NEFL通過激活EGFR/AKT/S6信號通路促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的侵襲遷移

范志露，楊荔艷，張娜，馮丹，郭靜，常晨，苑青，蔡巖，張鈺，魏文強(qiáng)，王明榮，郝佳潔

NEFL通過激活EGFR/AKT/S6信號通路促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的侵襲遷移

范志露1，楊荔艷2，張娜1，馮丹1，郭靜1，常晨1，苑青1，蔡巖1，張鈺1，魏文強(qiáng)3，王明榮1，郝佳潔1

1. 國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院，分子腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021 2. 國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100021 3. 國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院流行病學(xué)中心，北京 100021

為探討神經(jīng)絲輕鏈(neurofilament light chain, NEFL)在食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)中的表達(dá)情況及作用機(jī)制，本研究首先對食管鱗癌組織及配對的正常食管上皮中的mRNA和蛋白表達(dá)情況進(jìn)行了檢測?；虮磉_(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus, GEO) RNA表達(dá)數(shù)據(jù)，以及臨床標(biāo)本的實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄–聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative reverse transcription PCR, qRT-PCR)分析結(jié)果顯示，與正常食管上皮組織相比，食管鱗癌組織中基因mRNA水平明顯升高。Western blot分析結(jié)果顯示，與正常食管上皮組織相比，食管鱗癌組織中NEFL蛋白水平也明顯升高。進(jìn)一步采用CCK8法和Transwell法檢測NEFL過表達(dá)對食管鱗癌細(xì)胞惡性表型的影響，結(jié)果顯示敲降后，食管鱗癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力顯著減弱。體內(nèi)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)顯示，敲降可顯著抑制腫瘤生長。分子水平檢測表明，敲降顯著升高上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相關(guān)分子E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達(dá)并降低N-鈣黏蛋白(N-cadherin)的表達(dá)、下游分子表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)的mRNA和蛋白的表達(dá)水平，蛋白激酶B (protein kinase B, PKB；又被稱為AKT)和核糖體蛋白S6 (ribosomal protein S6)的磷酸化水平也顯著降低。敲降后轉(zhuǎn)染EGFR過表達(dá)載體，AKT和S6的磷酸化水平以及食管鱗癌細(xì)胞侵襲和遷移表型都得以恢復(fù)。以上研究結(jié)果表明，NEFL過表達(dá)可能通過激活EGFR/AKT/S6信號通路促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞EMT，最終促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的侵襲遷移。

NEFL；食管鱗癌；侵襲遷移；EGFR；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

食管鱗癌是中國常見的消化道惡性腫瘤之一[1,2]。在食管鱗癌早期，絕大多數(shù)患者沒有出現(xiàn)明顯癥狀，且一部分患者在早期就發(fā)生了局部浸潤和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。晚期食管鱗癌患者的治療效果和預(yù)后不佳，導(dǎo)致食管鱗癌患者的五年生存率較低[3]。因此，迫切需要深入研究食管鱗癌細(xì)胞惡性行為的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)具有臨床應(yīng)用前景的治療靶點(diǎn)，以提高食管鱗癌患者的生存率。

基因定位于染色體8p21，編碼蛋白的分子量為68 kDa。NEFL是神經(jīng)元骨架蛋白之一，其作為神經(jīng)絲的重要組成成分，對維持神經(jīng)元的完整性至關(guān)重要[4]。研究表明，NEFL可以維持神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)，并調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)向軸突和樹突的轉(zhuǎn)運(yùn)過程[5]。研究報(bào)道，NEFL除了在神經(jīng)元疾病中發(fā)揮明確作用外，NEFL在胃癌和乳腺癌組織中表達(dá)升高[6,7]。然而，與正常組織相比，神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的NEFL表達(dá)降低[8]。此外，NEFL高表達(dá)與乳 腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和非小細(xì)胞肺癌的良好預(yù)后相關(guān)[7,9,10]。上述結(jié)果表明，NEFL在實(shí)體瘤中的作用和功能需要進(jìn)一步闡明。本研究檢測了基因在食管鱗癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)情況，并分析了其異常表達(dá)對食管鱗癌細(xì)胞生物學(xué)表型的影響，為闡明在食管鱗癌中的意義提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 食管鱗癌臨床樣本

