綿羊肺炎支原體P113 蛋白和絲狀支原體山羊亞種LppA 蛋白共表達(dá)質(zhì)粒對小鼠免疫應(yīng)答的研究

楊 鵬，吳 燕，岳 筠，陳 靜，李 梅，王 慧，張雙翔*，文 明,2，程振濤,2*

（1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；3.貴州省動物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽 550008）

羊支原體肺炎（Mycoplasmal pneumoniaof sheep and goats，MPSG）是一種由綿羊肺炎支原體（Mycoplasma ovipneumoniae，Mo）、絲狀支原體山羊亞種（Mycoplasma mycoides subsp.capri，Mmc）和山羊支原體山羊亞種（Mycoplasma capricolum subsp.capricolum，Mcc）等支原體感染引起羊的一種高度接觸性傳染病，其中以山羊、綿羊最為易感，患病羊主要表現(xiàn)為消瘦、貧血、纖維素性肺炎和胸膜炎，嚴(yán)重時導(dǎo)致死亡[1-2]。貴州省作為我國的養(yǎng)羊大省，有貴州黑山羊、貴州白山羊和黔北麻羊3 種優(yōu)秀山羊品種[3]。據(jù)調(diào)查顯示，貴州省境內(nèi)各品種羊場均有羊支原體肺炎流行，疫病的流行給養(yǎng)羊業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，免疫接種仍是該病主要的預(yù)防手段，目前MPSG 疫苗研究主要集中在弱毒疫苗和滅活疫苗方向[4]，然而弱毒疫苗存在安全性等問題，在國外部分國家已停止使用；國內(nèi)目前主要使用滅活疫苗防控MPSG，而由于支原體體外培養(yǎng)困難，導(dǎo)致滅活疫苗成本較高，且存在滅活疫苗刺激機(jī)體免疫效果不佳和免疫保護(hù)時效短等問題[5]，因此，新型疫苗的研發(fā)顯得十分迫切和必要。

近年來，核酸疫苗因其刺激免疫應(yīng)答能力強(qiáng)、安全、可靠、生產(chǎn)方便、免疫途徑多樣等優(yōu)點(diǎn)而受到越來越多的重視[6]。余波等構(gòu)建的鴨疫里氏桿菌OmpA 基因真核重組質(zhì)粒能夠誘導(dǎo)雛鴨產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答[7]，為核酸疫苗研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)；田格如等研制的隱孢子蟲AOX 基因和TSP6 基因重組質(zhì)?？蔀闄C(jī)體提供較強(qiáng)的免疫保護(hù)[8]。越來越多的研究者表示，核酸疫苗可作為當(dāng)前新型疫苗研究的重點(diǎn)。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，貴州省MPSG致病菌主要為Mo 和Mmc[9-10]，本實(shí)驗(yàn)室前期已分離出Mo 和Mmc，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Mo P113 基因C 末端和Mmc LppA 基因N 末端具有較強(qiáng)的抗原性[11]，本研究利用已構(gòu)建的pMD19-T-P113 克隆質(zhì)粒和pMD19-T-LppA 克隆質(zhì)粒為模板，構(gòu)建真核重組質(zhì)粒pVAX1-P113-LppA 并免疫小鼠，分析其對小鼠免疫應(yīng)答的影響，以期為羊支原體肺炎基因工程疫苗的研制及防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、pMD19-T-P113 克隆質(zhì)粒、pMD19-T-LppA 克隆質(zhì)粒、真核表達(dá)載體pVAX1、MDBK 細(xì)胞、羊源Mo 和Mmc 陽性/陰性血清、羊源P113 和LppA 蛋白、Mo GZ-QX 株、Mmc GZ-LD 株均由貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，其中Mo GZ-QX 株、Mmc GZ-LD 株均為1×1011ccu，且前期實(shí)驗(yàn)已確定二者對小鼠的最小致病劑量均為1×108ccu/mL。4～5 周齡BABL/c 小鼠均購自貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。CD4-FITC、CD8-PE、PE-Cy5-CD3 小鼠單克隆抗體均購自科聯(lián)生物科技有限公司；脂質(zhì)體（LipofecttamineTM3000）購自Invitrogen 公司；E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit、E.Z.N.A.TMPlasmid Kit、無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒均購自O(shè)mega 公司；兔抗鼠IgG-HRP、兔抗羊IgG-FITC 購自博奧森公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、限制性內(nèi)切酶Hind III、KpnI、BamH I、XhoI 均購自Ta-KaRa公司；小鼠白細(xì)胞介素-2（IL-2）、白細(xì)胞介素-4（IL-4）、干擾素-γ（IFN-γ）檢測試劑盒均購自上海巧伊生物科技有限公司；HE（蘇木素-伊紅）染色試劑盒購自Solarbio 公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)合成及重組質(zhì)粒的構(gòu)建參考Gen-Bank 中Mo GZ-QX1 株的P113 基因序列（KR270152）和Mmc PG3 株的LppA 基因序列（AF072715.1），分別選擇抗原性良好的區(qū)域，結(jié)合真核表達(dá)載體pVAX1多克隆位點(diǎn)，利用primer5.0 各設(shè)計(jì)一對特異性引物，P113 基因選用Hind III 和KpnI 作為酶切位點(diǎn)（下劃線）、LppA 基因選用BamH I 和XhoI 作為酶切位點(diǎn)（下劃線），在兩個基因5′端的酶切位點(diǎn)后分別添加Kozak 序列（波浪線）。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列及預(yù)擴(kuò)增長度見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

