幽門螺桿菌感染對(duì)胃癌組織miR-146a表達(dá)及胃癌惡性進(jìn)展的影響

常永欣 王 鑫 唐照鵬

胃癌為常見消化道腫瘤，發(fā)病率與病死率均較高，目前具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，與遺傳、飲食習(xí)慣、消化疾病、幽門螺桿菌感染等因素有關(guān)，其中幽門螺桿菌感染為公認(rèn)的胃癌重要誘因[1-2]。分子生物學(xué)顯示胃癌發(fā)病與凋亡基因失調(diào)、抑癌基因失活、致癌基因激活有關(guān)，小分子RNA(miRNA)為相對(duì)保守且非編碼的單鏈RNA，經(jīng)降解mRNA或抑制轉(zhuǎn)錄能調(diào)節(jié)基因表達(dá)[3-4]。研究顯示[5]，miR-146a可參與免疫反應(yīng)，對(duì)多種腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡過程具有一定作用，目前關(guān)于miR-146a在胃癌中研究較少[6]。為此，本研究探討了幽門螺桿菌感染對(duì)胃癌組織miR-146a表達(dá)情況及對(duì)胃癌惡性進(jìn)展的影響，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2019年5月至2021年5月我院收治的82例胃癌患者，其中男性49例，女性33例；年齡為38～70歲，平均(49.68±8.71)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《胃癌診治難點(diǎn)中國專家共識(shí)(2020版)》標(biāo)準(zhǔn)[7]，且經(jīng)術(shù)后病理檢查確診為胃癌；無幽門螺桿菌根除史；無手術(shù)與放化療治療史；簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤患者；合并高血壓、糖尿病等慢性疾病患者；嚴(yán)重心肝腎功能不全患者；妊娠或哺乳期婦女；精神疾病或意識(shí)障礙患者?；颊咝g(shù)后進(jìn)行病理取材，檢測腫瘤類型、大小、分化程度、TNM分期與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；并對(duì)術(shù)后切除胃癌組織進(jìn)行幽門螺桿菌檢測，根據(jù)感染情況將患者分為陽性組(n=54例)與陰性組(n=28例)。陽性組男性32例，女性22例；平均年齡為(50.16±9.02)歲。陰性組男性17例，女性11例；平均年齡為(49.72±8.67)歲。2組資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 幽門螺桿菌感染檢測方法 患者檢查前均無抗菌素與制酸藥等服用史，于術(shù)后的病理標(biāo)本切除后取適量胃癌組織及癌旁組織進(jìn)行檢測，生理鹽水清洗后將組織用改良Giemsa染色玉快速尿素酶試驗(yàn)法測定幽門螺桿菌，兩試驗(yàn)均呈陽性則表示幽門螺桿菌感染，反之則無幽門螺桿菌感染[8]。

1.2.2 組織處理 將患者組織標(biāo)本于手術(shù)切除后半小時(shí)內(nèi)常規(guī)固定、包埋，制備切片進(jìn)行HE染色觀察，免疫組化檢測幽門螺桿菌表達(dá)。

1.2.3 提取組織標(biāo)本中RNA 抽提多張組織標(biāo)本切片，參照說明書進(jìn)行：(1)取出組織樣品中石蠟，于液氮內(nèi)研磨后移入離心管，加入二甲苯混合；(2)組織與二甲苯混合后加熱，融化石蠟；(3)室溫下離心2 min，將組織沉淀去除二甲苯；(4)加入乙醇洗滌，室溫下離心除去乙醇，再重復(fù)1次洗滌；(5)干燥，沉淀中加digestion buffer與protease混勻，置于50 ℃、80 ℃中15 min，離心后吸取上清液移入新離心管；(6)加入isolation additive與乙醇混勻；(7)使用過濾柱過濾裂解，離心去除濾液；(8)過濾器內(nèi)加洗滌液離心，拋棄管中內(nèi)濾液；(9)洗滌液反復(fù)洗滌2次過濾柱，離心去除殘存液體；(10)過濾柱轉(zhuǎn)移至新收集管，加入洗脫液于過濾柱上，室溫下靜置半小時(shí)；(11)過濾器內(nèi)加入洗滌液；室溫靜置30～60 s，離心；(12)再次洗滌過濾柱2次，離心去除殘液；(13)轉(zhuǎn)移柱子于另一收集管，加洗脫液靜置，離心得到RNA；(14)通過紫外分光光度計(jì)測量吸光度，瓊脂糖凝膠電泳檢測其RNA完整性。

