犬子宮內(nèi)膜炎的新分類：從解剖學和組織病理學角度分析

王靖萱，徐 瑤，王顥然，劉志遠，趙啟達，劉瑞芳，王鑫宇，劉 濤，宋旭東，肖建華*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 黑龍江省普通高等學校動物普通疾病防治重點實驗室，哈爾濱 150030；2.宋醫(yī)生寵物醫(yī)院，哈爾濱 150030)

子宮內(nèi)膜炎是指子宮內(nèi)膜結構發(fā)生炎性改變，是母犬最常見且最復雜的疾病，嚴重影響母犬的繁殖性能[1-2]。目前，一般認為導致本病的因素包括生殖激素及其受體功能障礙、致病菌感染和品種遺傳等[3-5]。在過去的幾十年里，與犬類繁殖相關的疾病日益增加[6]。犬子宮內(nèi)膜炎常在母犬發(fā)情、交配、流產(chǎn)和分娩之后發(fā)生，其中，老齡犬的發(fā)病率較高，有研究發(fā)現(xiàn)，高于8歲的母犬發(fā)病率高達15%～50%[7]，且多發(fā)于屢配不孕和無生育史的母犬[8-9]。

De Bosschere等[10]通過計算機圖像分析了68例患子宮疾病的犬的病例：測量子宮內(nèi)膜占子宮內(nèi)膜腺腔的百分比，計算子宮內(nèi)膜/肌層(Endo/Myo)比值，觀察子宮內(nèi)膜間質水腫、出血、成纖維細胞增殖和炎癥反應情況。但由于個別動物疾病的嚴重程度和研究人員使用的診斷標準不一，目前還缺乏深入且可應用于臨床診斷的子宮內(nèi)膜炎分類。因此，本研究的目的是對犬子宮內(nèi)膜炎的組織病理學類型進行分析，進而為其標準化提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本試驗共收集并檢測了40例子宮內(nèi)膜炎病例，患犬的年齡從9個月到10歲不等，動物在接受卵巢子宮摘除術之前沒有經(jīng)過任何的激素療法，且均無生育史。病例均取自哈爾濱市宋醫(yī)生寵物醫(yī)院(2018.05—2019.12)，所有的病例均進行了臨床及B超影像學診斷(圖1)，其中包括30例出現(xiàn)相關臨床癥狀并經(jīng)B超檢查確診為子宮內(nèi)膜炎的病例和10例進行生理絕育手術的健康母犬，并將后者作為試驗對照。

2張在本次病例收集中具有典型性的子宮蓄膿B超確診影像圖。子宮角均明顯擴張，宮腔可見液性暗區(qū)(細箭頭所示)，提示宮腔積液。A.子宮壁顯著增生變厚(粗箭頭)，內(nèi)膜游離側呈褶皺樣；B.宮腔內(nèi)液性暗區(qū)面積占比較大，子宮壁明顯變薄(粗箭頭)

1.2 血液學分析

用BC-5000vet全自動獸用五分類血液細胞分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司產(chǎn)品)，按產(chǎn)品使用說明測定紅細胞檢測指標：紅細胞數(shù)(RBC)、平均紅細胞體積(MCV)、紅細胞壓積(HCT)、血小板壓積(PCT)、血紅蛋白(HGB)、平均紅細胞血紅蛋白量(MCH)和平均紅細胞血紅蛋白濃度(MCHC)。以及測定白細胞檢測指標：嗜中性粒細胞數(shù)(Neu)、淋巴細胞數(shù)(Lym)、單核細胞數(shù)(Mon)、嗜酸性粒細胞數(shù)(Eos)和嗜堿性粒細胞數(shù)(Bas)。

1.3 病理組織學檢測

對臨床上的絕育及子宮內(nèi)膜炎發(fā)病犬，在進行卵巢子宮摘除術后，無菌收集子宮組織，一部分迅速用液氮冷凍，隨后轉移至凍存管內(nèi)于-80 ℃冰箱保存。另一部分于4%多聚甲醛固定后常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚度4 μm，經(jīng)HE染色中性樹膠封片后，在光學顯微鏡(日本OLUMPUS，BX53)下觀察子宮內(nèi)膜及其肌層組織狀態(tài)，對典型病變處進行拍照保存，同時利用Image J軟件測量并計算內(nèi)膜與肌層厚度比。