分別以pMD19-T-P113 質(zhì)粒和pMD19-T-LppA 質(zhì)粒為模板，采用表1 中相應(yīng)引物分別經(jīng)PCR 擴(kuò)增，條件為：95 ℃5 min；95 ℃45 s，58 ℃40 s，72 ℃1 min，循環(huán)35 次；72 ℃10 min。采用膠回收試劑盒回收純化PCR 產(chǎn)物后，將純化后的P113 基因和pVAX1 載體分別利用Hind III 和KpnI 雙酶切并回收后利用T4 連接酶16 ℃連接過夜，構(gòu)建重組質(zhì)粒pVAX1-P113。經(jīng)PCR、雙酶切及測序鑒定準(zhǔn)確后，利用BamH I 和對XhoI 對pVAX1-P113 重組質(zhì)粒及純化后的LppA 基因分別雙酶切后，利用快速連接試劑盒連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pVAX1-P113-LppA，并經(jīng)PCR、雙酶切及測序鑒定。

1.3 重組P113/LppA 蛋白表達(dá)的鑒定利用脂質(zhì)體（LipofecttamineTM3000）將重組質(zhì)粒pVAX1-P113-LppA轉(zhuǎn)染MDBK 細(xì)胞，分別設(shè)置空白對照組、空載體pVAX1 對照組，于轉(zhuǎn)染48 h 后收集各組MDBK 細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA 并反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后作為模板，采用表1 中引物，經(jīng)PCR 方法檢測目的基因的轉(zhuǎn)錄情況；同時取各組上述MDBK 細(xì)胞爬片，重組質(zhì)粒pVAX1-P113-LppA 組分別以Mo 陽性血清（1∶50）和Mmc 陽性血清（1∶50）為一抗，以兔抗羊IgG-FITC（1∶500）為二抗，采用間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）[12]檢測目的基因在細(xì)胞中的表達(dá)情況。

1.4 重組質(zhì)粒免疫小鼠后脾淋巴細(xì)胞增殖檢測將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為Elution Buffer 對照組、空載體pVAX1（100 μg）對照組和重組質(zhì)粒pVAX1-P113-LppA 組（100 μg）共3組，每組25只。前3 周每周經(jīng)小鼠腿部肌肉注射免疫一次，共免疫3 次，分別于首免后0、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d通過頜下靜脈方式采血。并在每個時間點(diǎn)頸椎脫臼法迫殺2 只小鼠，無菌采集小鼠脾臟制備脾淋巴細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，采用噻唑藍(lán)比色法（MTT）檢測免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖情況，每個樣本設(shè)3 個重復(fù)孔，試驗(yàn)設(shè)培養(yǎng)基作為陰性對照調(diào)零。同時取首免疫后28 d的脾淋巴細(xì)胞，采用流式染色緩沖液調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)為107個/mL，每管100 μL，向管中加入CD4-FITC、CD8-PE 和PECy5-CD3小鼠單克隆抗體，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾淋巴細(xì)胞中T 淋巴細(xì)胞亞群（CD4+T 淋巴細(xì)胞、CD8+T 淋巴細(xì)胞）的變化。

