祁連山云杉林土壤溶磷細菌的分離及對白三葉的促生效應

李慧萍， 甘雅楠， 韓慶慶， 姚 丹， 陳 佳， 張明旭， 何傲蕾， 張金林， 趙 祺

(蘭州大學農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點實驗室， 蘭州大學草地微生物研究中心， 蘭州大學草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，蘭州大學草地農(nóng)業(yè)科技學院， 甘肅 蘭州 730020)

磷元素是所有生命體必需的元素之一，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)系統(tǒng)中必不可缺。全球土壤平均磷含量約為0.04%。其中，80%～90%與土壤中的Ca2+，F(xiàn)e2+，F(xiàn)e3+和Al3+結(jié)合，形成了無效態(tài)的難溶性磷酸鹽復合物，剩余的10%～20%以緩效磷形式存在，很難被植物直接吸收利用[1-2]。此外，由于磷酸鹽礦石的不可再生特性和土壤缺磷的廣泛現(xiàn)象，導致磷素營養(yǎng)源已成為限制作物產(chǎn)量和品質(zhì)的關鍵因素之一[3-4]。因此，為了解決磷素對可持續(xù)農(nóng)業(yè)的限制問題，高效利用土壤中難溶性磷是解決上述問題的重要出路。

土壤微生物不僅是土壤無機質(zhì)轉(zhuǎn)化的媒介，還是植物營養(yǎng)元素的貯藏庫，更是土壤磷循環(huán)的中心[5-6]。植物根際蘊藏豐富的微生物資源，其中具有溶磷能力的細菌群體在生態(tài)系統(tǒng)的功能調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，這類細菌被統(tǒng)稱為溶磷細菌(Phosphate solubilizing bacteria，PSB)。PSB能夠通過酸化作用、螯合作用、交換反應產(chǎn)生葡萄糖酸等物質(zhì)，將土壤中不可溶的磷轉(zhuǎn)化為植物根系可吸收利用的磷，來滿足植物生長對磷的需求[7-8]。此外，研究表明PSB還能通過提高生物固氮效率，增強其他微量元素(如鐵，鋅)的有效性以及產(chǎn)生植物激素來促進植物生長[8-9]，或產(chǎn)生鐵載體、抗生素和氰化物等物質(zhì)來減緩或抑制病原微生物的活動，保護植物免受土傳病原體的侵害[8]。因此，PSB與植物的相互作用對于提高作物產(chǎn)量和維持土壤肥力具有很大的實用價值。假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和根瘤菌屬(Rhizobium)的菌株通常是具有強溶磷能力的主要PSB[8,10-11]；還有研究表明，PSB菌株在沙雷氏菌(Serratia)、節(jié)桿菌(Arthrobacter)、黃桿菌(Flavobacterium)、葉桿菌(Phyllobacterium)、紅球菌(Rhodococcus)、固氮菌(Azotobacter)、黃單胞菌(Xanthomonas)、腸桿菌(Enterobacter)、伯克霍爾德氏菌(Burkholderia)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、歐文氏菌(Erwinia)、大腸埃希菌(Escherichia)和微球菌(Micrococcus)等屬少量分布[8,10,12]。

