分析小鼠晝夜節(jié)律變化的行為學方法

曾義準，張?zhí)?，徐?/p>

分析小鼠晝夜節(jié)律變化的行為學方法

曾義準，張?zhí)?，徐?/p>

蘇州大學蘇州醫(yī)學院，劍橋–蘇大基因組資源中心，蘇州 215123

晝夜節(jié)律是指生命活動以24小時為周期的內(nèi)在性節(jié)律。為了適應(yīng)晝夜環(huán)境周期性的變化，地球上幾乎所有生物體，包括藻類、細菌、植物、動物等，都演化出一個特殊的系統(tǒng)——生物鐘，用以指揮不同組織與器官來適應(yīng)環(huán)境的晝夜交替，維持機體的生理穩(wěn)態(tài)和行為與環(huán)境晝夜變化同步。生物鐘是指由內(nèi)源性分子時鐘控制的日周生理振蕩過程，人類生命活動的各個層面，包括行為、生理、代謝等都受到生物鐘的調(diào)控，并表現(xiàn)出明顯的晝夜節(jié)律，如睡眠與蘇醒、警覺程度與運動能力、體溫波動、泌尿系統(tǒng)、激素分泌、免疫調(diào)節(jié)以及細胞因子釋放等。晝夜節(jié)律紊亂可能影響各種疾病的發(fā)生、發(fā)展、治療和預后。因此在機體的發(fā)育、衰老及疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中評估晝夜節(jié)律是否異常具有重要的意義。結(jié)合本課題組相關(guān)研究，本文較為系統(tǒng)性地討論了幾種適用不同目的鑒別晝夜節(jié)律行為異常的方法，分享了具體的實驗操作以及分析思路，包括利用代謝籠測量活動節(jié)律、自由跑輪活動監(jiān)測、倒時差、長光照、骨骼光周期以及T7-cycle，并解釋了不同行為學方法背后的生理意義。除此之外，本文還探究了不同遺傳背景以及不同來源小鼠的晝夜節(jié)律在適應(yīng)外界環(huán)境變化上的可能差異，為相關(guān)研究提供了可行的參考。根據(jù)這些原則及方法，以期幫助相關(guān)科研人員選擇合適的實驗來評估遺傳因素、環(huán)境因素或疾病對晝夜節(jié)律行為的影響。

晝夜節(jié)律；代謝籠；跑輪；測量方法

為了適應(yīng)24小時晝夜變化的外界環(huán)境，地球上的生物進化出了晝夜節(jié)律系統(tǒng)。機體的許多生理過程，如睡眠/覺醒、活動、激素分泌等都表現(xiàn)出近24小時周期的節(jié)律[1,2]。晝夜節(jié)律系統(tǒng)幾乎參與了機體所有生理活動的調(diào)節(jié)[3]。晝夜節(jié)律紊亂會對健康造成重大影響，包括睡眠障礙、腫瘤發(fā)生、代謝紊亂、免疫系統(tǒng)疾病等。對輪班工人的研究表明，長期的輪班工作會影響機體的脂質(zhì)和碳水化合物的代謝，改變胰島素抵抗水平以及生長激素和皮質(zhì)類固醇分泌模式[4～6]。此外，流行病學研究顯示，一些疾病如高血壓、左心室肥大、冠心病和心機梗塞在輪班工作人群中發(fā)生更頻繁更嚴重[7～9]。而最近的全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association studies, GWAS)也將睡眠障礙、心理健康和代謝紊亂等疾病的病因?qū)W與生物鐘聯(lián)系起來[10]。因此，晝夜節(jié)律與生理穩(wěn)態(tài)和疾病是密切相關(guān)的。

哺乳動物的晝夜節(jié)律系統(tǒng)受生物鐘調(diào)控，生物鐘是由核心生物鐘基因構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄翻譯反饋環(huán)。小鼠()體內(nèi)幾乎每一個細胞內(nèi)都存在生物鐘，實現(xiàn)晝夜節(jié)律的調(diào)控。生物鐘基因缺失或突變能夠?qū)е滦∈笊镧姷奈蓙y，行為學上可以觀察到內(nèi)在節(jié)律喪失、周期偏離正常范圍[11～13]，而這些突變小鼠分別有睡眠、代謝、生殖、腫瘤等不同的表型，提示了生物鐘基因或生物節(jié)律的改變與疾病有密切的關(guān)聯(lián)。

由于光線是晝夜節(jié)律系統(tǒng)中最有力的授時因子，光照對晝夜節(jié)律系統(tǒng)的同步是普遍存在的現(xiàn)象[14]。對于小鼠來說，光照是影響晝夜節(jié)律變化的最重要環(huán)境因素，可以重置小鼠的晝夜節(jié)律，通過牽引作

用實現(xiàn)小鼠晝夜節(jié)律與外界環(huán)境同步[15]。在現(xiàn)實生活中，跨時區(qū)飛行、季節(jié)性日照時間的改變，都是外界光照對機體晝夜節(jié)律牽引的現(xiàn)象[16]。許多基因突變小鼠都表現(xiàn)出適應(yīng)外界光照變化能力的改變[17～19]。光線還可以直接對小鼠的活動起到抑制作用(masking)。機體對光照的響應(yīng)很大程度上依賴晝夜節(jié)律系統(tǒng)，因此人們通常可以利用不同的光照周期、光照時間點、光照強度來檢測小鼠晝夜節(jié)律系統(tǒng)對于光線的響應(yīng)，記錄小鼠的行為變化，進而分析某些基因的缺陷是否對生物節(jié)律產(chǎn)生影響[20]。

本文以Slc7a11突變小鼠為例，使用不同的晝夜節(jié)律行為學檢測方法對小鼠進行行為學表型檢測[21]，包括代謝籠、小鼠自由跑輪活動監(jiān)測、倒時差反應(yīng)、長光照、骨骼光周期和T7-cycle等。本文對小鼠晝夜節(jié)律的行為學檢測方法進行了較為全面的總結(jié)，提供了一套系統(tǒng)性、標準化的檢測方法和分析思路，并闡述了這些行為學方法的生物學意義。這些實驗方法可以作為晝夜節(jié)律表型分析的篩選流程。此外，文中還對晝夜節(jié)律檢測過程中可能遇到的問題、可能導致的原因包括遺傳背景及燈光強度等因素進行了分析，強調(diào)了遺傳背景在此過程中發(fā)揮的作用，以期能有效幫助研究人員規(guī)避評估小鼠晝夜節(jié)律行為學檢測中可能遇到的問題。