1.4 Real-time PCR檢測

用TRIzol(中國Solarbio公司)提取子宮內(nèi)膜總RNA，并用NanoDrop2000紫外分光光度計(Thermo Fisher Science)對其進行定量。根據(jù)制造商的說明書，使用NovoScript?Plus All-in-one 1stStrand cDNA Synthesis SuperMix(gDNA Purge)(中國NovoProtein公司)合成cDNA。隨后，將cDNA 在StepOnePlus儀器(中國Thermo Fisher Science公司)上使用特異的有效引物和NovoStart?SYBR qPCR SuperMix Plus(中國Novoprotein公司)進行RT-qPCR分析。采用StepOnePlusTM軟件(中國Thermo Fisher Science公司)對標準進行分析和定量，選用的內(nèi)參基因是GAPDH。參照NCBI上已經(jīng)發(fā)表的犬GAPDH基因的mRNA序列(GenBank登錄號為NM001003142.2)，利用Primer Premier 5.0設計并合成3對特異性引物，IL-1β上游引物:5′-TGTGAAGTGCTGCTGCCAAGAC-3′;下游引物：5′-ACAGAGCTGGTGGGAGACTTGC-3′；IL-6上游引物：5′-TGCTCCTGGTGATGGCTAC-3′；下游引物5′-ATTATCCGAACAGCCCTC3′；IL-8上游引物：5′-AACACACTCCACACCTTTCCATCC-3′；下游引物5′-TCCAGGCACACCTCATTTCCATTG-3′。

1.5 統(tǒng)計學分析

real-time PCR反應中每個樣品均重復3次，試驗數(shù)據(jù)結果采用2-ΔΔCt算法和SPSS17.0軟件進行分析。所有測試數(shù)據(jù)均以“平均值±標準差(Means±SD)”表示。同時使用GraphPad Prism7.0軟件進行統(tǒng)計處理，采用單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 臨床癥狀

表1總結了30例患犬的病史和臨床癥狀，包括陰道分泌物、嗜睡/抑郁、食欲不振/厭食、多尿、煩渴貪飲、可觸摸到的子宮體增大、高熱和胃腸道功能障礙。

表1 患犬病史及臨床癥狀

2.2 血常規(guī)分析

無臨床癥狀組的所有血常規(guī)指標均在正常范圍內(nèi)。在臨床癥狀組的30份子宮樣本中，白細胞類指標出現(xiàn)異常的病例較多，紅細胞類指標檢測結果在正常范圍內(nèi)的病例較多，各項指標的具體變化范圍及檢測值分布見表2。

2.3 解剖學和組織病理學檢查

通過對Endo/Myo比值的測量，觀察到本研究中病例的Endo/Myo比值與De Bosschere等[10]描述的子宮內(nèi)膜炎的研究結果相似，詳細數(shù)據(jù)見表3。由于臨床癥狀組無炎癥類的病例數(shù)為1，此次數(shù)據(jù)測量計算不將其列為統(tǒng)計范圍內(nèi)。

表3 子宮內(nèi)膜炎的病理分類標準

健康類子宮外觀個體細小，雙側子宮角直徑均勻，無膨隆。內(nèi)觀宮腔內(nèi)膜表面光滑，顏色呈肉粉色(圖2A)。鏡下內(nèi)膜上皮完整，固有層腺體數(shù)量較少、大小適中，且結構完整無破壞，固有層基質均勻分布(圖2B、2C、2D)。

