聚對(duì)苯二甲酸乙二酯微生物降解研究進(jìn)展

覃偉洪,楊志祥,張海霞,丁功濤

(1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生物工程與技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730030；3.西北民族大學(xué) 中國(guó)-馬來西亞國(guó)家聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730030)

0 前言

聚對(duì)苯二甲酸乙二酯(PET)可以由苯二甲酸與乙二醇通過縮聚而成，以半結(jié)晶或無定型的形式存在，熔點(diǎn)為250～255 ℃。PET呈乳白色或淺黃色，表面平滑且有光澤，有較高的耐熱性與穩(wěn)定性，同時(shí)電絕緣性十分優(yōu)良，在高溫情況下，其電性能不會(huì)受太大影響[1]。

1930年—1960年，部分國(guó)家開始以化石為原料生產(chǎn)塑料，其中PET被廣泛應(yīng)用于包裝、汽車及紡織行業(yè)[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年全球PET的生產(chǎn)量高達(dá)7 968萬t，并且每年仍然以8.5%的速率在提升[3]。由于PET是一種有機(jī)高分子聚合物，在不經(jīng)過任何處理的自然情況下難以得到快速有效的降解，如果將其丟棄在自然環(huán)境中，勢(shì)必會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重的損害。在農(nóng)業(yè)中，大量使用的地膜未能全部除凈，地膜會(huì)被分解成微塑料沉積在土壤中，不斷富集，這會(huì)對(duì)土壤與農(nóng)作物產(chǎn)生嚴(yán)重的危害：土壤的理化成分和微生物的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變；農(nóng)作物的生長(zhǎng)受到影響，微塑料的存在阻礙了植物吸收施溉的肥料[4]。與此同時(shí)，塑料污染也會(huì)對(duì)陸地生物造成影響，微塑料可以通過呼吸道進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，對(duì)動(dòng)物機(jī)體造成不同程度的損害[5]。JIN Y X等[6]設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)讓小鼠食用塑料，隨后對(duì)小鼠體內(nèi)微生物群體進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)小鼠胃中多數(shù)有益的微生物消失，腸道菌群失衡，代謝功能混亂。不僅如此，人們常使用的皮膚清潔劑，如肥皂、洗面奶等，其中添加了塑料相關(guān)成分，被用于去除角質(zhì)，這些含有塑料的清潔劑長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致塑料在皮膚上聚集，塑料逐漸滲入皮膚中，最終引起皮膚損傷[7-8]。這些無法降解的塑料不僅會(huì)危害動(dòng)植物，對(duì)人類也會(huì)造成不良后果。而對(duì)于海洋而言，危害更加嚴(yán)重[9]。海洋中的污染主要來自于污水處理廠，即使工廠能夠通過凈水技術(shù)除去大部分的塑料，但隨著排放量的擴(kuò)大，塑料含量會(huì)不斷增加，對(duì)海洋生物造成致命的威脅[10]。大量堆積的廢棄塑料會(huì)被海洋生物攝入，使其生理出現(xiàn)異常，如內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失調(diào)、死亡等;部分?jǐn)z入廢棄塑料的海洋生物被打撈制成海產(chǎn)品后被人類購(gòu)買并食用，也會(huì)對(duì)人體造成嚴(yán)重的危害[2]。因此，塑料污染一直是人類關(guān)注的焦點(diǎn)，解決塑料污染刻不容緩。