祁連山位于青藏、黃土和蒙新三大高原交匯地帶，是我國西部生態(tài)安全屏障的重要組成部分[13]。該地區(qū)氣候類型多變、輻射強、高寒、缺氧、植被類型豐富多樣且空間分布差異明顯[13]。青海云杉(Piceacrassifolia)是祁連山典型森林生態(tài)系統(tǒng)的優(yōu)勢喬木建群種之一[14]。近年來，有關祁連山地區(qū)土壤養(yǎng)分特征、群落結(jié)構(gòu)和微生物多樣性已有較多研究[15-17]。草地生態(tài)系統(tǒng)和森林生態(tài)系統(tǒng)作為祁連山主要的生態(tài)系統(tǒng)，自然條件下,其草地牧草和森林植被的磷素營養(yǎng)很大程度上依賴于土壤微生物對磷的周轉(zhuǎn)[18]。PSB所具備的生理生化特性能使土壤中可利用態(tài)磷素更豐富，使營養(yǎng)物質(zhì)容易被宿主植物吸收，從而促進植物的生長。近年來，已有學者使用微生物分離培養(yǎng)的方法,對祁連山生境中PSB菌株的溶磷能力進行了研究[18]，但關于該生境中的PSB菌株與植物互作方面的相關報道較少。白三葉(TrifoliumrepensL.)作為我國西北地區(qū)的優(yōu)質(zhì)牧草資源，營養(yǎng)價值豐富、產(chǎn)量高、品質(zhì)好。同時，其地上部莖葉繁茂，匍匐莖節(jié)較多，可扎根固定在土壤表面，能夠有效防止水土流失，并對鹽堿脅迫也有一定的耐受性，有利于其生態(tài)建設?？梢姡兹~的培育和生產(chǎn)對于我國西北地區(qū)草牧業(yè)發(fā)展尤為重要[19]。因此，本研究使用選擇性培養(yǎng)基，對祁連山云杉林土壤中的PSB菌株進行分離，分析評價從上述土壤所分離菌株的分類地位和溶磷性能。進一步采用盆栽試驗研究其中四株PSB菌株對白三葉生長的影響，以期為研發(fā)應用于牧草栽培的微生物菌肥提供理論依據(jù)和菌種資源。

1 材料與方法

1.1 土樣采集

供試土樣收集自甘肅境內(nèi)河西走廊南側(cè)的祁連山(38°15′47″ N，99°32′32″ E，海拔2 750 m)林下，采樣地優(yōu)勢植被類型為青海云杉林。隨機選取5個采樣地，去除地表苔蘚層、枯落物和有機質(zhì)層，用五點取樣法對每個樣地進行取樣，采集土層深度為10 cm的土樣。將采集的土樣放置于無菌離心管中，并于4℃便攜式小冰箱中保存，帶回實驗室立即進行溶磷細菌的分離。

1.2 PSB菌株的分離

稱取10 g土樣于100 mL 0.9% 氯化鈉溶液的錐形瓶中，放置25℃、150 r·min-1搖床中振蕩30 min，然后靜置1 h，將土懸液上清緩慢倒入無菌離心管中，5 000 r·min-1離心8 min。離心完成后棄除大部分上清液，重懸剩余部分，吸取10 mL重懸液至滅菌離心管，由此得到10-1的土懸液。取10-1的土懸液1 mL至9 mL 0.9%的無菌氯化鈉溶液得到10-2的土懸液，依此逐級稀釋至10-6。然后，分別取100 μL稀釋后的溶液涂布于難溶性無機磷固體培養(yǎng)基(National botanical research institute phosphorus，NBRIP)：[葡萄糖 10 g·L-1，磷酸鈣5 g·L-1，氯化鎂5 g·L-1，七水硫酸鎂 0.25 g·L-1，氯化鉀 0.2 g·L-1，硫酸銨0.1 g·L-1，瓊脂 15 g·L-1，pH值(7.0±0.2)]。置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天。待培養(yǎng)基上菌落形態(tài)清楚可見，挑取在培養(yǎng)基上產(chǎn)生明顯透明圈的單菌落于NBRIP液體培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)，并收集菌液，再次劃線純化。最后將純化后的菌株，加入甘油保存于-80℃超低溫冰箱。

1.3 PSB菌株的分子生物學鑒定

PSB菌株基因組DNA的提取方法參照趙祺[20]及李惠茹[21]。使用細菌通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′ 擴增菌株16S rRNA基因序列。PCR擴增體系：Taq預混酶(5 U·μL-1)10 μL，正向引物 27F(10 pmol·μL-1)0.5 μL，反向引物 1 492R(10 pmol·μL-1)0.5 μL，模板(細菌基因組DNA)0.5 μL，去離子水8.5 μL。擴增條件：94℃預變性3 min，94℃變性30 s，55℃復性30 s，72℃延伸90 s，進行30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。然后通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物送北京奧科鼎盛生物技術(shù)有限公司測序。通過EzTaxon(https://www.ezbiocloud.net/apps)和Genbank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)在線數(shù)據(jù)庫比對分析上述測序得到的16S rRNA基因序列。使用MEGA 7.0軟件構(gòu)建Neighbor-joining系統(tǒng)進化樹，同時使用Kimura的雙參數(shù)模型計算進化距離，用bootstrap進行檢驗，并重復1 000次。