1 材料與方法

1.1 小鼠飼養(yǎng)

本實驗使用的Slc7a11突變小鼠來自于蘇州大學劍橋–蘇大基因組資源中心，C57BL/6J和C57BL/6N小鼠分別購買于江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司、北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司和斯貝福(蘇州)生物技術(shù)有限公司。實驗動物均飼養(yǎng)于蘇州大學劍橋–蘇大基因組資源中心SPF級設(shè)施中，小鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度為22±2℃，環(huán)境濕度為60%～70%，小鼠飼養(yǎng)在標準光照環(huán)境中(8:00開燈，20:00關(guān)燈)，并自由取得食物和飲水。所有動物實驗方案經(jīng)過蘇州大學劍橋–蘇大基因組資源中心動物倫理與使用委員會批準通過(CAM-SU-AP#: YX- 2017-1)。

1.2 小鼠晝夜節(jié)律檢測方法

1.2.1 代謝籠檢測小鼠晝夜節(jié)律

代謝籠由檢測活動、食物、水、氧氣含量和二氧化碳含量等檢測模塊和數(shù)據(jù)記錄、數(shù)據(jù)儲存等模塊組成的一套實驗動物監(jiān)測系統(tǒng)。該系統(tǒng)可以連續(xù)實時記錄小鼠活動、進食、飲水、氧耗量和二氧化碳產(chǎn)生量[22]。本文以Slc7a11突變小鼠和野生型小鼠為例，使用美國哥倫布公司搭建的代謝籠系統(tǒng)(Coulumbus Instruments, CLAMS)。用代謝籠檢測小鼠活動和飲食晝夜節(jié)律過程的具體操作如下：將小鼠單獨放置于代謝籠的籠盒內(nèi)，前3 d為適應(yīng)階段，從第4 d開始記錄，第4 d至第6 d每隔20 min記錄小鼠活動、飲食和飲水數(shù)據(jù)，連續(xù)記錄3 d (附圖1A)。適應(yīng)階段以及記錄階段小鼠所處環(huán)境皆為正常飼養(yǎng)環(huán)境，光照周期為標準光照周期(8:00開燈，20:00關(guān)燈)。

1.2.2 跑輪檢測小鼠內(nèi)在晝夜節(jié)律周期

小鼠跑輪活動由生物節(jié)律監(jiān)測系統(tǒng)記錄，該系統(tǒng)購置于武漢一鳴智能科技有限公司。與代謝籠相比，跑輪記錄是檢測小鼠活動晝夜節(jié)律的經(jīng)典設(shè)備，可以長期檢測小鼠活動的節(jié)律，被廣泛運用于異常小鼠晝夜節(jié)律的篩選，發(fā)現(xiàn)了一系列晝夜節(jié)律異常的突變體[23]。實驗過程中，將小鼠單獨放置于帶有滾輪的籠盒中(蘇州市馮氏實驗動物設(shè)備有限公司)，在籠盒中小鼠自由獲得食物和飲水。籠盒與記錄倉相連，每個記錄倉可以單獨調(diào)節(jié)光照周期以及光照強度。小鼠在滾輪上每跑動一圈，記錄倉便記錄一次數(shù)據(jù)(附圖1B)。

跑輪檢測小鼠內(nèi)在晝夜節(jié)律周期的具體操作過程如下：將小鼠單獨放置于帶有滾輪的籠盒中并置于記錄倉中與記錄系統(tǒng)連接。小鼠在標準光照環(huán)境中(8:00開燈，20:00關(guān)燈)牽引7～10 d，使得每一只小鼠的晝夜節(jié)律被外界光照穩(wěn)定牽引。接下來關(guān)閉燈光，環(huán)境燈光變?yōu)槌掷m(xù)黑暗，并至少記錄14 d (圖1A)。因為外界環(huán)境恒定，不存在影響小鼠內(nèi)在晝夜節(jié)律的外界因素，所以持續(xù)黑暗中小鼠跑輪結(jié)果反映了小鼠內(nèi)在的節(jié)律(free running)。隨后根據(jù)跑輪記錄到的小鼠在持續(xù)黑暗下活動可以計算得到小鼠的內(nèi)在節(jié)律周期。周期可以根據(jù)在持續(xù)黑暗中小鼠跑輪活動的斜率計算得到(圖1B，紅線)，公式如下：

1.2.3 倒時差實驗

為檢測小鼠適應(yīng)外界環(huán)境晝夜變化的能力，通常使用倒時差實驗來檢測小鼠被重新牽引的能力。倒時差實驗具體操作步驟為：將小鼠單獨放置于帶有滾輪的籠盒中并置于記錄倉中與記錄系統(tǒng)連接，首先小鼠被置于標準光照環(huán)境中(8:00開燈，20:00關(guān)燈) 7～10 d，使得小鼠晝夜節(jié)律被穩(wěn)定牽引；隨后將開燈時間周期前移，如：2:00開燈，14:00關(guān)燈，模擬向東跨6個時區(qū)飛行。小鼠倒時差后馴化天數(shù)是視小鼠適應(yīng)時差的天數(shù)而定(在完全適應(yīng)新燈光后再馴化固定天數(shù))。在小鼠跑輪活動被穩(wěn)定牽引后，再將開燈時間后移，如：8:00開燈，20:00關(guān)燈，模擬向西跨6個時區(qū)飛行[24]。分別測量小鼠在2次倒時差過程中的起跳點時間的變化，來說明小鼠適應(yīng)新時區(qū)的快慢，反應(yīng)小鼠被再次牽引的能力(圖1C)。隨后根據(jù)小鼠完全適應(yīng)新時區(qū)所需要的天數(shù)來反應(yīng)適應(yīng)環(huán)境變化的能力。