1 現(xiàn)階段主要降解PET的方法

目前，處理PET的方法主要有填埋法、再生利用法、直接焚燒法、光分解法，以及生物降解法5種方法，其優(yōu)缺點(diǎn)比較見表1[11-14]。

表1 PET處理方法比較

1.1 填埋法

填埋法是目前主流的處理廢棄塑料的方法之一，將廢棄塑料填埋在地底，旨在通過土壤中存在的以塑料為碳源的微生物進(jìn)行自然降解。該方法成本低并且易實(shí)現(xiàn)，但是以破壞環(huán)境為代價(jià)，不符合可持續(xù)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的要求[13]。由于被填埋的塑料沒有經(jīng)過任何處理，直接進(jìn)行填埋，微生物無法對(duì)這些高聚物直接進(jìn)行降解，即使能進(jìn)行降解，降解速度也非常緩慢，導(dǎo)致土壤中的廢棄塑料長(zhǎng)時(shí)間滯留，極大地減少了土地耕種面積，并且導(dǎo)致土壤質(zhì)量惡化，加重土地負(fù)擔(dān)[11]。

1.2 再生利用法

再生利用法是指將廢棄塑料通過分類回收后對(duì)其進(jìn)行物理、化學(xué)等處理，使之能夠分解為小分子的石油原料(烴類)，用于再生產(chǎn)[15]。該方法雖然有利于保護(hù)環(huán)境，但是難以實(shí)現(xiàn)垃圾分類，在處理廢棄塑料的過程中，需要耗費(fèi)較大的物力與財(cái)力，經(jīng)濟(jì)成本過高[16]。因此，再生利用法仍需要進(jìn)行技術(shù)改良，降低經(jīng)濟(jì)成本，并且解決垃圾分類困難的問題。

1.3 直接焚燒法

1.4 光分解法

光分解法是指采用光線與催化劑將塑料分解成燃料，實(shí)現(xiàn)再利用的方法。該方法在處理塑料時(shí)不會(huì)產(chǎn)生溫室氣體，但所用光照為人造太陽(yáng)光，光分解效率極低，且最終產(chǎn)物只有甲酸，產(chǎn)物單一化[13]。研究表明，該方法在分解塑料方面極具潛力，但該技術(shù)尚未成熟，難以實(shí)現(xiàn)完全降解。

1.5 生物降解法

生物降解法是極具前景的處理廢棄塑料的方法之一。生物降解法通過微生物或微生物產(chǎn)酶對(duì)廢棄塑料進(jìn)行降解，降解過程中不產(chǎn)生任何有害氣體，并且經(jīng)濟(jì)效益極高[14]。雖然該方法存在菌種培養(yǎng)條件嚴(yán)苛、發(fā)酵產(chǎn)物提取率低等問題，但是與其他方法相比仍具有較高的經(jīng)濟(jì)效益與降解速率，同時(shí)對(duì)環(huán)境無污染[2]。因此，該方法是處理廢棄塑料的最佳方法。近年來許多研究人員發(fā)現(xiàn)了較多菌株或菌株分泌物能夠?qū)⑺芰辖到鉃槎趸?、水、乙醇等?duì)環(huán)境無害的產(chǎn)物，為生物法降解塑料提供了有利條件。

2 生物降解法降解PET

生物降解法是指通過微生物或微生物的產(chǎn)物將底物分解為小分子的過程[17]。

在微生物降解PET塑料的過程中，大多數(shù)生化反應(yīng)在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，但高分子聚合物無法被微生物細(xì)胞直接吸收轉(zhuǎn)化；因此，必須依靠產(chǎn)生的胞外酶對(duì)PET的表面膜進(jìn)行分解，降低其分子質(zhì)量，當(dāng)分子質(zhì)量降低到能夠產(chǎn)生水溶性中間體時(shí)，微生物細(xì)胞可進(jìn)行轉(zhuǎn)化吸收，生成二氧化碳、水、甲醇等最終代謝產(chǎn)物，降解PET塑料[18]，微生物降解PET的過程見圖1。微生物具有個(gè)體微小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、分布廣和繁殖能力強(qiáng)等特點(diǎn)，通過微生物的作用不僅可以降解頑固、有害的廢棄塑料，還能進(jìn)一步修復(fù)生態(tài)環(huán)境。