1.4 PSB菌株溶磷能力分析

將初篩得到的PSB菌株劃線于TSA(15 g·L-1胰蛋白胨，5 g·L-1大豆蛋白胨，5 g·L-1氯化鈉，瓊脂 15 g·L-1，pH值(7.3±0.2)平板上，待培養(yǎng)基上菌落形態(tài)清楚可見。挑取單菌落于TSA液體培養(yǎng)基富集培養(yǎng)，離心收集對數(shù)生長期的菌體。用無菌生理鹽水洗滌對數(shù)生長期的菌體3次后，重懸菌體，并將菌懸液的OD600調(diào)至0.8。取10 μL菌懸液點于NBRIP平板上，并按1%的接種量接種至NBRIP液體培養(yǎng)基，每個處理設置6個重復，28℃恒溫培養(yǎng)。每隔24 h觀察菌株的生長及溶磷情況，并用游標卡尺測量溶磷圈直徑(D)和菌落直徑(d)，根據(jù)D/d比值的大小來初步判斷菌株的溶磷能力[22-23]。用鉬銻抗比色法測定發(fā)酵液的可溶性磷含量[24-25]。

1.5 PSB菌株對白三葉生長的影響

選取菌株LT-4，LT-T17，LT-A20和F1-P7開展促生試驗。首先選取一批籽粒飽滿和色澤形態(tài)一致的白三葉種子(cultivar Huia，由甘肅省農(nóng)業(yè)科學院惠贈)，并用70%的乙醇表面消毒1 min。然后用2%次氯酸鈉消毒10 min后，用無菌水漂洗10次，洗滌過程中不斷攪動。將表面消毒完全的種子浸泡在無菌水中，置于4℃冰箱春化24 h后平鋪于培養(yǎng)皿中進行萌發(fā)。種子種植和生長均在蘭州大學草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室植物生長室進行，培養(yǎng)條件如下：溫度為(28±2)/(23±2)℃(白天/黑夜)，光照周期為14 h/10 h(光照/黑暗)，光強度為800 μmol·m-2·s-1，相對濕度為(70±10)%。待種子長出子葉后，挑取萌發(fā)整齊的種子移入滅菌蛭石中，并在生長10天后進行間苗，每盆留1株長勢一致的白三葉幼苗。對每株幼苗莖基部接種2 mL OD600=0.8的菌懸液，同時接種等量的無菌生理鹽水和大腸桿菌(EscherichiacoliDH5α)作為空白和陰性對照。接菌20天后取樣，用刻度尺測量株高和根長；用稱重法測定植株鮮干重；葉綠素含量和根系活力測定方法參考He等[26]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010 整理數(shù)據(jù)，SPSS 19.0 進行單因素方差分析(P<0.05)及差異顯著性檢驗，并采用Duncan法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 PSB菌株的篩選及溶磷能力定性分析

以菌株在NBRIP平板上是否產(chǎn)生明顯、清晰的溶磷圈為篩選依據(jù)，初步獲得12株具有溶磷能力的菌株(圖1)。純化初篩獲得的菌株，對其溶磷特性進行分析，發(fā)現(xiàn)上述PSB菌株在NBRIP固體培養(yǎng)基中的生長特性和溶磷能力存在顯著差異(P<0.05)(表1)。結(jié)果顯示，12株PSB菌株的菌落直徑、溶磷圈直徑和D/d的比值范圍分別為0.54～0.70，0.84～1.67和1.44～2.40。其中，菌株LT-0的菌落直徑最大，F(xiàn)1-P7次之，LT-N17的菌落直徑最小。與之對應的菌落直徑分別為：0.70 cm，0.68 cm和0.54 cm。溶磷圈直徑最大的為菌株LT-0，F(xiàn)1-P7次之，LT-A18最小，其值分別為：1.67 cm，1.56 cm和0.84 cm。菌株LT-0的D/d比值最大，F(xiàn)1-P7次之，LT-A18最小，其值分別為：2.40，2.28和1.44。此外，菌株LT-2和菌株LT-4的菌落直徑比較接近，兩者無顯著差異，且溶磷圈直徑及D/d的比值也無顯著差異。