A.子宮角縱向切開圖片。B、C、D.HE染色的子宮內(nèi)膜上皮和固有層結構組織學圖像。放大倍數(shù)分別為40、100和400

內(nèi)膜囊性增生類子宮眼觀雙側子宮角細小直徑均勻、無膨隆。暴露宮腔可見子宮壁表面光滑、顏色正常，子宮壁無內(nèi)膜囊性增生樣病變，與健康子宮在解剖學水平上并無明顯差異(圖3A)。鏡下可見子宮內(nèi)膜存在特征性的囊性增生樣病變，基質成分減少(圖3B、3C、3D)。

A.子宮角縱向切開圖片。B、C、D.HE染色的子宮內(nèi)膜上皮和固有層結構組織學圖像。放大倍數(shù)分別為40、100和400。C中黑色箭頭所指為內(nèi)膜上皮結構，紅色箭頭為極度擴張的子宮腺體。D為C中黑色箭頭處的放大圖

輕度炎性浸潤類子宮的雙側子宮角膨隆不明顯。宮腔內(nèi)有少量渾濁、化膿性液體，子宮內(nèi)膜顯著充血，子宮壁顏色較深且紋路明顯(圖4A)。鏡下偶見內(nèi)膜上皮部分脫落，固有層淺層腺體呈扁的褶皺樣擴張，血管明顯充血，基質可見局部炎性細胞浸潤(圖4B、4C、4D)。

A.子宮角縱向切開圖片。B、C、D.HE染色的子宮組織學圖像。放大倍數(shù)分別為40、100和400

病理組織學檢查發(fā)現(xiàn)：重度炎性浸潤的子宮又可分為兩種類型，即增生型與萎縮型。外觀此類子宮的子宮角均顯著膨隆，經(jīng)測量此類患犬子宮角最大直徑為4.08 cm(大型犬)，最小直徑為1.83 cm(小型犬)。觸之彈性較大，顏色深暗呈粉紫色，子宮壁血管明顯擴張淤血。打開宮腔，里面充盈大量出血性/化膿性液體，散發(fā)惡臭氣味。重度炎性浸潤類(增生型)子宮眼觀內(nèi)膜表面布滿大小不一的透明或半透明的囊泡，同時伴有許多乳頭狀的贅生物，且內(nèi)膜表面附著少許血凝塊(圖5A)。鏡下可見內(nèi)膜上皮完全脫落，固有層子宮腺極度囊性擴張致使腺體破裂、與臨近腺體相連并內(nèi)折入腺腔，從而呈迷路樣外觀，固有層淺層基質成分基本消失，固有層深層基質則以嚴重炎性細胞浸潤為主(圖5B、5C、5D)。重度炎性浸潤類(萎縮型)子宮的眼觀可見內(nèi)膜萎縮，表面呈深紅色的蜂窩狀凹陷(圖6A)。鏡下可見大部分內(nèi)膜上皮壞死脫落，固有層子宮腺極度萎縮，甚至不見腺腔，基質減少，內(nèi)膜全層布滿大量的炎性細胞(圖6B、6C、6D)。

A.子宮角縱向切開圖片。B、C、D.HE染色的子宮組織學圖像。內(nèi)膜固有層淺層腺體嚴重擴張，腺上皮細胞形態(tài)肥大，呈空泡樣變性(黑色箭頭)。放大倍數(shù)分別為40、100和400

A.子宮角縱向切開圖片。B、C、D.HE染色的子宮組織學圖像。內(nèi)膜全層彌漫性炎性浸潤。放大倍數(shù)分別為40、100和400

在30例發(fā)病(或疑似發(fā)病)的犬中，有1例陰門出現(xiàn)少量異常分泌物，但經(jīng)病理學檢查未見子宮內(nèi)膜內(nèi)有炎性病變，眼觀可見雙側子宮角輕微膨隆(圖7A)，解剖顯露宮腔可見少量渾濁液體，鏡檢子宮內(nèi)膜輕度萎縮，基質成分明顯減少，未見炎性細胞浸潤(圖7B、C、D)。