圖1 微生物降解PET過程

生物降解法主要采用發(fā)酵產(chǎn)物(主要為酶)，對(duì)塑料進(jìn)行降解。降解PET的酶主要包括角質(zhì)酶、酯酶、脂肪酶、降解酶PETase等[19]。這些酶需要進(jìn)行酶工程或蛋白質(zhì)工程改造后，才能最大化發(fā)揮降解作用。其中，角質(zhì)酶及其同系物對(duì)PET表現(xiàn)出較大的降解潛力，與脂肪酶、酯酶相比，角質(zhì)酶的底物特異性廣泛，能夠降解其他聚酯[20]。2016年，TANASUPAWAT S等[21]發(fā)現(xiàn)了一種新型的PET降解酶——PETase，其可將PET降解為對(duì)環(huán)境無污染的產(chǎn)物，為研究降解PET塑料提供了新的思路。

現(xiàn)階段采用角質(zhì)酶與PETase對(duì)PET進(jìn)行降解的研究占大多數(shù)。采用脂肪酶的研究較少，主要原因?yàn)橹久傅幕钚灾行谋唤Y(jié)構(gòu)域阻礙，活性降低，應(yīng)用較少[22]。酯酶只能對(duì)PET的表面親水性進(jìn)行改良，還未能達(dá)到降解的效果[23]。常用降解PET的酶見表2[24-27]。

表2 常用降解PET的酶

2.1 角質(zhì)酶

MüLLER R J等[18]通過實(shí)驗(yàn)證明，TfH屬于角質(zhì)酶的一種，能夠降解結(jié)晶度為10%的PET薄膜，時(shí)間在3周左右，每周需要更換酶液，對(duì)比對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組PET的質(zhì)量降低50%，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，確定損失的質(zhì)量為降解的質(zhì)量。為了進(jìn)一步提高TfH的熱穩(wěn)定性，THEN J等[25]向其添加足夠的量Ca2+、Mg2+，使酶中存留至少10 mmol的Ca2+、Mg2+，提高了酶的熔點(diǎn)，在65 ℃使PTE膜的質(zhì)量損失率達(dá)到13%。

KAWAI F等[24]在日本采用堆肥法分離出一種角質(zhì)酶。最先分離出了一株病毒體，名為綠色糖單胞菌AHK190，隨后從該病毒體中獲得一種新的PET降解酶——Cut190，經(jīng)過酶工程的技術(shù)改造得到了最佳突變體Cut190。該突變體用絲氨酸(Ser)(該Ser被證明可以提高酶的穩(wěn)定性，與被取代的Ser構(gòu)型存在差異)與精氨酸(Arg)分別取代226位的Ser與228位的Ser，酶活性與熱穩(wěn)定性均有所提高。在63 ℃時(shí)，該酶可以降解低結(jié)晶度薄膜，降解率達(dá)到27%，比野生型的酶活性高出1.5倍左右；同時(shí)，該酶在65 ℃孵育1 h后，酶活性變化可忽略不計(jì)，甚至在70 ℃時(shí)仍有最高的酶剩余活性。

2.2 PETase

TANASUPAWAT S等[21]發(fā)現(xiàn)菌株Ideonellasakaiensis可分泌出兩種酶，一種為PETase，另一種為MHETase，這兩種酶可以形成一種新的分解PET的體系。PET與PETase相互作用時(shí)，PET會(huì)被分解為對(duì)苯二甲酸乙二醇二酯(BHTE)、MHET、對(duì)苯二甲酸(TPA)，PETase會(huì)繼續(xù)與BHTE作用，將其降解為MHET，MHETase與MHET作用，將MHET降解為TPA與乙二醇(EG)。這兩種產(chǎn)物對(duì)環(huán)境友好性極高，PETase在30 ℃下，與低結(jié)晶度PET作用6周，基本可以達(dá)到完全降解。PETase是目前降解速率與降解程度最高的酶。

PETase屬于α/β水解酶折疊方式，其活性中心由9個(gè)β鏈組成，具有嚴(yán)格的催化三聯(lián)體(S160-H237-D206)，結(jié)構(gòu)中存在兩個(gè)二硫鍵，在30～40 ℃催化效果更好[28]。與其他酶相比，該酶具有以下優(yōu)勢(shì)[2,20]：