圖1 PSB菌株的NBRIP平板初篩結(jié)果

表1 12株PSB菌株的溶磷能力定性分析(平均值±標準誤，n =6)

2.2 PSB菌株的16S rRNA基因序列分析

根據(jù)16S rRNA基因序列的鑒定和系統(tǒng)進化樹分析，結(jié)果顯示篩選獲得的12株PSB菌株均屬于假單胞菌屬(Pseudomonas)。表2和圖2分別是基于16S rRNA基因序列的相似度比對結(jié)果和系統(tǒng)進化樹。其中，與菌株LT-2和LT-4的16S rRNA基因序列比對相似度最高的典型菌株皆為假單胞菌屬的Pseudomonasyamanorum8H1T；系統(tǒng)進化樹結(jié)果表明，菌株LT-2和LT-4與Pseudomonasyamanorum8H1T的親緣關系最近。菌株LT-A11，LT-N11，LT-N17和LT-A18均與假單胞菌屬的典型菌株PseudomonassilesiensisA3T的16S rRNA基因序列相似度最高；基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)進化樹表明，這四株菌均與PseudomonassilesiensisA3T的親緣關系最為相近。菌株LT-0的16S rRNA基因序列比對相似度與PseudomonasluteolaKS0921T最高；系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示，菌株LT-0與PseudomonasluteolaKS0921T位于同一分支，兩者親緣關系最近。菌株F1-P7的16S rRNA基因序列相似度與Pseudomonasbrassicacearumsubsp.neoaurantiacaCIP 109457T最高；系統(tǒng)進化樹結(jié)果表明，菌株F1-P7與Pseudomonasbrassicacearumsubsp.neoaurantiacaCIP 109457T位于同一分支，兩者親緣關系最近。菌株LT-A20，LT-N10，LT-A19和LT-T17的16S rRNA基因序列相似度最高及系統(tǒng)進化樹中親緣關系最相近的菌株均分別為PseudomonasfrederiksbergensisJAJ28T，PseudomonasmarginalisATCC 10844T，PseudomonassalomoniiCFBP 2022T和PseudomonasavellanaeBPIC 631T。因此，在菌株溶磷能力定性分析和進化分析的基礎上，選取了D/d比值較高的4株菌株LT-0，LT-4，F(xiàn)1-P7，LT-A20及D/d比值相對較低但其分類地位與其他菌株較遠的菌株LT-T17進行下一步溶磷能力定量分析。

表2 基于16S rRNA基因序列的PSB菌株的鑒定

圖2 基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)進化樹

2.3 PSB菌株的溶磷能力定量分析

菌株LT-T17，LT-0，F(xiàn)1-P7，LT-4和LT-A20的溶磷能力定量分析結(jié)果如圖3所示。所有菌株在NBRIP液體搖瓶中產(chǎn)生的可溶性磷含量隨培養(yǎng)時間而顯著變化，并且48 h內(nèi)可溶性磷含量增長較快。其中，菌株LT-0，F(xiàn)1-P7和LT-4發(fā)酵液的可溶性磷在96 h達到最大值，其值分別為431.68 μg·mL-1，441.67 μg·mL-1和479.87 μg·mL-1。菌株LT-A20在144 h時，發(fā)酵液的可溶性磷含量達到峰值，其值為490.22 μg·mL-1。而菌株LT-T17培養(yǎng)液的可溶性磷含量隨時間變化的峰值現(xiàn)象不明顯，且可溶性磷含量的最大值為388.48 μg·mL-1。

圖3 5株PSB菌株在NBRIP液體培養(yǎng)基中的溶磷能力定量分析

此外，菌株在溶解難溶性無機磷酸鹽的過程中會伴隨著發(fā)酵液pH值的下降。在培養(yǎng)過程中，5株菌株發(fā)酵液的pH值隨培養(yǎng)時間的變化情況如圖4所示。其中，菌株LT-0，F(xiàn)1-P7和LT-4發(fā)酵液的pH值在24 h內(nèi)下降速度最快，pH值分別降低了2.87，2.84和2.77。隨著培養(yǎng)時間的增加，菌株LT-0，F(xiàn)1-P7和LT-4發(fā)酵液的pH值緩慢增加。但在144 h后，菌株LT-0和LT-4發(fā)酵液的pH值呈現(xiàn)下降趨勢。菌株LT-A20培養(yǎng)液的pH值在48 h內(nèi)降低了2.4，之后基本趨于穩(wěn)定。而菌株LT-T17發(fā)酵液的pH值在24 h時略有增加，之后隨培養(yǎng)時間的增長而降低，并于72 h后基本趨于穩(wěn)定。

