豬流行性腹瀉病毒N蛋白阻斷ELISA抗體檢測方法的建立及初步應(yīng)用

萬 穎，周改靜，麻 園，石正旺，肖書奇，羅俊聰，宋 銳，曹麗艷，楊 波，王麗娟，田 宏*，鄭海學(xué)*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730046；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一種急性、高度接觸性傳染性腸道疾病。PEDV是一種有包膜的單鏈RNA病毒，屬于冠狀病毒科，與傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬呼吸道冠狀病毒(PRCV)等病毒同屬于甲型冠狀病毒屬[1]。該病毒的基因組大小約28 kb，成熟病毒粒子的四種主要結(jié)構(gòu)蛋白包括：穗狀糖蛋白(S)(Mr 150～220 ku)、核蛋白(N)(Mr 45～57 ku)、糖化膜蛋白(M)(Mr 20～30 ku)、糖基化包膜蛋白(E)(Mr 7 ku)。N蛋白與病毒RNA結(jié)合，為螺旋狀核衣殼提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，是一種基本的堿性磷蛋白[2-3]。此外，它不僅在宿主體內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)免疫的過程中起重要作用，還參與病毒基因組的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和病毒RNA的組裝[4-5]。豬在PEDV感染后的早期階段，會(huì)產(chǎn)生針對N蛋白的高水平抗體[6]。鑒于N蛋白高度保守，因此常作為早期診斷試劑和疫苗開發(fā)的最佳候選抗原[5]。

PED臨床表現(xiàn)腹瀉、嘔吐、脫水和體重減輕等癥狀[7-9]，不同年齡的豬對該病均易感。該病毒首次于1971年出現(xiàn)在歐洲，后來逐漸擴(kuò)散至亞洲[10-11]。我國于2010年首次發(fā)現(xiàn)其變異毒株，之后便迅速傳播。雖各年齡豬均易感，但仔豬的死亡率更高，尤其是5日齡新生仔豬的死亡率可達(dá)100%[12]，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的損失[13-15]。

PEDV抗原常規(guī)診斷方法包括病毒分離、常規(guī)RT-PCR[16-17]、熒光定量RT-PCR[18-19]、免疫熒光法(IFA)[20]和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)[10]。雖然PED暴發(fā)后最好的診斷方法通常是病毒學(xué)檢測，但血清學(xué)檢測可提供有關(guān)先前接觸病毒和特定動(dòng)物和/或畜群免疫狀態(tài)的重要信息。因此建立一種準(zhǔn)確快速的PED抗體診斷方法迫在眉睫。抗體的檢測方法有病毒中和試驗(yàn)、IFA和ELISA，其中IFA和病毒中和試驗(yàn)對儀器的精密度要求較高、檢測的成本相對較高，且檢測時(shí)間長。相較于前兩種方法，ELISA法操作簡便、快速，可應(yīng)用于基層和臨床的大批量檢測。

目前,正在研發(fā)的PEDV ELISA抗體檢測方法多以PEDV特異性單克隆或多克隆抗體為基礎(chǔ)，這無疑增加了更多的成本，且不易大規(guī)模生產(chǎn)。與傳統(tǒng)抗體相比，本研究中使用的納米抗體更傾向于與凹形表位相結(jié)合，可以識別更多難以識別的隱蔽位點(diǎn)[21]。此外，其具有體積小、易于大量表達(dá)、特異性高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)[22-24]，是一種很有發(fā)展前景的診斷和治療工具。本試驗(yàn)旨在以原核表達(dá)的N蛋白作為包被抗原，并利用所選擇的Nb2納米抗體開發(fā)一種阻斷ELISA抗體檢測方法，快速、低成本、靈敏地檢測PEDV血清樣本，為臨床PEDV抗體檢測提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 蛋白與血清

豬流行性腹瀉病毒N蛋白和Nb2納米抗體[8]均由西北農(nóng)林科技大學(xué)肖書奇教授實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；96份PEDV陰性血清由國家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室提供；1份PEDV抗體陽性對照，1份PEDV抗體陰性對照，CSFV、PRRSV、PCV2、TGEV抗體陽性血清，健康豬血清，均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜病原學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備與保存；140份田間豬血清樣品采自不同豬場。