27例食管鱗癌組織及配對的正常食管上皮組織于2011～2012年取自河南省林州市食管癌醫(yī)院。所有患者手術(shù)前未接受過任何治療，所有標(biāo)本均為病理診斷后的剩余標(biāo)本。本研究已獲得中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)(No. 16-171/1250)，所有患者均已簽署書面知情同意書。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

食管鱗癌細(xì)胞系KYSE30、KYSE70、KYSE140、KYSE150、KYSE180、KYSE450和KYSE510細(xì)胞為日本東京大學(xué)Shimada教授惠贈，TE1細(xì)胞購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection, ATCC)公司，均使用含10%胎牛血清(NEWZERUM)的RPMI 1640培養(yǎng)基(北京細(xì)工生物公司)，置于37℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。人胚腎細(xì)胞293FT (美國Invitrogen公司)使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基(北京細(xì)工生物公司)，添加1% L型谷氨酰胺、1%非必需氨基酸以及1% Geneticin (美國Gibco公司)，置于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 過表達(dá)載體構(gòu)建

利用RNA純化試劑盒(北京康為世紀(jì)公司)從食管鱗癌細(xì)胞中提取RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京康為世紀(jì)公司)獲得cDNA，以該cDNA為模板進(jìn)行PCR獲得和基因編碼區(qū)全長。使用真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/Myc-His C構(gòu)建瞬時過表達(dá)載體。用于構(gòu)建基因瞬時過表達(dá)載體的引物序列：上游：5′-CCAAGCTTATGAGTTCCTTC-AGCTA-CGA-3′，下游：5′-CGGAATTCGATCTTT-CTTCTTA-GCTGCTTG-3′；用于構(gòu)建基因瞬時過表達(dá)載體的引物序列：上游：5′-GGTACC-ATGCGACCCTC-CGGG-3′，下游：5′-CTCGAGCT-GCTCCAATAAA-TTCACTGCT-3′。

1.4 慢病毒包裝和靶細(xì)胞感染

慢病毒干擾載體pLKO.1 puro以及慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2G均為本實(shí)驗(yàn)室保存質(zhì)粒載體。取對數(shù)生長期的293FT細(xì)胞接種于6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞匯合度為80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，加入含18 μL Lipofectamine 2000 (美國Invitrogen公司)、6 μg pLKO.1、3 μg psPAX2、3 μg pMD2G的Opti-MEM溶液(美國Gibco公司)，6 h后更換成2.5 mL含30%胎牛血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，24 h和48 h后各收集一次上清，用0.45 μm濾膜過濾，保存于–80℃冰箱。感染靶細(xì)胞時，將0.5 mL病毒上清和1.5 mL完全培養(yǎng)基加入到含密度為30%～50%的靶細(xì)胞的六孔板中，并加入8 mg/mL poly-brene，培養(yǎng)24 h后更換為完全培養(yǎng)基，利用2 μg/mL嘌呤霉素進(jìn)行篩選。干擾NEFL表達(dá)的慢病毒shRNA (shNEFL)序列：上游5?-CCGGGCACGCTCAGCTT-ACTCAACTCGAGTTGAGTAAGCTGAGCGTGCTT-TTTG-3?，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.5 siRNA/質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長期細(xì)胞接種至六孔板中，37℃培養(yǎng)12 h，待密度為30%～50%時進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染(待密度約為80%時進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染)，每孔細(xì)胞采用A：5 μL siRNA (2 μg質(zhì)粒)+250 μL Opti-MEM；B：5 μL Lipofectamine 2000+250 μL Opti-MEM，A和B先單獨(dú)孵育5 min，后混合孵育20 min。在上述混合孵育20 min期間，可以將上述要轉(zhuǎn)染的六孔板換成RPMI 1640培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)6 h后更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。瞬時敲降基因的siRNA序列為：5?- GUCCUACUACA-CCAGCCAUTT-3? (siNEFL-1)和5?- GCACGCUCAG-CUUACUCAATT-3? (siNEFL-2)，由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成。

