特點，已經(jīng)逐漸成為我國主要的流行株[4]。

2014 年ORF5 RFLP 1-7-4 譜系PRRSV 毒株在美國出現(xiàn)并流行，至少在美國5 個生豬生產(chǎn)洲檢測到該類病毒，其在母豬群中引起嚴(yán)重的流產(chǎn)，并導(dǎo)致了仔豬的高死亡率[5]。2017 年本實驗室從遼寧省兩個發(fā)病豬場首次檢測到1-7-4 分支PRRSV[6-7]。中國1-7-4 分支病毒株在Nsp2 區(qū)均存在100 個氨基酸連續(xù)缺失，這與美國1-7-4 分支病毒株相同[8]。由于中國的1-7-4 分支病毒株與美國的IA/2014/NADC34 株較為相似，因此也稱為類NADC34 PRRSV[9]。2020 年美國報道了一種高致病性的美洲型PRRSV，并命名為ORF5 1-4-4 Lineage 1C 變異株，其對豬的致死率可達(dá)17.50%[10]。然而該類病毒株與1-7-4 譜系PRRSV（即類NADC34 PRRSV）同源性最高，那么當(dāng)下我國類NADC34 PRRSV 的流行情況是怎樣的，美國1-4-4 Lineage 1C 變異株與我國類NADC34 PRRSV之間存在著怎樣的關(guān)系？本實驗將就此展開研究。

1 材料與方法

1.1 病料樣品來源及主要試劑722 份疑似PRRSV感染的病料組織或血清樣品為本實驗室2020 年～2021 年6 月采自13 個省、市和自治區(qū)（黑龍江省、內(nèi)蒙古自治區(qū)、吉林省、遼寧省、河北省、山西省、山東省、河南省、湖北省、四川省、江西省、新疆自治區(qū)、天津市）的規(guī)模化養(yǎng)豬場。RNeasy plus Mini Kit 購自Qiagen 公司；M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、LATaqDNA 聚合酶和pMD18-T 載體等均購自TaKaRa 公司；Gel Extraction Kit 購自O(shè)MEGA 公司；TG1 感受態(tài)細(xì)胞由本實驗室制備。

1.2 引物設(shè)計根據(jù)GenBank中的NADC30（JN654459）和IA/2014/NADC34 株（MF326985）全基因組序列，參照文獻(xiàn)[6]由庫美生物有限公司合成2 對檢測引物和8 對全長擴(kuò)增引物。

1.3 PRRSV 部分基因及全基因序列擴(kuò)增按常規(guī)方法處理收集的組織或血清樣品，利用RNeasy plus Mini Kit 提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA 為模板，利用2 對檢測引物對病料樣品檢測并擴(kuò)增Nsp2 和ORF5 基因。陽性樣品擴(kuò)增產(chǎn)物由庫美生物有限公司測序分析后，選取類NADC34 PRRSV 陽性樣品的cDNA 為模板，利用8 對全長引物擴(kuò)增全基因組序列。PCR 反應(yīng)程序為，94 ℃2 min；94 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃45 s～2 min 30 s，共30 個循環(huán)；72 ℃10 min。采用Gel Extraction Kit 對目的片段純化，并將純化的PCR 產(chǎn)物克隆至pMD18-T 載體，PCR 鑒定陽性重組質(zhì)粒由庫美生物有限公司進(jìn)行測序。全基因組序列采用MegAlign和Seqman拼接。

1.4 PRRSV 的同源性分析及推導(dǎo)氨基酸序列分析利用MegAlign（ClusterW）對類NADC34 PRRSV 及美國RFLP 1-4-4 lineage1C 變異株的全基因組進(jìn)行核苷酸序列的同源性分析及Nsp2 基因推導(dǎo)氨基酸序列的分析。

1.5 PRRSV 的遺傳演化分析利用MEGA6.0（Neighbor-Joining method，bootstrap 值為1000）對類NADC34 PRRSV、美國RFLP 1-4-4 lineage1C 變異株及Gen-Bank 中的PRRSV 參考序列進(jìn)行全基因組、Nsp2 部分基因序列和ORF5 基因的遺傳演化分析。