A.子宮角縱向切開圖片。B、C、D.HE染色的子宮內(nèi)膜及肌層結構圖，內(nèi)膜層明顯萎縮。放大倍數(shù)分別為40、100和400

2.4 促炎因子IL-1β、IL-6和IL-8的表達量

如圖8A、8B和8C，相比健康子宮組織樣本，出現(xiàn)炎癥組織學表征的子宮樣本內(nèi)IL-1β、IL-6和IL-8的mRNA含量均明顯升高。其中，內(nèi)膜增生/萎縮型重度炎性浸潤子宮組織3種因子的mRNA含量顯著高于其它兩組(P<0.001)。

*和#表示兩組差異顯著，P <0.05；**表示兩組差異極顯著，P <0.01；****和####表示兩組極顯著，P <0.001；ns表示兩組差異變化無統(tǒng)計學意義

3 討 論

Barrau等[11]描述了母犬在發(fā)情周期中子宮內(nèi)膜厚度的變化周期。子宮壁的厚度從發(fā)情前期到發(fā)情后期的早期逐漸增加，然后逐漸減小，子宮內(nèi)膜和子宮肌層的厚度也都遵循相同的變化規(guī)律[12]。在發(fā)情前期，由于子宮內(nèi)膜發(fā)生水腫和增生，Endo/Myo比值很高。在發(fā)情期，這一比值迅速下降，然后在發(fā)情后期和間情期略有上升。從發(fā)情期到發(fā)情后期的早期，子宮腺體分泌活動增加，且增生、肥大，以一種高度分枝和盤繞的狀態(tài)存在。在發(fā)情后期，子宮腺細胞的大小比子宮腺腔的大小減小得更快，此時更容易導致腺體發(fā)生囊性增生[10]。在母犬的發(fā)情周期中，孕酮和雌激素可以促進子宮內(nèi)膜層增生增厚，減弱子宮平滑肌層的運動，抑制子宮內(nèi)局部免疫作用[13-14]。由于母犬具有以上發(fā)情特點，使其易患子宮類疾病。又由于大多數(shù)的犬慢性子宮內(nèi)膜炎病例在臨床上都出現(xiàn)了子宮內(nèi)膜囊性增生的病理表現(xiàn)，于是，Dow[15]建議使用“增生性子宮內(nèi)膜炎”來定義此類疾病。但這忽略了一個重要的病理過程，即組織的增生不一定引起其發(fā)生炎癥反應，且發(fā)生炎癥反應的病例大多會出現(xiàn)典型的臨床癥狀。雖然這種命名有一定的優(yōu)點，但由于它只描述了疾病過程的一個特征或一個階段，容易在臨床上引起誤診。為了深入分析子宮壁病變、減少犬子宮蓄膿的誤診幾率，De Bosschere等[10]根據(jù)Endo/Myo比值、炎性浸潤程度、子宮腺體的變化等病理特征對犬子宮蓄膿制定了較具體的組織學標準。同時，他們的研究也證實了子宮內(nèi)膜增生和宮腔積膿確實是兩個獨立的疾病類型。在他們的研究中，4只母犬的子宮內(nèi)膜出現(xiàn)輕度炎性細胞浸潤，腺腔占到子宮內(nèi)膜面積的(15.60±4.09)%。觀察到的Endo/Myo比值為1.26±0.29，他們將該組病例歸類為子宮內(nèi)膜炎組。通過Endo/Myo比值的測定，觀察到本試驗中所有病例的比值均在De Bosschere等[10]描述的參考范圍內(nèi)。在參考De Bosschere等[10,16]總結的組織學分類標準的基礎之上，本研究綜合患犬的臨床體征、影像學、血液學、組織病理學變化結果以及RT-qPCR(IL-1β、IL-6和IL-8)檢測結果，將40個 病例分為兩組：無臨床癥狀組(健康類和囊性子宮內(nèi)膜增生類)和臨床癥狀組(無炎癥類、輕度炎性浸潤類、增生型重度炎性浸潤類和萎縮型重度炎性浸潤類)。