1.5 免疫小鼠血清中特異性抗體及細(xì)胞因子檢測采集1.4 中各組小鼠各時間點(diǎn)血清，以2.0 μg/孔P113 蛋白或LppA 蛋白作為包被抗原，加入待檢血清（1∶50），以兔抗鼠IgG-HRP（1∶8 000）為二抗，采用間接ELISA 方法檢測每組小鼠血清特異性抗體。另外，利用相應(yīng)試劑盒分別檢測每組小鼠血清細(xì)胞因子（IL-2、IL-4 和IFN-γ）的含量。

1.6 免疫小鼠攻毒保護(hù)性試驗(yàn)分別取末次免疫14 d 后的各組10 只小鼠隨機(jī)分為2 組，分別經(jīng)肌肉注射感染Mo GZ-QX 株（1×108ccu/mL）菌液和Mmc GZ-LD 株（1×108ccu/mL）菌液1 mL，7 d 內(nèi)觀察小鼠的精神、食欲等癥狀，出現(xiàn)其中之一癥狀則判定為發(fā)病，統(tǒng)計(jì)各組小鼠的發(fā)病情況和免疫保護(hù)率，并于攻毒后14 d 將Elution Buffer 對照組和空載體pVAX1 對照組發(fā)病小鼠和重組質(zhì)粒pVAX1-P113-LppA 未發(fā)病小鼠迫殺2 只，取小鼠肺臟組織制作切片，HE 染色后觀察發(fā)病小鼠與免疫小鼠肺部組織的變化。

1.7 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)表示為3 次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；利用SPSS20.0 及GraphPad Prism 7 軟件分析小鼠首次免疫后不同組間0、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d 脾淋巴細(xì)胞增殖、血清特異性抗體及細(xì)胞因子（IL-2、IL-4 和IFN-γ）的差異性，以及分析不同組小鼠末次免疫14 d 后的T 淋巴細(xì)胞亞群（CD4+T 淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞）的變化。P＜0.05 表示差異顯著；P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果分別以pMD19-T-P113 和pMD19-T-LppA 為模板，經(jīng)PCR分別擴(kuò)增到696 bp（P113 基因）和450 bp（LppA 基因）的目的條帶（圖略）。將擴(kuò)增的目的基因分別克隆至pVAX1 中構(gòu)建重組質(zhì)粒pVAX1-P113-LppA，并經(jīng)PCR 鑒定，結(jié)果顯示，擴(kuò)增出約1 100 bp 的目的條帶，而空載體對照無該目的條帶（圖1A）；雙酶切呈現(xiàn)兩條DNA 帶，即載體條帶（2 999 bp）和目的條帶（1 146 bp），而空載體對照僅有一條2 999 bp 條帶（圖1B）。進(jìn)一步測序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒插入片段準(zhǔn)確。上述結(jié)果表明重組質(zhì)粒pVAX1-P113-LppA 構(gòu)建正確。

圖1 重組質(zhì)粒pVAX1-P113-LppA PCR（A）及雙酶切（B）鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of recombinant plasmid pVAX1-P113-LppA using PCR(A)and double enzyme digestion(B)

2.2 重組P113/LppA 蛋白表達(dá)的鑒定結(jié)果提取重組質(zhì)粒pVAX1-P113-LppA 轉(zhuǎn)染的MDBK 細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板經(jīng)PCR 鑒定，結(jié)果顯示，在約700 bp和450 bp處出現(xiàn)目的條帶，而空白對照和空載體均無該目的條帶（圖2），表明目的基因能在MDBK 細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄。取經(jīng)過空載體和重組質(zhì)粒pVAX1-P113-LppA 轉(zhuǎn)染48 h 的MDBK 細(xì)胞，采用IFA 方法檢測目的蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pVAX1-P113-LppA 轉(zhuǎn)染后的MDBK 細(xì)胞出現(xiàn)特異性綠色熒光，而在pVAX1 對照組和正常細(xì)胞對照組中均未觀察到特異性綠色熒光（圖3）。表明構(gòu)建的重組質(zhì)?？稍诓溉閯游锛?xì)胞內(nèi)分別正確表達(dá)目的蛋白。