1.6 總RNA提取和實(shí)時定量qRT-PCR

采用組織&細(xì)胞RNA純化試劑盒(北京康為世紀(jì)公司)提取純化總RNA。將得到的RNA作為模板，使用HiFiScript cDNA合成試劑盒(北京康為世紀(jì)公司)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用TB Green?Premix Ex TaqTM試劑盒(日本TaKaRa公司)及ABI Quant-Studio 5進(jìn)行實(shí)時定量qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。以基因mRNA表達(dá)水平為參照，進(jìn)行歸一化處理，獲得靶基因的相對mRNA表達(dá)水平。本實(shí)驗(yàn)中使用的引物序列如下：正向引物：5′-CCAGAGCTC-CCAGGTCTTTG-3′，反向引物：5′-TAGTA-GGACGGGAAGGAGCG-3′；正向引物：5′- GCAGAGACCCACACTACCAG-3′，反向引物：5′-TGTGCTGTTGACACAGGTGG-3′；正向引物：5′-ACCCACTCCTCCACCTTTGA-3，反向引物：5′-CATACCAGGAAATGAGCTT-GACAA-3′。

1.7 蛋白提取和Western blot實(shí)驗(yàn)

培養(yǎng)細(xì)胞至對數(shù)生長期時收獲(對于轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，則于轉(zhuǎn)染48 h后收獲)，用細(xì)胞刮刮取細(xì)胞于收集管中，1000 r/min離心5 min，棄上清獲得細(xì)胞沉淀。加入適量蛋白裂解液(上海碧云天公司)，冰上裂解30 min，12000 r/min，4℃離心15 min，取上清移至新的離心管中。臨床標(biāo)本蛋白采用組織蛋白提取試劑盒提取(美國Invent Biotechnologies公司)。使用BCA蛋白定量試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)進(jìn)行蛋白定量。取一定體積的蛋白樣品，加入5×上樣緩沖液，98℃金屬浴中變性10 min，瞬時離心。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳90 min，使用濕轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)儀將蛋白從分離膠轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride, PVDF)，用5%脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗后4℃孵育過夜。一抗包括：購自美國Cell Signaling Technology公司的E-cadherin、磷酸化EGFR、磷酸化AKT、AKT、磷酸化S6、S6抗體，購自美國Proteintech公司的N-cadherin、EGFR、GAPDH、His標(biāo)簽抗體，購自美國ABclonal公司的NEFL。使用洗滌緩沖液TBST清洗4次，每次6 min，加入相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h，TBST清洗4次，每次6 min，使用Amersham Imager 800成像儀進(jìn)行曝光。

1.8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

收集細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)，KYSE70和KYSE140分別取1000個和2000個細(xì)胞，接種于96孔板中，親本組、NC組和基因敲降組均設(shè)置4個平行孔和空白對照孔，于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后開始，每天同一時間取出一塊96孔板進(jìn)行檢測。每孔加入100 μL CCK8稀釋液(購自日本同仁化學(xué)；使用RPMI 1640按1∶10比例稀釋)，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。使用酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)在450 nm處測量吸光度值，計(jì)算相對生長速率，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.9 細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)

使用直徑6.5 mm，孔徑8 μm的Transwell檢測細(xì)胞侵襲和遷移能力。對于遷移實(shí)驗(yàn)，預(yù)先在小室中加入100 μL不含血清的培養(yǎng)基水化2 h，細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，消化收集目的細(xì)胞，用不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基懸浮并計(jì)數(shù)。在Transwell下室加入750 μL含30%血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，上室加入200 μL含1～2×105個細(xì)胞的懸液，將Transwell板置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(KYSE70培養(yǎng)60 h，KYSE140培養(yǎng)48 h)，取出小室，用磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline, PBS)清洗1次，用固定液(甲醇∶丙酮=1∶1)固定1 h，再用0.5%結(jié)晶紫染色30 min，用流水沖洗小室，并小心擦拭掉上層細(xì)胞，用中性樹膠進(jìn)行封片，于鏡下拍照計(jì)數(shù)。對于侵襲實(shí)驗(yàn)，預(yù)先在小室中加入50 μL稀釋好的Matrigel基質(zhì)膠，置于CO2培養(yǎng)箱中，37℃孵育2 h，其余操作同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.10 裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)