大量研究表明，CEH和子宮內(nèi)膜炎在發(fā)展過程中可能都有自己特有的誘發(fā)因素[17]。有研究報道，性激素受體數(shù)量的變化可能增加患CEH的概率[18]。在本研究中，CEH類、輕度炎性浸潤類和增生型重度炎性浸潤類的誘因就不一樣，CEH母犬子宮中的子宮內(nèi)膜增生主要源于腺體囊性增生，而輕度炎性浸潤類和增生型重度炎性浸潤類母犬子宮的內(nèi)膜增生，則與間質內(nèi)成纖維細胞增殖、炎癥反應及其引發(fā)的腺體囊性變形有關。另外，Novak[19]指出，在人類的增生型子宮內(nèi)膜炎病例中，臨床上出現(xiàn)異常分泌物的癥狀是罕見的。而在Dow[15]報道的犬子宮蓄膿病例中，黏蛋白的產(chǎn)生似乎與增生的程度成正比。根據(jù)大量對犬子宮蓄膿的研究報道及本研究對子宮樣本進行的組織病理學檢查，可進一步證實犬CEH的病理變化應該是機體在生殖激素的異常作用下，導致子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量增多，體積增大，子宮內(nèi)膜增生增厚，增生肥大的子宮內(nèi)膜腺體分泌功能增強。根據(jù)子宮內(nèi)容物的黏度，即黏蛋白含量的多少，決定無菌液體是否在腺體和子宮腔內(nèi)積聚，無法排出，從而在宮腔內(nèi)形成積液。此時，由于子宮頸口未開張，沒有細菌進入到宮腔[20]，所以CEH組犬子宮組織沒有發(fā)生炎性細胞浸潤等炎癥過程，機體不表現(xiàn)患子宮內(nèi)膜炎較明顯的臨床癥狀。CEH增生的程度與是否有癥狀無直接關聯(lián)，只有并發(fā)或繼發(fā)炎癥時才出現(xiàn)癥狀。當子宮頸口開張時細菌進入宮腔，子宮內(nèi)容物被污染進而發(fā)生炎癥反應，而后CEH才表現(xiàn)出較明顯的子宮蓄膿的臨床癥狀[21-23]。

值得注意的是，De Bosschere等[10]采用計算機圖像分析系統(tǒng)對26只健康母犬和42只疑似宮腔積膿母犬的子宮進行組織學檢查，結果發(fā)現(xiàn)在42只存在疑似宮腔積膿臨床癥狀的母犬中，有12例子宮無炎癥反應，因此單純進行臨床檢查很難對子宮內(nèi)膜炎進行確診，即臨床上有癥狀但無炎癥的情況很容易被誤診[24]。本研究在30例出現(xiàn)相關臨床癥狀并經(jīng)B超檢查宮腔含液性內(nèi)容物的患犬中，有1只犬的臨床癥狀僅為外陰有少量分泌物，在病理上并無變化。出現(xiàn)這種情況可能是由于雌激素或孕激素紊亂造成機體產(chǎn)生與“假孕”相似的臨床癥狀[25-27]，或者該犬子宮并無異常，分泌物來自于陰道。其余患犬的子宮組織樣本均呈輕或重度炎性浸潤。重度炎性浸潤的子宮樣本中，內(nèi)膜萎縮型的IL-1β和IL-6基因的mRNA含量明顯升高，且IL-6在內(nèi)膜增生型與萎縮型重度炎性浸潤子宮組織中的基因表達差異結果與Hagman等[28-30]的研究結果相似。所以，當母犬出現(xiàn)相關的臨床癥狀時，并不能說明其子宮組織發(fā)生了炎癥反應，或確定發(fā)生炎癥反應的輕重程度。相反，未出現(xiàn)臨床癥狀的母犬也會患子宮內(nèi)膜炎，在組織病理上呈現(xiàn)出子宮內(nèi)膜囊性增生或亞臨床型子宮蓄膿的病理變化[31]。同時，該病的嚴重程度與犬所處發(fā)情周期的階段、子宮頸是否開放、子宮內(nèi)是否存在細菌感染情況、疾病持續(xù)時間的長短及生殖道及生殖系統(tǒng)外的損害程度等因素有關[32-33]，所以，觀察患犬的臨床癥狀只能縮小疾病的診斷范圍，對犬子宮內(nèi)膜炎的診斷起到一定的指導作用，但不能起到確診作用。