1.6 PRRSV 的全基因組重組分析根據(jù)GenBank 中登錄的PRRSV 參考序列，利用RDP4 和Simplot 軟件對分離株進(jìn)行重組分析，篩選出主要親本毒株和次要親本株，利用Simplot 軟件繪制重組圖。著重對PRRSV ORF5 基因進(jìn)行RFLP 模式分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 2020 年～2021 年類NADC34 PRRSV 檢測結(jié)果對722 份豬組織或血清樣品進(jìn)行PCR 檢測，結(jié)果顯示PRRSV陽性樣品359份，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序分析后發(fā)現(xiàn)其中類NADC34 PRRSV 樣品32 份。為了進(jìn)一步探究該類病毒株的流行特點及基因組序列變化，本實驗選取了5 份（HLJTZJ829、HLJTZJ864、HLJTZJ921、LNT ZJ1341、SDHSW135）樣品進(jìn)行了全基因組序列測定。

本實驗室在早期研究中對2020 年以前報道的類NADC34 PRRSV 株進(jìn)行綜合分析，推測其是我國潛在的流行株[9]。自2017 年本實驗室首次報道該類毒株[7]至2019 年底中國共報道了14 株類NADC34 PRRSV[9,11-12]，遠(yuǎn)低于2020 年以來的檢出數(shù)量。盡管本研究檢測的樣品數(shù)量和區(qū)域相對有限，但分析可見近年來類NADC34 PRRSV 檢出數(shù)量在PRRSV 陽性檢出數(shù)量中占比有所增加，加大對該類病毒株的重視已迫在眉睫。

2.2 遺傳演化分析本研究對類NADC34 PRRSV 和美國新發(fā)1-4-4 變異株的全基因組、Nsp2 和ORF5基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹的構(gòu)建?；谌蚪M和Nsp2部分基因序列的遺傳演化結(jié)果顯示，美國RFLP 1-4-4 lineage 1C變異株與所有類NADC34 PRRSV均屬于Sublineage 1.5 亞型，因此美國新發(fā)RFLP 1-4-4 lineage 1C 變異株與類NADC34 PRRSV 屬于同一亞型（圖1）。基于ORF5基因遺傳演化分析結(jié)果顯示，我國類NADC34 PRRSV HLJZD22-1812、LNWK96 與RFLP 1-4-4 lineage 1C 均為Sublineage 1.8 亞型（NADC30-like），均是由病毒基因組序列發(fā)生重組導(dǎo)致（圖1）。

2.3 Nsp2 推導(dǎo)氨基酸序列的分析結(jié)果Nsp2 是PRRSV 全基因組中變異最大的區(qū)域之一，Nsp2 區(qū)域的基因缺失、插入或突變常被作為區(qū)分不同類型毒株的分子標(biāo)記。本研究利用MegAlign 對中國和美國的類NADC34 PRRSV 及美國新發(fā)RFLP 1-4-4 lineage1C 變異株的Nsp2 推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，24 株類NADC34 PRRSV、RFLP 1-4-4 lineage 1C 變異株與參考株ATCC VR2332 相比，均具有100 個按基酸（aa328～aa427）的連續(xù)缺失（圖1D）。我國的類NADC34 PRRSV 與美國RFLP 1-4-4 lineage 1C PRRSV 變異株具有一致的缺失特征。

圖1 類NADC34 PRRSV及RFLP 1-4-4 lineage 1C變異株分別基于全基因組（A）、Nsp2（B）、ORF5（C）基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹;類NADC34 PRRSV及美國RFLP 1-4-4 lineage1C PRRSV變異株Nsp2推導(dǎo)氨基酸序列比對（D）Fig.1 A phylogenetic tree based on the nucleotide sequence of the whole genome(A),ORF5(B),and Nsp2(C)genes of NADC34-like PRRSV and 1-4-4 lineage 1C variants.Alignments of NADC34-like PRRSVs and RFLP 1-4-4 lineage 1C variants based on deduced amino acid sequences of Nsp2（D）