圖1 小鼠晝夜節(jié)律檢測方法光照方案示意圖

A：跑輪檢測小鼠內(nèi)在晝夜節(jié)律周期。圖中陰影部分對應(yīng)的是關(guān)燈時間段，圖中白色部分對應(yīng)的是開燈時間段。B：小鼠內(nèi)在晝夜節(jié)律周期計算方法示意圖。紅線表示小鼠跑輪起跳點的連線，綠線表示活動起跳點遷移的時間，藍線表示持續(xù)黑暗中的天數(shù)。C：小鼠倒時差實驗光照方案示意圖。D：小鼠長光照實驗光照方案示意圖。E：小鼠骨骼光周期實驗光照方案示意圖。圖中黃色部分表示15 min的光脈沖。F：小鼠T7-cycle實驗光照方案示意圖。圖中黃色部分表示3.5 h光照。

1.2.4 長光照與短光照實驗

倒時差實驗模擬了跨越不同時區(qū)(經(jīng)度)飛行，機體重新適應(yīng)新的時區(qū)的過程。在同一地區(qū)，由于不同季節(jié)的日照情況不同，機體會利用晝夜節(jié)律系統(tǒng)來適應(yīng)季節(jié)性光照的變化。在我國大部分地區(qū)，夏季日照時間長，冬季日照時間短，而夏至和冬至分別對應(yīng)日照時間極長和極短的時間。

研究人員通常使用長光照或者短光照來反應(yīng)小鼠適應(yīng)季節(jié)性日長變化的能力。在實驗中，小鼠被置于標準光照環(huán)境中(8:00開燈，20:00關(guān)燈) 7～10 d，使得小鼠晝夜節(jié)律被穩(wěn)定牽引。然后，將光照時長改變，如：光照時間改為18 h，黑暗時間為6 h (5:00開燈，23:00關(guān)燈)，在小鼠跑輪活動被穩(wěn)定牽引后，再恢復到標準光照環(huán)境(8:00開燈，20:00關(guān)燈)中(圖1D)[25]。此外，還可以通過調(diào)節(jié)開關(guān)燈時間來縮短光照時間，探究小鼠適應(yīng)短光照的能力。隨后根據(jù)小鼠在長光照或者短光照下的活動時長來反映小鼠適應(yīng)季節(jié)性日長變化的能力。

1.2.5 骨骼光周期實驗

機體適應(yīng)新的時區(qū)和長短光照，都是機體被外界光照牽引的過程。外界光照對小鼠的活動主要有牽引和抑制活動的作用。牽引作用是通過外界光照重置生物鐘，影響小鼠活動的相位。光照抑制活動指的是光照可以直接抑制小鼠的活動量，即在小鼠活動時施加光照，小鼠的活動量會顯著降低。因此，當小鼠在標準光照下活動相位出現(xiàn)異常時，可能是小鼠被外界光照牽引的能力異常，也有可能是小鼠活動被外界光照抑制的能力出現(xiàn)異常。

骨骼光周期實驗就是用來檢測外界光照對小鼠活動的牽引能力。在實驗中，小鼠首先被置于標準光照環(huán)境(8:00開燈，20:00關(guān)燈)中7～10 d，使得小鼠晝夜節(jié)律被穩(wěn)定牽引。然后，將光照條件調(diào)為持續(xù)黑暗，只在標準光照對應(yīng)的開燈和關(guān)燈時間點給與很短的光照脈沖，最大程度地減少在實驗過程中光照對小鼠活動的抑制作用，光照周期應(yīng)該盡量接近小鼠內(nèi)在節(jié)律的周期，如：8:00～8:15和19:45～20:00開燈，光照周期為24 h，其余時間保持黑暗(圖1E)[26]。根據(jù)穩(wěn)定牽引的定義，首先計算小鼠在骨骼光下的活動周期，是否和外界光照周期一致。然后，判斷每個周期內(nèi)小鼠活動的相位和光照的時間點關(guān)系是否穩(wěn)定。根據(jù)這兩個條件判斷小鼠是否可以被外界光照穩(wěn)定牽引。在穩(wěn)定牽引的基礎(chǔ)上再比較實驗組和對照組小鼠活動的相位，如活動起跳點，說明兩種小鼠活動相位的差異。

1.2.6 T7-cycle實驗

光照除了可以重置小鼠活動的相位，實現(xiàn)對小鼠活動晝夜節(jié)律的牽引，還可以直接抑制小鼠的活動，減少小鼠的活動量。因此，在檢測光照對小鼠活動量的抑制能力時，要盡可能排除光照的牽引作用。

T7-cycle是檢測光照對小鼠活動抑制的常用方法。在實驗中，光照條件設(shè)置為3.5 h開燈，3.5 h關(guān)燈，以此循環(huán)往復。此過程中，光照周期是7 h，與小鼠晝夜節(jié)律周期差距較大，且非24 h的約數(shù)，所以小鼠的晝夜節(jié)律不能被7 h光照周期牽引，實驗結(jié)果最大程度上反應(yīng)了光照直接對小鼠活動抑制作用(圖1F)[27]。實驗過程中小鼠被置于T7-cycle光照條件下至少7 d，因為在7 d的實驗過程中各個7 h的時間窗口都會經(jīng)歷3.5 h光照～3.5 h黑暗的光照變化。隨后通過統(tǒng)計小鼠的活動量來評價光照對小鼠活動的抑制作用。

1.3 統(tǒng)計分析

小鼠代謝籠數(shù)據(jù)的活動起跳點由同步篩選器識別[22]。小鼠跑輪活動起跳點由Clock lab軟件識別。數(shù)據(jù)差異使用GraphPad軟件(v6)的雙側(cè)Student’s檢測。所有統(tǒng)計學檢驗中，<0.05表示有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 代謝籠初篩生物節(jié)律行為異常