2.4 PSB菌株對白三葉生長的影響

2.4.1PSB菌株對白三葉株高和根長的影響 基于系統(tǒng)進化分析和菌株溶磷能力結(jié)果，對菌株LT-4，LT-T17，F(xiàn)1-P7和LT-A20接種白三葉后植株的生長效應進行了研究(圖5)。與空白對照相比，接種菌株LT-4，LT-T17，LT-A20和F1-P7后，白三葉株高分別增加了13.27%，3.26%，2.81%和1.35%(圖5c)，根長分別是空白對照的1.14，1.09，0.91和0.96倍(圖5 d)。接種菌株LT-4的白三葉株高的增加與空白對照相比差異顯著(P<0.05)，菌株LT-T17，F(xiàn)1-P7和LT-A20對白三葉株高和根長的增加效果與空白對照相比差異不顯著。另外與陰性對照(大腸桿菌DH5α)相比，經(jīng)菌株LT-4和LT-T17處理的白三葉株高分別增加了12.51%和2.57%(圖5c)，根長分別是陰性對照的1.07和1.02倍(圖5 d)，并且接種菌株LT-4的白三葉株高的增加與陰性對照相比也存在差異顯著(P<0.05)。經(jīng)菌株F1-P7和LT-A20處理的白三葉株高和根長與陰性對照相比差異不顯著。根據(jù)上述結(jié)果表明，接種菌株LT-4對白三葉株高增加效果顯著；接種菌株LT-4對白三葉根長的增加效果雖未達到顯著差異，但其根長在所有處理中是最長的。

圖5 不同PSB菌株對白三葉株高和根長的影響(平均值±標準誤，n =6)

2.4.2PSB菌株對白三葉生物量積累的影響 如圖6所示，主要展示了本研究中篩選的PSB菌株對白三葉生物量積累的影響。與空白對照相比，接種菌株LT-4和LT-T17的白三葉的生物量積累增加效果較為明顯。菌株F1-P7對白三葉地上部鮮干重和地下部鮮干重的增加效果均低于空白對照。菌株LT-A20對白三葉地上部鮮重和地下部鮮重的增加效果均低于空白對照，但對白三葉地上部干重和地下部干重的增加效果均略高于空白對照。接種菌株LT-4和LT-T17后白三葉地上部鮮重分別是空白對照的1.13和1.05倍，地下部鮮重分別是空白對照的1.25和1.19倍(圖6a，6b)；地上部干重分別增加了87.01%和45.12%，地下部干重分別增加了74.83%和49.57%(圖6c，6d)。接種菌株LT-4的白三葉地上部干重和地下部干重的增加與空白對照相比差異顯著(P<0.05)。

同空白對照結(jié)果類似，經(jīng)菌株LT-4和LT-T17處理的白三葉生物量積累較陰性對照增加效果明顯。接種菌株F1-P7的處理中，白三葉地上部鮮干重和地下部鮮干重的增加均低于陰性對照。接種菌株LT-A20的處理中，白三葉地上部鮮重和地下部鮮重的增加低于陰性對照，但白三葉地上部干重增加略高于陰性對照，白三葉地下部干重的增加與陰性對照相同。接種LT-4和LT-T17的白三葉地上部鮮重分別是陰性對照的1.33和1.24倍，地下部鮮重分別是陰性對照的1.71和1.63倍(圖6a，6b)；地上部干重分別是陰性對照的1.91和1.48倍，地下部干重分別是陰性對照的1.44和1.23倍(圖6c，6d)。上述結(jié)果顯示，菌株LT-4對白三葉生物量積累的提高效果最為顯著(P<0.05)，菌株LT-T17次之；而接種菌株F1-P7和LT-A20對白三葉生物量積累無顯著提高。