B超影像學對子宮內(nèi)膜炎的診斷也有著一定的指導意義，B超影像學可用于觀察子宮腔大小、子宮輪廓、子宮腔內(nèi)是否有滲出物、子宮內(nèi)是否存在腫瘤、子宮內(nèi)膜是否增厚或萎縮，但健康的子宮在B超下很難看到。且超聲檢查增生存在一定的局限性：對于子宮增大不明顯、癥狀不典型的患犬病例，診斷較困難，很難顯示出異常圖像；當發(fā)現(xiàn)增生后，不能明確區(qū)分內(nèi)膜增生過長、內(nèi)膜息肉及局限型宮體癌；且B超只能用于診斷密度比較大的腫瘤或增生；在B超圖像上，可以發(fā)現(xiàn)并診斷出纖維性增生，但很難診斷出囊性腺體增生[34-35]。B超檢查雖然可提示萎縮的子宮內(nèi)膜厚度，但不能作出病因診斷[36]。子宮萎縮的B超診斷需聯(lián)合腹腔鏡，并反復抖動腹腔鏡，才能在B超下確定極度萎縮的子宮的位置[37]。

血液學檢查對診斷該病同樣有著重要的意義，它可以發(fā)現(xiàn)體內(nèi)潛在的病理過程，了解疾病的進程，但不可單獨用于臨床診斷?；疾〕跗诘娜?，血液中白細胞數(shù)量一般不高，隨著病情發(fā)展，血液中白細胞總數(shù)的數(shù)量變化比較明顯，白細胞總數(shù)從逐步升高到急劇升高。且有些重度炎性浸潤型子宮伴有不同程度的貧血，可能是由于子宮發(fā)生出血性炎癥，炎癥滲出物即膿汁含有大量紅細胞，血管通透性增強所致[38]。有臨床癥狀組犬的子宮組織可以在病理切片中看到炎癥細胞，但卻存在白細胞數(shù)量減少的情況，這種情況在臨床上是偶爾會遇到的，出現(xiàn)這種情況的原因首先可能是機體出現(xiàn)白細胞生成障礙，由于感染、免疫學等因素，使得免疫器官胸腺受損、骨髓造血功能受損，且又由于白細胞破壞過多，使得外周血液中白細胞含量減少[39]。這種情況的出現(xiàn)，與任守愛等[16]和邵衛(wèi)國等[24]的研究結果一致。其次可能是機體白細胞分布異常，由于感染、免疫學等因素，使邊緣池中的白細胞增多，循環(huán)池中的白細胞減少[40-41]。

缺乏臨床癥狀并不是排除犬子宮內(nèi)膜炎的根本依據(jù)，有臨床癥狀的犬也并不一定患有子宮內(nèi)膜炎，因此要以有無臨床癥狀為基礎，再結合影像學、解剖學、血液學與組織病理學等方面的檢查，才能得到比較可靠的診斷結論。本研究提出的子宮內(nèi)膜炎分類方法是在進行客觀的病理組織學檢查基礎上總結得出的，可為子宮內(nèi)膜炎的臨床診療及深入研究提供一定的參考依據(jù)。

4 結 論

本研究通過觀察患犬在臨床上有無患子宮內(nèi)膜炎的常見癥狀、子宮內(nèi)膜結構在組織學上有無囊性擴張、子宮內(nèi)膜與肌層厚度(Endo/Myo)比值，以及基質成分和炎性細胞浸潤情況，并結合B超影像學、解剖學、血液學及RT-qPCR(IL-1β、IL-6和IL-8)檢測結果，將犬子宮內(nèi)膜炎在解剖學和組織病理學上進行了更深入的分類：無臨床癥狀組(健康類和囊性子宮內(nèi)膜增生類)和臨床癥狀組(無炎癥類、輕度炎性浸潤類、增生型重度炎性浸潤類和萎縮型重度炎性浸潤類)，對指導臨床診治具有一定的參考價值。