當晝夜節(jié)律出現(xiàn)缺陷的時候，小鼠的活動和飲食規(guī)律有可能出現(xiàn)晝夜紊亂，而代謝籠具有實時記錄活動及攝食的功能。本文以Slc7a11突變小鼠為例說明代謝籠對小鼠節(jié)律的檢測(材料與方法1.2.1)。根據(jù)數(shù)據(jù)分析可以看到，第1 d和第3 dSlc7a11突變小鼠表現(xiàn)出活動起跳點提前的表型(圖2A)。盡管在代謝籠中第2 d，Slc7a11突變小鼠和同窩野生型小鼠的活動起跳點沒有明顯差異，但在關(guān)燈時刻前后Slc7a11突變小鼠的活動比同窩野生型小鼠提前下降(圖2A，紅色箭頭)。接下來，使用同步篩選器識別小鼠活動的起跳點時間和峰值相位，發(fā)現(xiàn)第1 d和第3 d時Slc7a11突變小鼠的起跳點時間提前(圖2B)，第3 d時Slc7a11突變小鼠的峰值相位提前(圖2C)。代謝籠不僅可以記錄小鼠的活動還可以記錄小鼠的進食，通過對Slc7a11突變小鼠和同窩野生型小鼠的進食量進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)Slc7a11突變小鼠和同窩野生型小鼠的進食節(jié)律模式?jīng)]有明顯差異，都是夜晚進食明顯高于白天，只是在部分時間點Slc7a11突變小鼠進食量高于同窩野生型小鼠(圖2D)。

2.2 利用跑輪檢測小鼠內(nèi)在晝夜節(jié)律周期

小鼠內(nèi)在晝夜節(jié)律的周期是最容易檢測的節(jié)律參數(shù)，此處以Slc7a11突變小鼠為例，說明小鼠的內(nèi)在晝夜節(jié)律周期測量實驗(材料與方法1.2.2)。在持續(xù)黑暗中野生型和突變小鼠都表現(xiàn)出明顯的晝夜節(jié)律(圖3，A和B)，通過計算發(fā)現(xiàn)Slc7a11突變小鼠和野生型小鼠的內(nèi)在晝夜節(jié)律周期沒有明顯差異(圖3C)。這個結(jié)果說明野生型和Slc7a11突變小鼠內(nèi)在節(jié)律的快慢沒有明顯的差異。

2.3 利用跑輪測量小鼠對時差的響應(yīng)

小鼠倒時差是檢測小鼠適應(yīng)外界光照變化的經(jīng)典實驗。本文以Slc7a11突變小鼠兩次倒時差實驗為例，介紹倒時差實驗的過程(材料與方法1.2.3)。在向東(提前) 6 h倒時差的過程中野生型小鼠逐漸適應(yīng)新的時區(qū)(圖4A)，而Slc7a11突變小鼠出現(xiàn)一天就被牽引到新時區(qū)的現(xiàn)象(圖4B)。向西(延遲) 6 h倒時差的過程中，野生型小鼠和Slc7a11突變小鼠沒有表現(xiàn)出明顯的差異(圖4，A和B)。在向東調(diào)時差過程中，Slc7a11突變小鼠活動起跳點在前4 d明顯早于野生型，能更早適應(yīng)新時區(qū)，而向西調(diào)時差過程中小鼠活動起跳點沒有差異(圖4C)。

圖2 代謝籠檢測Slc7a11tm1a/tm1a突變小鼠活動變化

A：Slc7a11突變小鼠和同窩野生型小鼠在12 h光照/12 h黑暗光照條件下代謝籠監(jiān)測的活動情況。Slc7a11突變小鼠和同窩野生型小鼠各10只小鼠，結(jié)果用Mean±SEM表示。ZT：給時者時間(zeitgeber time)；標準光照下ZT 0表示開燈時間點，ZT 12表示關(guān)燈時間點，ZT6指的是開燈后6 h，ZT18指的是關(guān)燈后6 h，以此類推。B：小鼠活動的起跳點時間統(tǒng)計圖。結(jié)果用Mean±SEM表示。C：小鼠活動的峰值相位時間。結(jié)果用Mean±SEM表示。D：Slc7a11突變小鼠和同窩野生型小鼠在12 h光照/12 h黑暗條件下代謝籠監(jiān)測的進食情況。結(jié)果用Mean±SEM表示。Slc7a11突變小鼠的活動、起跳點時間、峰值相位和進食量利用雙側(cè)Student’s檢測；*<0.05，**<0.01，n.s.表示>0.05。圖B、C數(shù)據(jù)來源本實驗室先前的研究[21]。

圖3 Slc7a11tm1a/tm1a跑輪活動晝夜節(jié)律周期

A：野生型小鼠跑輪圖。B：Slc7a11突變小鼠跑輪圖。Slc7a11突變小鼠和同窩野生型小鼠各8只，圖中陰影部分對應(yīng)的是關(guān)燈時間段，白色部分對應(yīng)的是開燈時間段。C：野生型小鼠(藍色)和Slc7a11突變小鼠(紅色)跑輪活動的晝夜節(jié)律周期。結(jié)果用Mean±SEM表示，野生型和Slc7a11突變小鼠的數(shù)據(jù)使用雙側(cè)Student’s檢測，n.s.表示>0.05。

圖4 Slc7a11tm1a/tm1a突變小鼠對6 h相位前移和后移的響應(yīng)

A：野生型小鼠6 h提前和延遲時差的跑輪圖。圖中紅色線段表示活動起跳點。B：Slc7a11突變小鼠6 h提前和延遲時差的跑輪圖。在第22 d小鼠跑輪距離中斷了24 h，圖中紅色線段表示活動起跳點。C：野生型小鼠(藍色，同窩野生型小鼠9只)和Slc7a11突變小鼠(紅色，Slc7a11突變小鼠5只)適應(yīng)6 h提前和延遲時差的活動起跳點變化曲線。圖中陰影部分對應(yīng)的是關(guān)燈時間段，白色部分對應(yīng)的是開燈時間段，結(jié)果用Mean±SEM表示，野生型和Slc7a11突變小鼠的數(shù)據(jù)使用雙側(cè)Student’s檢測，*<0.05。