圖6 不同PSB菌株對白三葉生物量積累的影響(平均值±標準誤，n =6)

2.4.3PSB菌株對白三葉根系活力和葉綠素含量的影響 接種PSB菌株對白三葉根系活力和葉綠素含量的影響如圖7所示。接種LT-4，LT-T17，LT-A20和F1-P7后，白三葉根系活力分別是空白對照的3.09，1.75，1.72和1.24倍，是陰性對照的2.82，1.60，1.57和1.13倍(圖7a)。菌株LT-4，LT-T17和LT-A20對白三葉根系活力的增加效果與空白對照相比差異顯著(P<0.05)。但與陰性對照相比，僅菌株LT-4對白三葉根系活力的增加效果差異顯著(P<0.05)。

經(jīng)菌株LT-4，LT-T17，LT-A20和F1-P7接種處理的白三葉，葉綠素a含量分別是空白對照的1.88，1.57，1.57和1.29倍(P<0.05)，葉綠素b含量分別是空白對照的1.27，1.01，1.12和0.92倍，且菌株LT-4對白三葉葉綠素b含量的增加效果與空白對照相比差異顯著(P<0.05)。接種PSB菌株LT-4，LT-T17，F(xiàn)1-P7和LT-A20后，葉綠素a含量分別是陰性對照的1.56，1.31，1.31和1.07倍(P<0.05)，葉綠素b含量分別是陰性對照的1.41，1.12，1.24和1.02倍(圖7b)，且菌株LT-4對白三葉葉綠素b含量的增加效果與陰性對照相比差異顯著(P<0.05)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，菌株LT-4與空白對照以及陰性對照相比，提升白三葉葉綠素含量的效果最為顯著(P<0.05)。因此，根據(jù)PSB菌株對白三葉根系活力和葉綠素含量的影響，發(fā)現(xiàn)菌株LT-4對白三葉根系活力和葉綠素含量提高的效果最為顯著(P<0.05)。

圖7 不同PSB菌株對白三葉根系活力和葉綠素含量的影響(平均值±標準誤，n =6)

3 討論

溶磷細菌(PSB)是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，它的生命活動直接或間接地影響著土壤健康[25,27]。長久以來，研究者們期望從不同的生態(tài)環(huán)境中篩選到強效的PSB。祁連山作為我國西部重要的生態(tài)安全屏障，氣候多變，植被類型多樣。這種獨特而極端的生境中蘊藏著豐富的微生物資源，具有較高的研究價值[13,28]。張宇龍等[18]從東祁連山高寒草地土壤中篩選出三株具有較好溶無機磷能力的菌株。因此本研究聚焦于祁連山典型森林生態(tài)系的優(yōu)勢植被—云杉林，采用以磷酸鈣為唯一難溶性磷源的選擇性培養(yǎng)基從其生長的根際土壤中分離篩選出12株具有溶解磷酸鈣能力的菌株，經(jīng)16S rRNA基因序列的相似度比對和系統(tǒng)進化樹分析，發(fā)現(xiàn)12株PSB均為Pseudomonas屬的菌株，與之前學者們得出PSB的優(yōu)勢菌屬是假單胞菌這一研究結(jié)果相吻合[8,10]。

PSB增溶難溶性磷的主要方式之一是通過分泌有機酸類物質(zhì)，產(chǎn)生的有機酸類物質(zhì)通過羥基和羧基螯合與磷酸鹽結(jié)合的陽離子，或通過釋放H+降低pH值，最終提供可溶性的磷酸鹽供有機體生長所需[18,27,29-31]。因此，在PSB發(fā)揮功能的過程中，會伴隨著pH值的下降，并且與菌株自身的溶磷能力密切相關。Pande等[32]采用磷酸三鈣為唯一磷源的培養(yǎng)基，共分離鑒定出8個PSB菌株，其中3株具有較高的溶磷能力，其發(fā)酵液的可溶性磷含量在277.72～305.49 μg·mL-1之間，pH值下降到3.08～3.82之間。韓麗珍等[31]對2株具有較強溶磷能力的芽孢桿菌的溶磷機制研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)液中的可溶磷含量與pH值呈顯著負相關。本研究發(fā)現(xiàn)菌株LT-4，F(xiàn)1-P7和LT-A20在培養(yǎng)6天時，發(fā)酵液的可溶性磷含量峰值在441.67～490.22 μg·mL-1之間，說明這三株菌株具有較好的溶解無機磷的能力。在這一過程中，發(fā)酵液的pH值降至5.12～4.36之間，進一步驗證了難溶性磷增溶與pH值密切相關，且呈負相關。由上可見，本研究從祁連山云杉林下采集的土壤中，篩選到具有較強溶磷性能的PSB菌株，蘊藏著巨大的開發(fā)價值，有望為開發(fā)高效的生物溶磷菌肥提供菌種資源。