1.2.4 qRT-PCR檢測miR-146a表達(dá) RNA逆轉(zhuǎn)錄：①于EP管中加總RNA與oligo，再加DEPC水混勻，離心；②于PCR儀溫浴5 min后再冰浴3 min；③配制RT反應(yīng)體系，在EP管內(nèi)加dNTP mix、reaction buffer、ribolock rnase inhibitor、revertAid m-mulv reverse transcriptase；④反應(yīng)體系溫水水浴1 h后，于70 ℃下水浴5 min使RT酶發(fā)生失活；⑤逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，冷凍保存。定量檢測PCR：①去除cDNA為模板，配置PCR反應(yīng)體系；②高溫下預(yù)變性5 min，再變性10 s；③于60 ℃下退火延伸30 ℃，擴(kuò)增循環(huán)，于60 ℃下延伸采集熒光；結(jié)束后得到樣本CT值[9]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 患者miR-146a表達(dá)情況

陽性組胃癌組織miR-146a表達(dá)水平高于陰性組(P<0.05)。見圖1。

圖1 組織miR-146a表達(dá)水平

2.2 幽門螺桿菌感染與胃癌惡性程度關(guān)系

幽門螺桿菌感染陽性組與陰性組患者在腫瘤類型方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；幽門螺桿菌感染與胃癌患者腫瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。見表1。

表1 幽門螺桿菌感染與胃癌惡性程度關(guān)系/例

2.3 胃癌惡性進(jìn)展的危險(xiǎn)因素

經(jīng)Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型多因素分析顯示，幽門螺桿菌感染與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為影響胃癌惡性進(jìn)展的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表2。

表2 多因素Cox比例回歸模型分析胃癌惡性進(jìn)展

3 討論

胃癌具有高侵襲性與轉(zhuǎn)移率，患者存活率低。隨著如今生活水平提高、飲食結(jié)構(gòu)與生活習(xí)慣的改變，胃癌發(fā)病率逐年上升且具有年輕化趨勢。多數(shù)胃癌患者確診時(shí)已為中晚期，傳統(tǒng)手術(shù)療效不佳，術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率較高，5年生存率低于50%[10-11]。故確定胃癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制，可為早期防治提供參考依據(jù)。