2.4 病毒全基因組重組分析結(jié)果近年來，有關(guān)PRRSV 重組病毒株的報道層出不窮，尤其類NADC30株進(jìn)入我國后迅速與我國本土病毒株重組，逐漸成為主要流行株[4]，其已展現(xiàn)出極其復(fù)雜的致病性。本研究利用RDP4 和Simplot 生物學(xué)軟件對我國新發(fā)類NADC34 PRRSV（HLJTZJ829、HLJTZJ864、HLJTZ J921、LNTZJ1341、SDHSW135）及美國RFLP 1-4-4 lineage 1C 變異株的全基因組序列進(jìn)行對比分析，結(jié)果顯示，美國RFLP 1-4-4 lineage 1C 變異株病毒的基因重組區(qū)域位于1 nt～11 681 nt（IA14737-2016）、11 682 nt～13 921 nt（IA/2014/NADC34）和13 922 nt～15 058 nt（NADC30）（圖2），以上結(jié)果表明美國RFLP 1-4-4 lineage1C PRRSV 變異株是以IA14737-2016（類NADC34 PRRSV）為母本毒株，IA/2014/NADC34 和NADC30 株提供重組片段的重組病毒。進(jìn)一步對比分析可見美國RFLP 1-4-4 lineage1C PRRSV變異株與中國病毒株HLJZD22-1812（MN648450）重組模式非常相近，二者均由類NADC34 病毒株提供骨架，并在ORF5 區(qū)域與NADC30 毒株重組（圖2）。

圖2 RFLP 1-4-4 lineage 1C variant重組分析Fig.2 Recombination analysis of RFLP 1-4-4 lineage 1C variant

與早期報道的類NADC34 株不同，本團(tuán)隊近期檢測到的類NADC34 株均未發(fā)生重組，并且早期報道的類NADC34 株的重組片段也均由美國株提供，類NADC34 PRRSV 在我國尚未與本土毒株發(fā)生重組。推測類NADC34 PRRSV 未與本土毒株重組可能是其在我國致病性整體較弱[8,13]，且未爆發(fā)性流行的原因之一。

2.5 PRRSV ORF5 分析限制性片段長度多態(tài)性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析主要是依據(jù)MluI、Hind II 和SacII 在ORF5 基因上的酶切模式進(jìn)行劃分[14]。RFLP模式分析結(jié)果顯示，我國類NADC34株的RFLP模式較為復(fù)雜，主要為1-7-4模式[1（MluI=0）、7（HindII=nt88、 219、360）和4（SacII=nt24、555）]。其中HLJZD22-1812 和美國RFLP 1-4-4 lineage1C PRRSV 變異株均為以類NADC34 株為骨架，以NADC30提供重組片段的重組病毒，二者ORF5 RFLP 模式均為1-4-4 模式[1（MluI=0）、4（HindII=nt88、219）和4（SacII=nt24、555）]（表1），基于ORF5的遺傳演化分析結(jié)果顯示HLJZD22-1812 也屬于lineage1C PRRSV 分支。然而RFLP 1-4-4 模式和lineage1C 僅能展現(xiàn)PRRSV 的ORF5 基因特征，無法反映PRRSV 的全基因組信息，而且RFLP 1-4-4 模式的PRRSV 在lineage8、sublineage1.5 和sublineage1.8 分支中均存在[15]。

表1 類NADC34 PRRSV重組分析及RFLP模式分析Table 1 Recombination and RFLP analysis of NADC34-like PRRSV strains

本研究通過全基因組綜合分析發(fā)現(xiàn)，RFLP 1-4-4 lineage1C PRRSV 變異株與中國的類NADC34株均具有100 個氨基酸的連續(xù)缺失特征，基于全基因組的遺傳演化分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者均屬于類NADC34 PRRSV。

綜上所述，美國RFLP 1-4-4 lineage1C PRRSV 變異株與我國類NADC34 PRRSV 屬于同一亞型分支（Sublineage 1.5），其分子特征是Nsp2 基因區(qū)域存在相同的100 個氨基酸連續(xù)缺失。由于類NADC34 PRRSV 已成為美國主要流行株。因此，類NADC34 PRRSV 有可能成為我國PRRSV 的潛在流行株，其流行病學(xué)及生物學(xué)特性需要進(jìn)一步研究。