無特定病原體(specific pathogen free, SPF)級4周齡雌性BALB/cA-nu裸鼠(北京華阜康生物科技股份有限公司)，實(shí)驗(yàn)前稱量體重，按照體重分組，使不同體重的裸鼠在各組間平均分布。將生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細(xì)胞消化，PBS清洗兩遍，重懸于PBS中計(jì)數(shù)，將含3×106個/100 μL濃度的細(xì)胞接種于裸鼠上肢腋下部位。待瘤體長出后每周測量2次皮下瘤體積。計(jì)算公式為：體積=長徑×短徑×短徑×0.52。3周后處死裸鼠，解剖并稱量瘤體體積和質(zhì)量。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism8.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，檢驗(yàn)用于評估實(shí)驗(yàn)組和對照組之間的差異，< 0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 NEFL在食管鱗癌組織中高表達(dá)

本研究利用GEO數(shù)據(jù)集GSE23400分析了食管鱗癌中基因mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果表明，與正常組織相比，基因mRNA在食管鱗癌中表達(dá)明顯升高(= 53，< 0.0001) (圖1A)。進(jìn)一步檢測了27例食管鱗癌及配對的正常食管上皮組織中基因mRNA和蛋白水平，結(jié)果顯示，與正常組織相比，27例腫瘤組織的基因mRNA水平(圖1B)和蛋白水平(圖1，C和D)顯著上調(diào)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 NEFL在食管鱗癌細(xì)胞中高表達(dá)

使用癌細(xì)胞系百科全書(Cancer Cell Lines Ency-clopedia, CCLE)數(shù)據(jù)庫中的基因表達(dá)數(shù)據(jù)集分析了來自不同癌癥類型的細(xì)胞系中基因mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果表明，在食管鱗癌細(xì)胞系中高表達(dá)。與其他腫瘤細(xì)胞系相比，食管鱗癌細(xì)胞系中基因mRNA表達(dá)的平均值排名第5 (圖2A)，中位值排名第7 (圖2B)。隨后，進(jìn)一步分析了NEFL蛋白在8個食管鱗癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示NEFL蛋白在KYSE70和KYSE140細(xì)胞中高表達(dá)，而在KYSE30、KYSE150、KYSE180、KYSE450、KYSE510和TE1細(xì)胞中低表達(dá)(圖2C)。

圖1 NEFL基因在食管鱗癌組織中的表達(dá)情況

A：GEO數(shù)據(jù)集GSE23400中基因mRNA在食管鱗癌組織中的表達(dá)量高于配對的食管正常上皮組織(= 53)；B：qRT-PCR檢測食管鱗癌和配對食管正常上皮組織中基因mRNA的相對表達(dá)量(= 27)，使用2–ΔΔCt法計(jì)算相關(guān)基因表達(dá)量；C：Western blot檢測在食管鱗癌和配對食管正常上皮組織中NEFL蛋白表達(dá)水平(= 27)，以GAPDH為內(nèi)參；D：使用Image J.2.6計(jì)算對應(yīng)蛋白條帶灰度值：蛋白的相對表達(dá)=靶蛋白的灰度值/GAPDH的灰度值。N：正常組織；T：腫瘤組織。*< 0.05, **< 0.01, ***< 0.001, ****< 0.0001。

圖2 NEFL基因mRNA和蛋白水平在食管鱗癌細(xì)胞系中的表達(dá)