2.4 利用長光照模擬季節(jié)適應(yīng)

除了所在時區(qū)的變化，季節(jié)性日照時間長度的改變，也是一種常見的外界光照環(huán)境的變化。本文以Slc7a11突變小鼠適應(yīng)長光照實驗為例，介紹適應(yīng)長光照的過程(材料與方法1.2.4)。在12 h光照條件下，小鼠活動集中在關(guān)燈時間段，轉(zhuǎn)變?yōu)?8 h光照時，小鼠的活動區(qū)間被壓縮到約6 h，但小鼠活動仍然集中在關(guān)燈時間段(圖5，A和B)。Slc7a11突變小鼠和野生型小鼠在適應(yīng)長光照和恢復正常12 h光照的過程中，活動起跳點時間的變化情況一致，沒有明顯差異(圖5C)。

2.5 利用骨骼光周期檢測小鼠對光照牽引的響應(yīng)

外界光照可以牽引小鼠的活動相位，又可以直接抑制小鼠的活動。通常使用骨骼光周期實驗檢測光照對小鼠活動的牽引能力。本文以Slc7a11突變小鼠對骨骼光照的響應(yīng)為例，介紹該實驗過程(材料與方法1.2.5)。在骨骼光照條件下，Slc7a11突變小鼠活動提前于光照脈沖，野生型小鼠在給予光照脈沖時開始活動，但是兩種小鼠都保持著強健的節(jié)律(圖6，A和B)，并且骨骼光周期下兩種小鼠活動的周期仍然維持在24 h左右(圖6C)。統(tǒng)計活動起跳點時間發(fā)現(xiàn)，Slc7a11突變小鼠活動起跳點明顯早于野生型小鼠(圖6D)。這說明光照脈沖可以牽引兩種小鼠的活動，但是骨骼光周期對Slc7a11突變小鼠牽引時的相位角與野生型不同，暗示在小鼠晝夜節(jié)律于外界環(huán)境的同步化過程中發(fā)揮作用。

2.6 利用T7-cycle檢測光照對小鼠活動的抑制作用

T7-cycle可以檢測光照直接對小鼠活動的抑制作用。本文以Slc7a11突變小鼠在T7-cycle及3.5 h光照/3.5 h黑暗下的活動為例，介紹該實驗過程(材料與方法1.2.6)。在T7-cycle條件下小鼠活動保持近24 h的活動周期(圖7，A和B，紅線區(qū)域)，并非跟隨光照而變動。在小鼠活動時間段內(nèi)，光照有效地抑制了小鼠活動(圖7，A和B)。通過統(tǒng)計小鼠光照和黑暗期間小鼠活動量之比，說明光照對小鼠活動的抑制能力。定量結(jié)果顯示，Slc7a11突變小鼠和野生型小鼠的活動量被光照抑制的程度相同，沒有明顯差異(圖7C)。

圖5 Slc7a11tm1a/tm1a突變小鼠長光照的適應(yīng)

A：野生型小鼠適應(yīng)18 h光照跑輪圖。B：Slc7a11突變小鼠適應(yīng)18 h光照跑輪圖。A和B小圖中紅色線段表示活動起跳點，Slc7a11突變小鼠和同窩野生型小鼠各7只。C：野生型小鼠(藍色)和Slc7a11突變小鼠(紅色)適應(yīng)18 h光照的活動起跳點變化曲線。圖中陰影部分對應(yīng)的是關(guān)燈時間段，白色部分對應(yīng)的是開燈時間段，結(jié)果用Mean±SEM表示，野生型和Slc7a11突變小鼠的數(shù)據(jù)使用雙側(cè)Student’s檢測，n.s.：>0.05。

圖6 Slc7a11tm1a/tm1a突變小鼠在骨骼光周期下的跑輪活動

A：野生型小鼠在骨骼光周期下的跑輪圖。同窩野生型小鼠6只。B：Slc7a11突變小鼠在骨骼光周期下的跑輪圖。Slc7a11突變小鼠6只，圖中紅色線段表示活動起跳點，黃色線段表示15 min的光照脈沖。C：Slc7a11突變小鼠和野生型小鼠骨骼光周期下的周期統(tǒng)計。Slc7a11突變小鼠和同窩野生型小鼠各5只，結(jié)果用Mean±SEM表示，n.s.:>0.05。D：野生型小鼠(藍色)和Slc7a11突變小鼠(紅色)骨骼光周期下活動起跳點變化曲線。結(jié)果用Mean±SEM表示，野生型和Slc7a11突變小鼠的數(shù)據(jù)使用雙側(cè)Student’s檢測。

圖7 Slc7a11tm1a/tm1a突變小鼠T7-cycle下的跑輪活動

A：野生型小鼠在T7-cycle下的跑輪圖。B：Slc7a11突變小鼠在T7-cycle下的跑輪圖。A和B小圖中紅色線段內(nèi)區(qū)間表示活動區(qū)域。Slc7a11突變小鼠和同窩野生型小鼠各7只。C：野生型小鼠(藍色)和Slc7a11突變小鼠(紅色)光照時間段和黑暗時間段之間活動量的比值。結(jié)果用Mean±SEM表示，野生型和Slc7a11突變小鼠的數(shù)據(jù)使用雙側(cè)Student’s檢測，n.s.表示>0.05。