圖2 P113/LppA RT-PCR結(jié)果Fig.2 P113/LppA RT-PCR results

圖3 目的蛋白表達(dá)的western blot鑒定結(jié)果（×400）Fig.3 Expression results of the target proteins（×400）

2.3 重組質(zhì)粒免疫對小鼠脾淋巴細(xì)胞的影響結(jié)果

2.3.1 重組質(zhì)粒對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響 免疫后各組小鼠在各時間點(diǎn)迫殺2 只小鼠，并無菌取小鼠脾臟制備脾淋巴細(xì)胞懸液， 通過MTT 檢測免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果顯示，pVAX1-P113-LppA 首免后7 d～49 d，小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力均極顯著高于Elution Buffer 對照組和空載體pVAX1 對照組（P＜0.01），重組質(zhì)粒pVAX1-P113-LppA 免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞在首免后28 d 時增殖能力最強(qiáng)，而后緩慢下降，整體水平呈先高后低的趨勢（圖4）。表明重組質(zhì)粒pVAX1-P113-LppA可刺激小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖，增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答。2.3.2 各組小鼠T 淋巴細(xì)胞亞群分析結(jié)果 分別隨機(jī)取首免后28 d 的各組小鼠2 只迫殺后，無菌取脾臟制備脾淋巴細(xì)胞懸液，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組小鼠脾淋巴細(xì)胞中CD4+和CD8+T 淋巴細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例。結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞CD4+T淋巴細(xì)胞的百分比為23.25%，極顯著高于Elution Buffer 對照組和空載體pVAX1 對照組（P＜0.01）；CD8+T淋巴細(xì)胞的百分比為10.05%，顯著高于Elution Buffer 對照組和空載體pVAX1 對照組（P＜0.05）（圖5）。表明重組質(zhì)粒免疫小鼠后能誘導(dǎo)小鼠CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的增殖。

圖4 各組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖情況檢測結(jié)果（OD490nm）Fig.4 Test results of splenic lymphocyte proliferation in mice in each experimental group(OD490nm)

圖5 各組小鼠T淋巴細(xì)胞CD4+、CD8+分子的表達(dá)情況Fig.5 Expression of CD4+and CD8+molecules in T lymphocytes of immunized mice

2.4 免疫小鼠血清中特異性抗體和細(xì)胞因子檢測結(jié)果

2.4.1 免疫小鼠血清中特異性抗體檢測結(jié)果 小鼠在免疫重組質(zhì)粒后14 d 內(nèi)未發(fā)現(xiàn)任何臨床異?，F(xiàn)象。定時采集各組小鼠血清樣品，采用ELISA 法檢測小鼠血清特異性抗體的分泌水平。結(jié)果顯示，通過首免+加強(qiáng)免的方式免疫重組質(zhì)粒后，小鼠血清中P113和LppA抗體水平均呈上升趨勢（圖6A、圖6B），且在免疫7 d～49 d 內(nèi)抗體水平均極顯著高于Elution Buffer對照組和空載體pVAX1對照組（P＜0.01），在初次免疫后49 d 時重組質(zhì)粒免疫組小鼠血清中特異性抗體水平仍為陽性。表明重組質(zhì)粒pVAX1-P113-LppA 能夠刺激小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答，且免疫時效較長。

圖6 各組小鼠抗體檢測結(jié)果（OD630nm）Fig.6 Antibody test results of mice in each immunization group(OD630nm)

2.4.2 免疫小鼠血清中細(xì)胞因子檢測結(jié)果 定時采集各組小鼠血清，利用細(xì)胞因子檢測試劑盒分別檢測小鼠血清IL-2、IL-4、IFN-γ 的含量。結(jié)果顯示，免疫重組質(zhì)粒pVAX1-P113-LppA 后，小鼠血清中IL-2、IL-4 和IFN-γ 的分泌水平均顯著上升（圖7），首免后第28 d 到達(dá)頂峰后緩慢下降，且該組小鼠血清中IL-2、IL-4 和IFN-γ 的分泌量均顯著高于Elution Buffer 對照組和空載體pVAX1 對照組（P＜0.05）。表明重組質(zhì)粒pVAX1-P113-LppA 能刺激小鼠Th1 型細(xì)胞因子（IL-2、IFN-γ）的分泌，也能刺激小鼠Th2型細(xì)胞因子（IL-4）的分泌，進(jìn)而增強(qiáng)小鼠免疫應(yīng)答功能。