A和B：使用CCLE中的基因表達(dá)數(shù)據(jù)集分析不同腫瘤細(xì)胞系中基因mRNA表達(dá)的平均值(A)和中位值(B)；C：Western blot檢測8個食管鱗癌細(xì)胞系中NEFL蛋白的表達(dá)。

2.3 NEFL過表達(dá)促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的增殖

選取NEFL蛋白表達(dá)水平較高的KYSE70和KYSE140細(xì)胞系進(jìn)行敲降實(shí)驗(yàn)。在KYSE70和KYSE140細(xì)胞系中敲降后(圖3A)，檢測細(xì)胞增殖能力的變化。結(jié)果表明，在敲降后48 h內(nèi)，基因敲降組和對照組之間的細(xì)胞增殖能力沒有顯著差異，但在基因敲降兩天后，基因敲降組的細(xì)胞增殖能力略低于對照組(圖3B)。

2.4 NEFL過表達(dá)促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的侵襲和遷移

在KYSE70和KYSE140細(xì)胞系中敲降后，檢測了食管鱗癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力的變化。結(jié)果表明，敲降組的細(xì)胞穿過聚碳酯膜數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于對照組(< 0.001) (圖4，A和B)。同時，本課題組構(gòu)建了pcDNA3.1-NEFL瞬時過表達(dá)載體，選取NEFL低表達(dá)細(xì)胞系KYSE510外源過表達(dá)NEFL。結(jié)果顯示，與pcDNA3.1空載組相比，過表達(dá)NEFL可顯著促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的侵襲和遷移(< 0.05) (圖4，C和D)。

圖3 NEFL過表達(dá)促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的增殖

A：Western blot檢測KYSE70和KYSE140細(xì)胞中瞬時敲降效果，以GAPDH為內(nèi)參；B：CCK8法檢測瞬時敲降后KYSE70和KYSE140細(xì)胞增殖能力的變化。Parental：親本組；Non-silencing：對照siRNA；siNEFL-1/-2：NEFL siRNA靶點(diǎn)1和2。*< 0.05, **< 0.01, ***< 0.001, ****< 0.0001。

圖4 NEFL過表達(dá)顯著促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的侵襲和遷移

A：敲降的KYSE70和KYSE140細(xì)胞與對照組中穿過聚碳酯膜的細(xì)胞數(shù)目對比；B：敲降的KYSE70和KYSE140細(xì)胞與對照組中聚碳酯膜下表面的5個不同視野的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果；C：瞬時過表達(dá)NEFL的KYSE510細(xì)胞與對照組中穿過聚碳酯膜的細(xì)胞數(shù)目對比，pcDNA3.1：空載質(zhì)粒；pcDNA3.1-NEFL：NEFL外源瞬時過表達(dá)載體；D：瞬時過表達(dá)NEFL的KYSE510細(xì)胞與對照組中聚碳酯膜下表面的5個不同視野的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。*< 0.05, ***< 0.001, ****< 0.0001。

2.5 NEFL過表達(dá)可能促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞發(fā)生EMT

研究報(bào)道，E-cadherin和N-cadherin是參與腫瘤細(xì)胞EMT過程中的關(guān)鍵分子[11]。因此本課題組檢測了敲降后E-cadherin和N-cadherin的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，敲降后，食管鱗癌細(xì)胞系E-cadherin的表達(dá)水平明顯升高，同時N-cadherin的表達(dá)水平明顯降低(圖5A)。相反，與pcDNA3.1空載對照相比，過表達(dá)NEFL后，E-cadherin的表達(dá)水平明顯降低，且N-cadherin的表達(dá)水平明顯升高(圖5B)。這些結(jié)果表明，基因可能通過促進(jìn)EMT增強(qiáng)食管鱗癌細(xì)胞的侵襲遷移能力。