2.7 小鼠遺傳背景對倒時差的影響

小鼠的遺傳背景對小鼠的許多表型有影響，即使相同的C57BL/6分出的亞系C57BL/6J與C57BL/6N在一些表型上也存在差異。那么6J和6N這兩個常見亞系之間是否會在生物鐘表型上出現(xiàn)差異呢？為了回答這個問題，本研究首先在200 lux條件下，檢測了來自不同供應(yīng)商(江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司、北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司、斯貝福(蘇州)生物技術(shù)有限公司)的C57BL/6J或C57BL/6N小鼠對8 h時差的響應(yīng)。通常8 h的時差反應(yīng)，需要一周時間適應(yīng)新的光照周期，如果迅速適應(yīng)，會被認為生物鐘的魯棒性出現(xiàn)了問題。在比較各亞系及來自不同廠家的小鼠后發(fā)現(xiàn)，集萃藥康C57BL/6J小鼠在一周內(nèi)逐漸適應(yīng)8 h時差(圖8A)，其余小鼠都在第1 d就適應(yīng)了新的光照環(huán)境(圖8，B～E，附圖2)。所以在進行時差反應(yīng)實驗時，需要非常關(guān)注小鼠的來源。此外，晝夜節(jié)律對外界信號的響應(yīng)程度也取決于外界信號的高低和內(nèi)在晝夜節(jié)律的強弱，由兩者相對大小決定。于是，將光照強度降低至20 lux，再檢測集萃藥康和維通利華來源的C57BL/6J和C57BL/6N小鼠對6 h時差的響應(yīng)。C57BL/6J和C57BL/6N都沒有在1 d內(nèi)完全適應(yīng)時差，集萃藥康來源的C57BL/6J和C57BL/6N是在一周左右適應(yīng)6 h的時差，而維通利華來源的小鼠大部分是在1～2 d時間適應(yīng)6 h時差(圖8，F(xiàn)～I，附圖3)。在此基礎(chǔ)上，進一步統(tǒng)計小鼠在適應(yīng)時差過程中的起跳點時間的變化，發(fā)現(xiàn)200 lux條件下集萃藥康的C57BL/6J小鼠逐漸提前，小鼠的起跳點時間在1 d內(nèi)提前了8 h，且同一來源的相同遺傳背景的小鼠調(diào)時差過程中個體差異較大(圖8J)。在20 lux條件下，維通利華來源的C57BL/6J和C57BL/6N小鼠的起跳點時間在3 d時間提前了6 h時差，而集萃藥康來源的小鼠需要6～7 d以適應(yīng)新的光照方案，每一組內(nèi)的波動仍然很大(圖8K)。為了更加直觀地解讀小鼠適應(yīng)時差的差異，本文進一步計算了小鼠響應(yīng)時差過程中的PS50 (適應(yīng)一半時差所需要的時間)。在200 lux條件下，集萃藥康來源的C57BL/6J小鼠的PS50明顯大于其他小鼠，其他小鼠的PS50之間沒有差異(圖8L)。集萃藥康來源的C57BL/6J和C57BL/6N小鼠PS50明顯大于維通利華來源的小鼠，而同一供應(yīng)商C57BL/6J和C57BL/6N小鼠之間沒有明顯的差異(圖8L)。PS50的差異情況和小鼠適應(yīng)時差的過程，以及調(diào)時差過程中活動起跳點時間的變化趨勢一致這些結(jié)果說明，不同遺傳背景的小鼠及不同廠商的小鼠適應(yīng)時差的能力不同。因此在選擇時差反應(yīng)實驗時，需要嚴格控制遺傳背景，不能使用不同來源廠商供應(yīng)的小鼠之間進行比較。

圖8 不同遺傳背景小鼠對時差的響應(yīng)

A～I：不同遺傳背景小鼠時差的跑輪圖。GP：集萃藥康；CR：維通利華；SPF：斯貝福。J：200 lux光強下適應(yīng)8 h提前時差的活動起跳點變化曲線。圖中陰影部分對應(yīng)關(guān)燈時間段，白色部分對應(yīng)開燈時間段，結(jié)果用Mean±SEM表示，各組小鼠都是6只。K: 20 lux光強下適應(yīng)6 h提前時差的活動起跳點變化曲線。圖中陰影部分對應(yīng)關(guān)燈時間段，白色部分對應(yīng)開燈時間段，結(jié)果用Mean±SEM表示，各組小鼠都是6只。L:小鼠適應(yīng)時差過程中PS50的統(tǒng)計結(jié)果。不同遺傳背景的數(shù)據(jù)使用雙側(cè)Student’s檢測，*：<0.05，***<0.001。

3 討論

生物鐘領(lǐng)域所研究的科學問題一直以來都是生命科學的熱點方向，在2005年發(fā)布了125個人類最關(guān)注的科學問題，其中就包括機體生物鐘是如何同步化的[28]。另一方面，晝夜節(jié)律作為一個普遍的生物現(xiàn)象，生物體的許多過程都受到晝夜節(jié)律的調(diào)控并表現(xiàn)出晝夜振蕩[29,30]。機體晝夜節(jié)律的破壞，會影響疾病的發(fā)生、治療以及預后[31,32]。因此，尋找調(diào)控晝夜節(jié)律與外界環(huán)境同步化的關(guān)鍵基因，定義晝夜節(jié)律失同步與疾病間的關(guān)聯(lián)，已成為目前生物鐘領(lǐng)域亟需解答的熱點方向。本文以Slc7a11突變小鼠為例，設(shè)計了一整套評價晝夜節(jié)律的行為學方法，著重討論了光線對生物鐘的影響，目的在于為生物節(jié)律相關(guān)研究提供可參考的思路和可參借的研究方法。

早在2005年，Corinne等[33]發(fā)表了關(guān)于小鼠跑輪以及節(jié)律相關(guān)行為學研究的指南，該指南主要圍繞不同光照條件下的小鼠進行行為學檢測。本文不僅介紹了晝夜節(jié)律行為學檢測方法在實際科學研究中的應(yīng)用，同時提供了一套分析節(jié)律相關(guān)參數(shù)的方法并解釋了其生理意義，對檢測小鼠晝夜節(jié)律相關(guān)研究進行了一個較為全面的整理和總結(jié)，期望為研究人員在進行節(jié)律行為學實驗時提供幫助。此外，本文還進一步探究了小鼠品系、遺傳背景以及光照強度對生物節(jié)律的可能影響，指出不同遺傳背景或不同廠商之間小鼠的晝夜節(jié)律對外界環(huán)境響應(yīng)都有可能帶來很大的差異，能夠有效幫助研究人員規(guī)避評估小鼠晝夜節(jié)律行為學檢測中可能遇到的問題，并分析一些可能的原因，如C57BL/6N是突變，為視網(wǎng)膜變性8突變的純合子，可能影響視網(wǎng)膜感光靈敏度，而C57BL/6J無該突變，因此可能造成光照牽引的差異。此外，飲食等因素也有可能影響晝夜節(jié)律的魯棒性[34]。因此在評價晝夜節(jié)律異常研究時，需要注意這些要點，以免帶來假陽性或忽略表型。