(1)對(duì)PET具有高度的偏愛性，無法降解其他聚酯。

(2)在常溫、中性pH的條件下能夠降解PET，其他酶的溫度相對(duì)較高。

(3)對(duì)低結(jié)晶度的PET降解率達(dá)到90%以上。

(4)對(duì)高結(jié)晶度的PET降解率比傳統(tǒng)的降解酶高20倍左右。

(5)降解產(chǎn)物對(duì)環(huán)境友好性高。

雖然該酶顯現(xiàn)出多種優(yōu)勢(shì)，但在實(shí)際應(yīng)用過程中仍存在以下問題：

(1)無法達(dá)到PET的玻璃化溫度(Tg)。高分子聚合物處于高彈狀態(tài)(高于Tg的狀態(tài))時(shí)，酶更容易向非結(jié)晶區(qū)攻擊，加快降解的速率[29]。PETase降解最適宜的溫度處于30～40 ℃，酶促反應(yīng)是在水溶液中進(jìn)行的，Tg降低至60～65 ℃[19],兩者存在較大差距。

為了進(jìn)一步提高PETase的降解活性與熱穩(wěn)定性，SON H F等[30]采用蛋白質(zhì)工程的手段，向PETase的活性位點(diǎn)中引入氫鍵，比野生型的PETase熔點(diǎn)提高8.81 K，兩者在40 ℃進(jìn)行降解，速率卻提高了13.8倍。

(2)高聚合度PET降解速率低。PET降解酶更傾向于進(jìn)攻聚酯的非結(jié)晶區(qū)，PETase也是，結(jié)晶度越高，降解速率越低。因此，在降解高結(jié)晶度聚酯的過程中，需要降低結(jié)晶度。先對(duì)塑料進(jìn)行預(yù)處理(物理處理或化學(xué)處理)，再使用PETase進(jìn)行降解，效果更佳。

(3)中間產(chǎn)物與酶的抑制劑結(jié)構(gòu)相似。PETase將PET降解為BHET 和 MHET，這兩種中間產(chǎn)物與酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑結(jié)構(gòu)相似，會(huì)與酶的活性位點(diǎn)進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，使酶無法與底物進(jìn)行有效接觸[2]?？梢圆捎霉潭ɑ傅姆椒?，將能夠水解BHET和MHET的酶與PETase進(jìn)行固定化，降低抑制劑的影響。

3 可行性研究

筆者基于現(xiàn)有研究，對(duì)采用生物降解法降解PET的可行性方法總結(jié)如下：

(1)繼續(xù)分離高效分解PET的微生物。鑒于聚酯類塑料的頑強(qiáng)性，可以從較惡劣的環(huán)境中進(jìn)行分離，如塑料廢棄場(chǎng)、垃圾回收站等。一旦分離出新的微生物，可推動(dòng)PET降解的發(fā)展。不過，該方法所需年限久、財(cái)力大，往往投入與回報(bào)不成正比，對(duì)研究人員的傷害較大。

(2)對(duì)現(xiàn)有的降解酶進(jìn)行改造。經(jīng)過近年的研究，有關(guān)人員已經(jīng)將PETase的結(jié)構(gòu)、降解過程、影響降解因素研究透徹，只要將其改造至符合工業(yè)化標(biāo)準(zhǔn)，即可應(yīng)用到實(shí)際中。

可以對(duì)PETase進(jìn)行以下幾個(gè)方面的改造：提高產(chǎn)量、提高該酶熱穩(wěn)定性與酶活力、增大與底物的接觸面積、提高酶的降解速率。

①提高產(chǎn)量：通過基因工程的手段，將PETase的基因轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中，與感受態(tài)細(xì)胞融合，構(gòu)建過表達(dá)的工程菌，篩選出過表達(dá)的菌株，對(duì)產(chǎn)物酶進(jìn)行酶活力測(cè)定，如果酶活性較高，符合降解的要求，即可投入生產(chǎn)。