2.6 NEFL過表達(dá)激活EGFR/AKT/S6信號通路

Western blot結(jié)果顯示，與親本和對照組相比，敲降的KYSE70和KYSE140細(xì)胞中EGFR的蛋白水平顯著降低，且AKT和S6的磷酸化水平也顯著降低(圖6A)。相反，外源過表達(dá)NEFL的KYSE510細(xì)胞系中EGFR的蛋白水平、以及AKT和S6的磷酸化水平顯著升高(圖6B)。為了確定EGFR是NEFL調(diào)節(jié)食管鱗癌細(xì)胞侵襲遷移能力的關(guān)鍵下游分子，本研究在敲降后回復(fù)EGFR表達(dá)。Western blot結(jié)果表明，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組EGFR的總蛋白表達(dá)水平、以及EGFR、AKT和S6的磷酸化水平均顯著恢復(fù)(圖6C)。同時，Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示敲降后外源轉(zhuǎn)染pcDNA3.1- EGFR過表達(dá)載體的細(xì)胞穿過聚碳酯膜數(shù)目多于對照組(< 0.01) (圖6，D和E)。上述結(jié)果表明，EGFR是NEFL的關(guān)鍵下游分子，NEFL過表達(dá)可能通過激活EGFR/AKT/S6信號通路，促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的侵襲和遷移。

圖5 NEFL過表達(dá)調(diào)控促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞發(fā)生EMT的關(guān)鍵分子的表達(dá)

A：敲降，Western blot檢測E-cadherin和N-cadherin的表達(dá)變化；B：外源過表達(dá)NEFL，Western blot檢測E-cadherin和N-cadherin的表達(dá)變化。

2.7 敲降NEFL降低EGFR基因mRNA水平

本研究進(jìn)一步分析了NEFL過表達(dá)是否通過調(diào)控基因mRNA水平進(jìn)而影響其蛋白水平。qRT- PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，敲降后KYSE70和KYSE140細(xì)胞中的基因mRNA水平顯著降低(< 0.0001) (圖7A)。使用GEO數(shù)據(jù)集GSE23400分析食管鱗癌中基因mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示，食管鱗癌組織中基因mRNA的表達(dá)量顯著高于正常組織(= 53，< 0.0001) (圖7B)。同時，利用GEO數(shù)據(jù)集GSE23400分析了與基因mRNA表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果顯示，食管鱗癌組織中mRNA的表達(dá)與mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)(= 53，< 0.0001) (圖7C)。

2.8 敲降NEFL降低食管鱗癌細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力

本研究成功構(gòu)建了慢病毒介導(dǎo)的穩(wěn)定敲降KYSE70細(xì)胞系(圖8A)，將其與對照組細(xì)胞分別接種于裸鼠腋下。成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，敲降組腫瘤明顯減小(圖8B)。統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析顯示，敲降組的移植瘤體積和重量均明顯降低(圖8C)。進(jìn)一步對移植瘤組織蛋白進(jìn)行了Western blot檢測，結(jié)果顯示，敲降下調(diào)了移植瘤中N-cadherin的表達(dá)，并上調(diào)了E-cadherin的表達(dá)(圖8D)。

3 討論

轉(zhuǎn)移是癌細(xì)胞從其腫瘤發(fā)生的原發(fā)部位擴(kuò)散到身體其它部位的一個涉及多分子、多步驟的復(fù)雜生物學(xué)過程，是癌癥多步驟過程中最致命的因素[12,13]。NEFL在多種腫瘤中發(fā)揮重要作用，然而，在食管鱗癌中的作用尚無文獻(xiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，食管鱗癌組織中基因mRNA和蛋白水平顯著上調(diào)。功能研究表明，NEFL過表達(dá)可以促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞侵襲遷移，且增強(qiáng)食管鱗癌細(xì)胞在體內(nèi)的致瘤能力。