附錄：

附加材料見文章電子版www.chinagene.cn。

附圖1 代謝籠和跑輪系統(tǒng)裝置圖

Supplementary Fig. 1 Installation drawing of metabolism cage and wheel-running system

A：小鼠代謝籠裝置圖。1：小鼠進食檢測裝置；2：小鼠飲水檢測裝置；3：紅外感應(yīng)檢測小鼠活動情況裝置；4：小鼠消耗氧氣以及產(chǎn)生二氧化碳檢測裝置；5：在使用代謝籠記錄之前，首先對代謝籠進行氣體平衡；6、7：將記錄的小鼠進食、飲水情況傳遞給計算機；8：整合小鼠活動代謝數(shù)據(jù)傳遞至計算機。B：小鼠跑輪裝置圖。1：光控開關(guān)，可以設(shè)置不同的開關(guān)燈時間，光照周期；2：光照強度調(diào)節(jié)開關(guān)，每一個記錄倉的燈光對應(yīng)一個光強開關(guān)；3：機械打點感應(yīng)器，連接在帶有跑輪的籠盒上，實時記錄滾輪的轉(zhuǎn)動；4：記錄倉，每只小鼠單獨放置于記錄倉中，保證小鼠之間不會互相干擾；5：帶有滾輪的籠盒；6：數(shù)據(jù)集中處理裝置，同一排的七個打點器共同連接于此，并將數(shù)據(jù)傳遞給采集盒；7：數(shù)據(jù)采集盒，可以同時整合多通道的跑輪數(shù)據(jù)，并傳遞給計算機；8、9：Clocklab軟件，可以實時查看各個記錄通道的小鼠活動情況；10：MATLAB軟件，一般通過局域網(wǎng)將動物房Clocklab軟件記錄的數(shù)據(jù)共享至實驗室，通過該軟件可以實時查看小鼠的活動情況，以及計算小鼠的活動周期、起跳點等參數(shù)。

附圖2 200 lux下不同遺傳背景小鼠倒時差跑輪圖

Supplementary Fig. 2 Wheel-running of mice with different genetic background to jet lag at 200 lux

附圖3 20 lux下不同遺傳背景小鼠倒時差跑輪圖

Supplementary Fig. 3 Wheel-running of mice with different genetic background to jet lag at 20 lux

[1] Ruan W, Yuan XY, Eltzschig HK. Circadian rhythm as a therapeutic target., 2021, 20(4): 287–307.

[2] Pilorz V, Astiz M, Heinen KO, Rawashdeh O, Oster H. The concept of coupling in the mammalian circadian clock network., 2020, 432(12): 3618–3638.

[3] Yue M, Yang Y, Guo GL, Qin XM. Genetic and epigene-ticregulations of mammalian circadian rhythms., 2017, 39(12): 1122–1137.岳敏, 楊禹, 郭改麗, 秦曦明. 哺乳動物生物鐘的遺傳和表觀遺傳研究進展. 遺傳, 2017, 39(12): 1122–1137.

[4] Arendt J. Shift work: coping with the biological clock., 2010, 60(1): 10–20.

[5] Yuan L, Li YR, Xu XD. Chronobiology—2017 Nobel prize in physiology or medicine., 2018, 40(1): 1–11.袁力, 李藝柔, 徐小冬. 時間生物學—2017年諾貝爾生理或醫(yī)學獎解讀. 遺傳, 2018, 40(1): 1–11.

[6] Scheiermann C, Gibbs J, Ince L, Loudon A. Clocking in to immunity., 2018, 18(7): 423–437.

[7] Costello HM, Gumz ML. Circadian rhythm, clock genes, and hypertension: recent advances in hypertension., 2021, 78(5): 1185–1196.

[8] Mehra R. Sleep apnea and the heart., 2019, 86(9 Suppl 1): 10–18.

[9] Daios S, Savopoulos C, Kanellos I, Goudis CA, Nakou I, Petalloti S, Hadjidimitriou N, Pilalas D, Ziakas A, Kaiafa G. Circadian pattern of acute myocardial infarction and atrial fibrillation in a mediterranean country: a study in diabetic patients., 2021, 57(1): 41.

[10] Knutsson A. Methodological aspects of shift-work research., 2004, 21(6): 1037–1047.

[11] Fagiani F, Di Marino D, Romagnoli A, Travelli C, Voltan D, Di Cesare Mannelli L, Racchi M, Govoni S, Lanni C. Molecular regulations of circadian rhythm and implica-tions for physiology and diseases., 2022, 7(1): 41.

[12] Roenneberg T, Merrow M. The circadian clock and human health., 2016, 26(10): R432–R443.

[13] Pan XY, Mota S, Zhang BY. Circadian clock regulation on lipid metabolism and metabolic diseases., 2020, 1276: 53–66.

[14] Jagannath A, Taylor L, Wakaf Z, Vasudevan SR, Foster RG. The genetics of circadian rhythms, sleep and health., 2017, 26(R2): R128–R138.

[15] Honma S. Development of the mammalian circadian clock., 2020, 51(1): 182–193.

[16] Dannerfjord AA, Brown LA, Foster RG, Peirson SN. Light input to the mammalian circadian clock., 2021, 2130: 233–247.

[17] Jagannath A, Varga N, Dallmann R, Rando G, Gosselin P, Ebrahimjee F, Taylor L, Mosneagu D, Stefaniak J, Walsh S, Palumaa T, Di Pretoro S, Sanghani H, Wakaf Z, Churchill GC, Galione A, Peirson SN, Boison D, Brown SA, Foster RG, Vasudevan SR. Adenosine integrates light and sleep signalling for the regulation of circadian timing in mice., 2021, 12(1): 2113.