PSB作為一類優(yōu)良的根際促生菌，主要是通過增加難溶性磷的溶解，提高土壤有效磷含量，易于為植物吸收利用，從而促進植物的生長[27]。在可持續(xù)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，常采用根際微生物管理的方法來提高磷對作物的生物有效性，以達到促進農(nóng)作物生物量積累，提高其單產(chǎn)量的目的[8]。研究表明，無論是盆栽還是田間試驗，接種溶磷微生物都可以促進植物生長和提高農(nóng)作物產(chǎn)量[12,24,29,32-33]，如李玉娥等[29]發(fā)現(xiàn)在盆栽條件下接種具有溶磷能力的解淀粉芽孢桿菌LM12和LM18后，苜蓿(Medicagosativa L.)株高分別增加43.9%和19.0%，干重分別增加24.5%和29.6%。關于PSB菌株對農(nóng)作物的促生已有較多研究，但對牧草促生方面的相關報道較少[12,24,29,34]。呂俊等[12]從貴陽市花溪區(qū)馬尾松人工林中篩選出1株溶磷效果最優(yōu)的菌株Burkholderiasp．WJ27，其接種劑能夠分別提高馬尾松(PinusmassonianaL.)幼苗地上部鮮重，干重和根系鮮重，干重44.7%，60.0%，158.3%和100.0%。本研究獲得的PSB菌株中LT-4可顯著提高白三葉的株高、根長和鮮干重。接種LT-4的白三葉，其根系活力和葉綠素含量也得到顯著增加，由此可知，接種菌株LT-4能顯著促進白三葉根系發(fā)育以及提升其光合作用能力，最終表現(xiàn)為植物的生物量積累。這也驗證了呂俊等[12]的研究結(jié)果，即PSB菌株的溶磷能力和促生效果之間存在一定的相關性。此外，溶磷能力和促生效果的相關性還可能來源于菌株LT-4分泌的有機酸類物質(zhì)，其將不溶性的磷酸鹽轉(zhuǎn)化為可溶態(tài)供植物生長所需，菌株LT-4分泌的有機酸種類及相關作用機制有待進一步研究。此外，PSB菌株LT-4對其他牧草的促生穩(wěn)定性和復合接種效果也需進一步展開試驗進行驗證。然而在本研究中發(fā)現(xiàn)篩選獲得的同屬不同種的PSB菌株F1-P7和LT-A20也具有較好的溶磷能力，但對白三葉的生長無明顯促生效果。正如Taurian等[35]研究結(jié)果，菌株J157可以產(chǎn)生較大的溶磷圈，但對花生(ArachishypogaeaL.)產(chǎn)量沒有明顯的影響。這可能與菌株的遺傳變異的多樣性以及對宿主的選擇性密切相關，這也是植物與微生物相互作用的研究熱點，尚待于進一步從分子機制和生理機制深入挖掘。

4 結(jié)論

從祁連山云杉林下采集的土樣中共分離篩選到12株PSB菌株，系統(tǒng)進化分析表明這12株PSB菌株都屬于假單胞菌屬。通過溶磷定量分析后，獲得了5株具有較好溶磷能力的菌株(LT-A20，LT-4，F(xiàn)1-P7，LT-0和LT-T7)。接種牧草白三葉結(jié)果表明，菌株LT-4和LT-T17皆可促進白三葉的生長，以菌株LT-4效果最佳。本研究獲得的菌株LT-4因其所具有的高溶磷性能和強促生效應可作為開發(fā)栽培牧草專用微生物菌劑或菌肥的菌種資源。