最近的研究表明，NEFL在86.7% (26/30)的胃癌腫瘤組織中存在陽性表達(dá)，且NEFL可能在胃癌細(xì)胞的EMT過程中發(fā)揮作用[6]。EMT已被廣泛認(rèn)為是多種癌細(xì)胞局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的必要過程[14～16]。E-cadherin的表達(dá)降低、以及Vimentin和N-cadherin的表達(dá)增加是EMT過程的基本特征[17]。本研究發(fā)現(xiàn)降低NEFL的表達(dá)導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)顯著增加，同時N-cadherin表達(dá)顯著降低，提示NEFL可能通過降低E-cadherin和增加N-cadherin激活EMT過程，促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的侵襲和遷移，為NEFL促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的侵襲提供了分子基礎(chǔ)。但如上所述，NEFL在膠質(zhì)瘤中下調(diào)，其高表達(dá)與患者的良好預(yù)后呈正相關(guān)[8,9]。由此推測NEFL在惡性腫瘤中的作用可能取決于不同的腫瘤類型。

圖6 NEFL過表達(dá)激活EGFR/AKT/S6信號通路

A：Western blot檢測瞬時敲降后KYSE70和KYSE140細(xì)胞中的分子變化，以GAPDH為內(nèi)參；B：Western blot檢測瞬時過表達(dá)NEFL后KYSE510細(xì)胞中的分子變化，以GAPDH為內(nèi)參；C：在KYSE70和KYSE140細(xì)胞轉(zhuǎn)染siNEFL和質(zhì)粒，Western blot檢測細(xì)胞中的分子變化，以GAPDH為內(nèi)參；D：在KYSE70和KYSE140細(xì)胞中敲降并回復(fù)EGFR后三組中穿過聚碳酯膜的細(xì)胞數(shù)目對比，siNEFL：siRNA靶點(diǎn)2；pcDNA3.1：空載質(zhì)粒；pcDNA3.1-EGFR：EGFR外源過表達(dá)載體；E：KYSE70和KYSE140細(xì)胞敲降并回復(fù)EGFR后三組中聚碳酯膜下表面的5個不同視野的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。**< 0.01，***< 0.001，****< 0.0001。

圖7 NEFL與EGFR基因mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)

A：敲降后，qRT-PCR檢測的mRNA水平；B：基因mRNA在食管鱗癌組織中的表達(dá)水平高于配對正常組織(= 53；GEO數(shù)據(jù)集GSE23400)；C：根據(jù)GEO數(shù)據(jù)集GSE23400的分析，基因mRNA表達(dá)水平與mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)。

圖8 敲降NEFL降低食管鱗癌細(xì)胞的裸鼠成瘤能力

A：Western blot檢測shRNA的穩(wěn)定敲降效果，以GAPDH為內(nèi)參，shNon-silencing：對照；shNEFL-1：穩(wěn)定敲降靶點(diǎn)1；B：穩(wěn)定敲降的KYSE70細(xì)胞及對照細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤效果；C：與對照相比，穩(wěn)定敲降KYSE70細(xì)胞的裸鼠體內(nèi)移植瘤體積和重量顯著降低；D：Western blot檢測敲降的裸鼠腫瘤組織中E-cadherin和N-cadherin的表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參。**< 0.01。

EGFR是一種具有細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白[18]。眾所周知，EGFR的過表達(dá)在多種實(shí)體瘤中起著重要的致癌作用，其異常激活被認(rèn)為是細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤轉(zhuǎn)移的主要原因[19]。研究表明，食管鱗癌存在高頻EGFR高表達(dá)，EGFR過表達(dá)與臨床分期、腫瘤侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[20]?；蚩截悢?shù)較低的食管鱗癌患者的生存率高于其拷貝數(shù)較高的患者[21]。EGFR的激活可觸發(fā)一系列下游信號通路的活化，主要涉及癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的MAPK和PI3K/AKT通路[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，敲降可顯著降低基因mRNA和蛋白水平的表達(dá)，并導(dǎo)致AKT和S6的磷酸化水平顯著降低，表明NEFL可能上調(diào)基因mRNA水平，激活EGFR/AKT/S6信號通路，進(jìn)而促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的侵襲。在敲降后過表達(dá)EGFR時，食管鱗癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力得到了顯著的回復(fù)，進(jìn)一步驗(yàn)證了NEFL過表達(dá)通過激活EGFR/AKT/S6增強(qiáng)食管鱗癌細(xì)胞侵襲和遷移能力。此外，本研究通過GEO數(shù)據(jù)庫分析得到，基因mRNA的相對表達(dá)量與基因mRNA的相對表達(dá)量呈顯著正相關(guān)。然而，NEFL是否通過調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)而影響其mRNA水平尚不清楚。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，多個轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)控EGFR的表達(dá)，例如Sp1[23]、E1A[24]、AP2[25]、YB-1[26]等。后續(xù)研究將重點(diǎn)關(guān)注NEFL是否調(diào)控上述轉(zhuǎn)錄因子，以及如何通過轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的表達(dá)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在食管鱗癌細(xì)胞和組織中高表達(dá)，且NEFL通過激活EGFR/AKT/S6信號通路，促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞發(fā)生EMT，進(jìn)而增強(qiáng)食管鱗癌細(xì)胞的侵襲遷移能力(圖9)。上述研究表明，靶向NEFL/EGFR信號通路可能作為食管鱗癌的一種潛在治療策略。