[18] Yamaguchi Y, Murai I, Goto K, Doi S, Zhou HH, Setsu G, Shimatani H, Okamura H, Miyake T, Doi M. Gpr19 is a circadian clock-controlled orphan GPCR with a role in modulating free-running period and light resetting capacity of the circadian clock., 2021, 11(1): 22406.

[19] Buhr ED, Vemaraju S, Diaz N, Lang RA, Van Gelder RN. Neuropsin (OPN5) mediates local light-dependent induction of circadian clock genes and circadian photoentrainment in exposed murine skin., 2019, 29(20): 3478– 3487.e4.

[20] Jagannath A, Taylor L, Wakaf Z, Vasudevan SR, Foster RG. The genetics of circadian rhythms, sleep and health., 2017, 26(R2): R128–R138.

[21] Zhang T, Xie PC, Dong YY, Liu ZW, Zhou F, Pan DJ, Huang ZY, Zhai QC, Gu Y, Wu QY, Tanaka N, Obata Y, Bradley A, Lelliott CJ, Sanger Institute Mouse Genetics Project, Nutter LMJ, McKerlie C, Flenniken AM, Champy MF, Sorg T, Herault Y, De Angelis MH, Durner VG, Mallon AM, Brown SDM, Meehan T, Parkinson HE, Smedley D, Lloyd KCK, Yan J, Gao X, Seong JK, Wang CKL, Sedlacek R, Liu Y, Rozman J, Yang L, Xu Y. High- throughput discovery of genetic determinants of circadian misalignment., 2020, 16(1): e1008577.

[22] Liu ZW, Huang ML, Wu X, Shi GS, Xing LJ, Dong Z, Qu ZP, Yan J, Yang L, Panda S, Xu Y. PER1 phosphorylation specifies feeding rhythm in mice., 2014, 7(5): 1509–1520.

[23] Vitaterna MH, King DP, Chang AM, Kornhauser JM, Lowrey PL, McDonald JD, Dove WF, Pinto LH, Turek FW, Takahashi JS. Mutagenesis and mapping of a mouse gene, clock, essential for circadian behavior., 1994, 264(5159): 719–725.

[24] Armstrong SM, Cassone VM, Chesworth MJ, Redman JR, Short RV. Synchronization of mammalian circadian rhythms by melatonin., 1986, 21: 375–394.

[25] Metzger J, Wicht H, Korf HW, Pfeffer M. Seasonal variations of locomotor activity rhythms in melatonin- proficient and -deficient mice under seminatural outdoor conditions., 2020, 35(1): 58–71.

[26] Kurien P, Hsu PK, Leon J, Wu D, McMahon T, Shi GS, Xu Y, Lipzen A, Pennacchio LA, Jones CR, Fu YH, Ptá?ek LJ. TIMELESS mutation alters phase responsiveness and causes advanced sleep phase., 2019, 116(24): 12045–12053.

[27] Izumo M, Pejchal M, Schook AC, Lange RP, Walisser JA, Sato TR, Wang XZ, Bradfield CA, Takahashi JS. Differential effects of light and feeding on circadian organization of peripheral clocks in a forebrain Bmal1 mutant., 2014, 3: e04617.

[28] So much more to know., 2005, 309(5731): 78–102.

[29] Zhang R, Lahens NF, Ballance HI, Hughes ME, Hogenesch JB. A circadian gene expression atlas in mammals: implications for biology and medicine., 2014, 111(45): 16219–16224.

[30] Bass J, Lazar MA. Circadian time signatures of fitness and disease., 2016, 354(6315): 994–999.

[31] Verlande A, Masri S. Circadian clocks and cancer: time-keeping governs cellular metabolism., 2019, 30(7): 445–458.

[32] Chellappa SL, Vujovic N, Williams JS, Scheer FAJL. Impact of circadian disruption on cardiovascular function and disease., 2019, 30(10): 767–779.

[33] Jud C, Schmutz I, Hampp G, Oster H, Albrecht U. A guideline for analyzing circadian wheel-running behavior in rodents under different lighting conditions., 2005, 7: 101–116.

[34] Pan XY, Taylor MJ, Cohen E, Hanna N, Mota S. Circadian clock, time-restricted feeding and reproduction., 2020, 21(3): 831.

Rapid assessment of circadian behavior in mice

Yizhun Zeng, Tao Zhang, Ying Xu

Circadian rhythms have a cycle length of about 24 hours, i.e. a 24-hour internal clock. In order to adapt to the periodic changes of the circadian environment, almost all organisms on the earth, including algae, bacteria, plants, animals, etc., have evolved a special system—the circadian clock. It helps organisms to adapt to the daily changes in the environment and maintains the physiological process and the behavior in synchronization with the environment changes. Circadian rhythms are composed of an intracellular feedback loop that drives the expression of molecular components and their constitutive protein products to oscillate over a period of about 24 hours. Almost every aspect of the body's functions, including behavior and physiology, is regulated by the circadian clock, and shows obvious daily rhythms, such as sleep and wakefulness, alertness, body temperature fluctuations, urinary system, hormone secretion, immune regulation, and cytokine release. Circadian factors are also increasingly recognized for potentially affecting the occurrence, progression, treatment, and prognosis of a variety of diseases. This paper discusses several methods for measuring circadian behavior disorders in mice for different purposes, and shares experimental operations and analysis ideas, including the use of metabolism cage, wheel running activity, jet lag, lengthened light, bones photoperiod, as well as the T7-cycle. In addition, this paper also studies the possible reasons for variations caused by genetic backgrounds and light conditions. Given these methods, researchers can choose appropriate experiments to evaluate the influence of genetic factors, environmental factors or diseases on circadian behavior.

circadian rhythm;metabolism cage; wheel running; measuring method

2022-02-23;

2022-03-30;

2022-04-08

國家自然科學基金項目(編號：31630091，32100931)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 31630091, 32100931)]

曾義準，本科，專業(yè)方向：細胞生物學。E-mail: 20194250014@stu.suda.edu.cn

徐瓔，博士，教授，研究方向：生物鐘。E-mail: yingxu@suda.edu.cn

10.16288/j.yczz.22-051

(責任編委: 陳帥)