圖7 小鼠血清中細(xì)胞因子分泌水平檢測結(jié)果Fig.7 Test results of cytokine secretion level in mouse serum

2.5 免疫小鼠攻毒保護(hù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 實(shí)驗(yàn)動物臨床保護(hù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果 對三免14 d 后各組小鼠進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)各組小鼠發(fā)病情況和免疫保護(hù)率。結(jié)果顯示，在感染Mo 和Mmc后，Elution Buffer 對照組和空載體pVAX1 對照組小鼠均出現(xiàn)精神沉郁、食欲減少和活動減少等發(fā)病癥狀；重組質(zhì)粒pVAX1-P113-LppA 免疫組小鼠在感染Mo 和Mmc 后均有3 只出現(xiàn)精神沉郁等癥狀，保護(hù)率為40%（表2），而未感染支原體的小鼠均未出現(xiàn)任何癥狀。表明重組質(zhì)粒pVAX1-P113-LppA 對小鼠可提供一定抗Mo 和Mmc 感染的能力。

2.5.2 免疫動物組織病理學(xué)檢測結(jié)果 攻毒后14 d迫殺對照組發(fā)病小鼠和重組質(zhì)粒組未發(fā)病小鼠，采集肺臟組織制備病理切片觀察，結(jié)果顯示，未免疫未感染小鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整，無炎癥發(fā)生（圖8A）；Elution Buffer 對照組和空載體pVAX1 對照組小鼠感染Mo 后肺泡結(jié)構(gòu)消失，有大量炎性細(xì)胞浸潤（圖8B、圖8C），而感染Mmc 后肺泡形成了融合性病灶，肺泡結(jié)構(gòu)退化，肺泡壁斷裂，有炎性細(xì)胞浸潤（圖8D、圖8E）；重組質(zhì)粒pVAX1-P113-LppA免疫組小鼠感染Mo/Mmc后肺泡結(jié)構(gòu)較完整，僅有少量炎性細(xì)胞浸潤（圖8F、圖8G）。進(jìn)一步表明重組質(zhì)粒pVAX1-P113-LppA 免疫小鼠后可減輕Mo/Mmc 感染引起的肺組織損傷。

圖8 各組小鼠肺組織病理切片觀察（HE×400）Fig.8 The lung tissue sections of the mice(HE×400)

3 討 論

Mo 是一種能引起綿羊和山羊支原體肺炎的一種致病支原體[13]，Mmc 則僅能引起山羊患病[14]，患病羊主要表現(xiàn)為嚴(yán)重的纖維素性肺炎和胸膜炎，貴州飼養(yǎng)山羊以貴州地方品種為主，羊群支原體病的防控是養(yǎng)羊業(yè)的關(guān)鍵。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在豬肺炎支原體中黏附蛋白P97 蛋白能夠有效引起機(jī)體免疫應(yīng)答，揭示了黏附蛋白作為疫苗靶蛋白的可能性[15]，也有研究發(fā)現(xiàn)牛支原體膜蛋白p59 蛋白具有免疫原性，可作為亞單位疫苗研制的候選蛋白[16]。Mo P113 蛋白是一種重要的黏附分子和膜表面免疫原[17]，Mmc LppA蛋白是支原體細(xì)胞膜上重要的脂膜蛋白[18]，有研究發(fā)現(xiàn)Mo 貴州株P(guān)113 蛋白C 末端基因和Mmc 貴州株LppA 蛋白N 末端基因抗原性較強(qiáng)，可作為亞單位疫苗的候選蛋白，研究結(jié)果與黏附蛋白和脂膜蛋白具有抗原性的結(jié)果相似[19-22]。因此本研究選擇Mo P113蛋白和Mmc LppA 蛋白基因相應(yīng)片段，利用基因工程技術(shù)以pMD19-T-P113 和pMD19-T-LppA 質(zhì)粒為模板構(gòu)建了重組質(zhì)粒pVAX1-P113-LppA，進(jìn)行核酸疫苗初步研究。