②提高酶的熱穩(wěn)定性與酶活性：具有較高熱穩(wěn)定性的蛋白酶，通常結(jié)構(gòu)內(nèi)存在較多數(shù)量的二硫鍵，而PETase有2個(gè)二硫鍵，可將非活性中心的氨基酸殘基替換成半胱氨酸，增加酶分子的二硫鍵，提高酶的熱穩(wěn)定性；向酶分子中加入某些二價(jià)金屬離子，如Mg2+、Ca2+等，這些離子是酶的調(diào)節(jié)劑，能夠提高其活性與穩(wěn)定性。

③增大與底物接觸面積：由于降解酶無法將PET聚酯高分子化合物直接吸收進(jìn)行分解代謝，需要先吸附到其表面，從表面開始降解；當(dāng)塑料被侵蝕成為水溶性的中間物時(shí)可被細(xì)胞轉(zhuǎn)化吸收，最后降解為水、二氧化碳等物質(zhì)。因此，需要增加酶分子與底物表面的接觸面積。影響酶與底物接觸的因素有兩個(gè)，一為中間產(chǎn)物會(huì)與酶競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，二為高聚合物的直徑。為了降低中間產(chǎn)物對(duì)酶的影響，可以加入分解中間產(chǎn)物的酶與PETase進(jìn)行固定化，采用雙酶體系進(jìn)行降解。有關(guān)人員在使用角質(zhì)酶對(duì)PET進(jìn)行降解時(shí)，采用雙酶體系進(jìn)行降解，降解效果提高90%以上，因此，PETase在降解時(shí)也可以進(jìn)行嘗試。通過物理或者化學(xué)方法對(duì)底物進(jìn)行預(yù)處理，將其破碎為顆粒直徑大小，酶與底物的結(jié)合會(huì)更充分。

④提高酶的降解速率：酶更傾向于進(jìn)攻非結(jié)晶區(qū)，聚合度越高、結(jié)晶度越高，酶的降解速率就越低?？梢圆捎没瘜W(xué)方法先解聚PET，使之成為低聚物，增加非結(jié)晶區(qū)比例，使酶分子進(jìn)攻靶點(diǎn)的精確度提高、降解速率提升。

4 結(jié)語

隨著塑料污染的不斷加重，國(guó)家越來越重視該問題，并采取多方面的措施，旨在有效緩解塑料污染問題。在法律上，從限塑令到禁塑令，從根本上解決塑料制品的產(chǎn)生；在生活上，呼吁人們減少塑料袋的使用，使用環(huán)保購(gòu)物袋；在處理塑料上，采用經(jīng)濟(jì)效益高，且對(duì)環(huán)境友好的處理方法。由此，提出以下展望：

(1)進(jìn)一步研究生物法降解塑料機(jī)理。微生物的種類繁多，習(xí)性存在較大差異，目前有研究表明，某些昆蟲在體內(nèi)可降解塑料，如黃粉蟲在體內(nèi)就可將塑料降解，原因是腸道內(nèi)存在可降解的塑料微生物，但降解機(jī)理有待考究，在未來仍有較大的研究發(fā)展空間。

(2)開發(fā)塑料替代材料。減少生活中不可降解塑料的使用，可以從生物體內(nèi)提取出有效成分制備成可降解環(huán)保材料，這種材料可以被分解為大分子可降解聚合物，在使用的過程中減輕塑料污染。

(3)進(jìn)一步改造塑料降解酶，提高降解能力。目前，野生菌所分泌的酶，在降解過程中雖然有較好的表現(xiàn)，但是產(chǎn)量低、應(yīng)用成本高，不利于應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中;因此，需要對(duì)其進(jìn)行改造，構(gòu)建出具有高降解能力的菌株，才能減輕污染。