圖9 NEFL通過激活EGFR/AKT/S6信號通路促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的侵襲遷移模式圖

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NEFL promotes invasion and migration of esophageal squamous carcinoma cellsthe EGFR/AKT/S6 pathway

Zhilu Fan1, Liyan Yang2, Na Zhang1, Dan Feng1, Jing Guo1, Chen Chang1, Qing Yuan1, Yan Cai1, Yu Zhang1, Wenqiang Wei3, Mingrong Wang1, Jiajie Hao1

To explore the expression, the roles and the underlying mechanism of neurofilament light chain (NEFL) in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC), we firstly analyzed themRNA and protein expression in ESCC and paired normal tissues by using Gene Expression Omnibus (GEO) database, and real-time quantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR). The results showed thatmRNA level was significantly upregulated in ESCC tissues compared with that of normal tissues. Western blot analysis revealed that NEFL protein level was also significantly upregulated in ESCC tissues. CCK8 and transwell assays were performed to analyze the effect of NEFL overexpression on the malignant phenotypes of ESCC cells, and the results showed thatknockdown significantly impaired the ESCC cell invasion and migration. Xenograft assay in nude mice indicated thatsilencing suppressed tumor growth. At the molecular level,knockdown significantly upregulated E-cadherin and downregulated N-cadherin expression, suggesting that NEFL overexpression might influence the epithelial-mesenchymal transition (EMT) process. Furthermore, we found thatknockdown significantly reduced the mRNA and protein expression of epidermal growth factor receptor (EGFR) and the phosphorylation levels of protein kinase B (PKB; also known as AKT) and ribosomal protein S6 (S6). Ectopic expression of EGFR afterknockdown significantly restored the phosphorylation levels of AKT and S6 as well as the invasion and migration of ESCC cells. These data indicate that NEFL overexpression might promote the EMT process of ESCC cellsthe EGFR/AKT/S6 pathway, ultimately enhancing the invasion and migration of ESCC cells.

NEFL; esophageal squamous cell carcinoma; invasion and migration; EGFR; EMT

2022-01-24;

2022-02-22;

2022-03-07

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號：81972770)，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程(編號：2021-I2M-1-018)和中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院潛力培育計(jì)劃(編號：PY2018B01)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81972770), Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) Innovation Fund for Medical Sciences (No. 2021-I2M-1-018), and the Potential Development Projects of Cancer Hospital, CAMS (No. PY2018B01)]

范志露，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：細(xì)胞生物學(xué)。E-mail: 18679148679@163.com

郝佳潔，博士，研究員，研究方向：腫瘤遺傳學(xué)、腫瘤細(xì)胞生物學(xué)。E-mail: hjj8173@126.com

楊荔艷，博士，研究實(shí)習(xí)員，研究方向：腫瘤遺傳學(xué)、檢驗(yàn)學(xué)。E-mail: yangliyan0729@163.com

10.16288/j.yczz.22-019

(責(zé)任編委: 周鋼橋)