血清特異性抗體水平是反應(yīng)機(jī)體體液免疫應(yīng)答水平的一個指標(biāo)，IL-4 屬于典型的Th2 型細(xì)胞因子，主要作用為增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的體液免疫反應(yīng)[23]，血清中特異性抗體及IL-4 分泌水平變化時則可直接反應(yīng)機(jī)體的體液免疫水平。周怡等發(fā)現(xiàn)融合表達(dá)綿羊肺炎支原體TBP30 和Hsp70 基因可刺激小鼠分泌大量特異性抗體及IL-4，增強(qiáng)機(jī)體體液免疫應(yīng)答[24]。本研究也發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒免疫組小鼠免疫后血清中特異性抗體及IL-4 分泌量顯著升高，IL-4 含量升高可使CD4 和45RO+T 細(xì)胞向Th2 細(xì)胞轉(zhuǎn)化，而且還可誘導(dǎo)CD4 和45RA+前體細(xì)胞分化為Th2 效應(yīng)細(xì)胞，增強(qiáng)了小鼠體液免疫應(yīng)答功能。細(xì)胞因子分泌水平、脾淋巴細(xì)胞增殖效率可作為檢測機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答效果的指標(biāo)之一，IL-2、IL-4 和IFN-γ 是機(jī)體內(nèi)的主要細(xì)胞因子，IL-2 和IFN-γ 屬于典型的Th1 型細(xì)胞因子，對增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫反應(yīng)和抗病毒感染有著重要作用[25]。本研究發(fā)現(xiàn)小鼠免疫重組質(zhì)粒后，血清中特異性抗體和脾細(xì)胞增殖率顯著高于空載體對照組和Elution Buffer 對照組，還發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒免疫組CD4+和CD8+T 淋巴細(xì)胞的百分比高于對照組，CD4+和CD8+T 淋巴細(xì)胞的增多可促進(jìn)機(jī)體分泌Th1 型細(xì)胞因子，繼而增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答功能，同時血清IL-2 和IFN-γ 的分泌水平相較于空載體對照組和Elution Buffer 對照組顯著上升，本研究結(jié)果與馬小靜等研究結(jié)果相似[26]。本研究發(fā)現(xiàn)脾細(xì)胞增殖率升高使機(jī)體CD4+和CD8+T 淋巴細(xì)胞增多，使得Th1 型和Th2 型細(xì)胞因子的分泌量上升，小鼠血清IL-4 分泌水平升高可提高機(jī)體體液免疫水平，IL-4 增多可促進(jìn)機(jī)體Th2 細(xì)胞向Th1 細(xì)胞轉(zhuǎn)化，以保證Th1 細(xì)胞的持續(xù)分泌狀態(tài)，從而增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫的功能；IL-2 和IFN-γ 的分泌會使Th1 細(xì)胞的大量增殖，以提高機(jī)體免疫效力。

同時免疫小鼠攻毒保護(hù)性試驗(yàn)結(jié)果也顯示重組質(zhì)粒免疫組小鼠肺臟病變較對照組輕，僅有極少量的炎性滲出物。該結(jié)果進(jìn)一步說明重組質(zhì)粒能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，且對Mo 和Mmc 兩種支原體感染均具有一定的抵抗力，但本研究未對免疫劑量不同是否會導(dǎo)致小鼠免疫應(yīng)答差異進(jìn)行研究，針對免疫保護(hù)率低等問題，可能與本實(shí)驗(yàn)中群體選擇較小、未采用分離病原動物試驗(yàn)，以及免疫小鼠的劑量有關(guān)，對此后續(xù)需要進(jìn)一步試驗(yàn)，以評估重組質(zhì)粒的保護(hù)效果。

本研究結(jié)果首次表明P113 C 末端蛋白和LppA N末端蛋白可作為新型疫苗研發(fā)的候選蛋白，為羊支原體肺炎二價(jià)核酸疫苗的研制提供參考依據(jù)。