胃癌發(fā)生發(fā)展為長期多因素影響作用結(jié)果，與遺傳、飲食習(xí)慣、消化疾病、幽門螺桿菌感染等因素有關(guān)，其中幽門螺桿菌感染為公認(rèn)的胃癌重要誘因。研究顯示[12]，胃炎、胃潰瘍等疾病中均能檢測出幽門螺桿菌，持續(xù)幽門螺桿菌感染可導(dǎo)致腸上皮化生、胃黏膜萎縮等，進(jìn)而發(fā)展為胃癌。幽門螺桿菌多寄居在胃竇黏膜小凹中，該部位常發(fā)生腸上皮化生、不典型增生，是胃癌發(fā)病率最高部位。長期幽門螺桿菌慢性感染可使胃黏膜細(xì)胞分泌炎癥因子，進(jìn)而引發(fā)粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞出現(xiàn)浸潤，局部產(chǎn)生慢性炎癥，并使胃黏膜萎縮或不典型增生[13-14]。故幽門螺桿菌感染為胃癌發(fā)病的危險(xiǎn)因素。幽門螺桿菌感染導(dǎo)致胃癌發(fā)生為臨床公認(rèn)，但其感染與胃癌惡性進(jìn)展關(guān)系尚存在爭議。miRNA 為內(nèi)源性非編碼調(diào)控小分子RNA家族，在真核生物中廣泛存在，多種細(xì)胞生物基因組編碼。miRNAs參與多種生理病理過程，其中miRNA在腫瘤中研究最活躍[15]。多項(xiàng)研究表明miRNA參與細(xì)胞增殖分化、凋亡等多種腫瘤發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)過程，其異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展和患者預(yù)后有關(guān)。miR-146a位于第5號(hào)染色體上，對(duì)細(xì)胞生長分化與存活等生命過程有影響作用，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[16-17]。rs2910164位于miR-146a前體序列上，堿基G>C突變使莖環(huán)區(qū)配位錯(cuò)亂。體外研究顯示，pre-miR-146a序列中C等位基因?qū)?yīng)G等位基因，pre-與成熟的miR-146a量均降低，C等位基因干擾核因子結(jié)合pre-miR-146a[18-19]。多種癌細(xì)胞株證實(shí)SNP對(duì)成熟miR-146a表達(dá)有一定影響，包括胃癌、甲狀腺癌、卵巢癌等。miR-146a變異與胃癌關(guān)系的研究集中于發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。不同研究的miR-146a基因型與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系有一定差異，但多數(shù)研究顯示GG基因型會(huì)提高胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。正常組織與癌旁組織中的miRNA表達(dá)具有顯著差異，差異表達(dá)可能為癌基因或抑癌基因在腫瘤發(fā)生中作用。miR-146a為miRNA成員，為癌基因或抑癌基因，能發(fā)揮不同生物學(xué)作用[20]。miR-146a于膠質(zhì)瘤內(nèi)表達(dá)低于癌旁正常組織，胃癌組織中表達(dá)也類似，但在甲狀腺癌中發(fā)表達(dá)上調(diào)。本研究胃癌組織中miR-146a表達(dá)下調(diào)。腫瘤細(xì)胞分化程度不同，其miRNA表達(dá)量也不盡相同。miR-146a在高分化細(xì)胞中表達(dá)最高，低分化癌細(xì)胞中表達(dá)量最低，說明miR-146a表達(dá)與腫瘤分化嚴(yán)重程度有關(guān)[21-22]。

細(xì)胞增殖凋亡為生物體生長發(fā)育與繁殖過程中必須的環(huán)節(jié)，但當(dāng)細(xì)胞增殖發(fā)生失控，機(jī)體本身正常機(jī)制被擾亂而誘發(fā)腫瘤。過表達(dá)miR-146a對(duì)胃癌細(xì)胞遷移有抑制作用，下調(diào)miR-146a能提高癌細(xì)胞遷移力[23-24]。本研究證實(shí)miR-146a對(duì)胃癌細(xì)胞增殖凋亡有一定影響。將miR-146a mimics與miR-146a control轉(zhuǎn)染至胃癌組織中，顯示轉(zhuǎn)染miR-146a mimics細(xì)胞增殖低于miR-146a control，其凋亡率高于miR-146a control，提示轉(zhuǎn)染miR-146a模擬物能抑制細(xì)胞增殖，對(duì)其凋亡具有促進(jìn)作用[25-26]。細(xì)胞凋亡受多基因調(diào)控，促凋亡蛋白Bax與抗凋亡蛋白Bcl-2為重要蛋白，Bax上升能使細(xì)胞凋亡，當(dāng)Bcl-2上升可降低細(xì)胞凋亡率。故研究提出細(xì)胞凋亡與Bax和Bcl-2比率相關(guān)，當(dāng)該蛋白比率上調(diào)可抑制細(xì)胞凋亡，反之促進(jìn)細(xì)胞凋亡。幽門螺桿菌感染促進(jìn)胃癌侵襲與轉(zhuǎn)移機(jī)制不明確，可能與miR-146a高表達(dá)有關(guān)[27-28]。

綜上所述，幽門螺桿菌感染對(duì)胃癌組織miR-146a表達(dá)具有上調(diào)作用，能促進(jìn)胃癌侵襲轉(zhuǎn)移能力，可為臨床早期防治胃癌提供參考依據(jù)。