1.2 主要試劑、設(shè)備與試劑盒

BCA蛋白定量試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；HRP Conjugation Kit-Lighting-Link?購自Abcam公司；BSA Albumin Fraction V購自BioFroxx公司；豬流行性腹瀉病毒間接ELISA抗體檢測試劑盒(批號：PEDVS-5P)購自法國Innovative Dignostics公司；96孔酶標(biāo)板購自NUNC公司；海藻糖購自南寧中諾生物公司；抗體稀釋液(批號：17032206)購自濟(jì)南百迪泰生物科技有限公司；TMB顯色液購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 N蛋白阻斷ELISA抗體檢測方法的建立

1.3.1 抗原N蛋白最佳包被濃度及血清樣品稀釋度的確定 按照HRP conjugation Kit-Lighting-Link?試劑盒操作步驟對Nb2納米抗體進(jìn)行HRP 標(biāo)記，獲得所需酶標(biāo)抗體HRP-Nb2。將濃度為0.15 mg·mL-1N蛋白用包被液從1 250 ng·mL-1倍比稀釋至156.25 ng·mL-1包被96孔酶標(biāo)反應(yīng)板，50 μL·孔-1，4 ℃包被12 h，棄液，每孔加入300 μL 1×PBST溶液洗滌4次，棄液拍干，加入120 μL封閉液，4 ℃封閉10 h，棄液拍干。將材料與方法中的陰陽性對照血清分別作為陰陽性待檢血清，用樣品稀釋液分別稀釋成3個(gè)梯度1∶1、1∶5和1∶10，同時(shí)設(shè)置陰性對照孔，按照棋盤式滴定的模式加入到反應(yīng)板，每孔加入50 μL血清，37 ℃反應(yīng)30 min，棄液，每孔加入300 μL 1×PBST溶液洗4次，棄液拍干。用抗體稀釋液將HRP-Nb2 1∶5 000稀釋，每孔加入50 μL，37 ℃反應(yīng)30 min，棄液，加入300 μL 1×PBST溶液洗4次，棄液拍干。每孔加入50 μL TMB底物溶液，37 ℃避光孵育 12 min±1 min 后，加入 50 μL·孔-1的終止液，讀取吸光光度值(OD450 nm)。根據(jù)公式PI=[(OD450 nm陰性對照-OD450 nm待檢血清)/OD450 nm陰性對照]×100%[25]，計(jì)算陽性待檢血清的阻斷率 PPI 值和陰性待檢血清的阻斷率NPI 值，以PPI/NPI 值最大為最佳條件原則，確定N蛋白的最佳包被濃度及血清樣品最佳稀釋度。

1.3.2 樣品稀釋液的篩選 1號樣品稀釋液：1% BSA(PBST溶液)；2號樣品稀釋液：1% BSA[0.9% NaCl，0.5% Tween-20，0.05 mol·L-1MOPS(pH7.0)]；3號樣品稀釋液：1% BSA[0.9% NaCl，0.5% Tween-20，1% 海藻糖，0.05 mol·L-1MOPS(pH7.0)]，用這3種稀釋液將陰陽性待檢血清按照“1.3.1”篩選出的最佳血清稀釋度進(jìn)行稀釋。后續(xù)按照步驟“1.3.1”進(jìn)行，以PPI/NPI 值最大為最佳條件原則，篩選最佳樣品稀釋液。

1.3.3 封閉液的篩選 1號封閉液：0.5% BSA(1%蔗糖，2%海藻糖，100 mL PBS溶液)；2號封閉液：PBST溶液；3號封閉液：0.8%明膠(100 mL PBS溶液)；4號封閉液：1% BSA溶液(100 mL PBS溶液)；5號封閉液：0.5%胎牛血清溶液作為封閉液。按照步驟“1.3.1”進(jìn)行，以PPI/NPI 值最大為最佳條件原則，篩選得到最佳封閉液。

1.3.4 酶標(biāo)抗體工作液最佳工作濃度的確定 用抗體稀釋液將HRP-Nb2稀釋成1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000、1∶6 000、1∶7 000、1∶8 000。按照步驟“1.3.1”進(jìn)行，以PPI/NPI值最大為最佳條件原則，確定酶標(biāo)抗體工作液的最佳工作濃度。

1.3.6 特異性試驗(yàn) 用本研究建立的方法對健康豬血清、PRRSV、CSFV、PCV2和TGEV等病原的陽性血清進(jìn)行檢測，并設(shè)置陽性對照。讀取吸光光度值并分析計(jì)算PI值，判定待檢血清樣品的陰陽性，從而分析本方法的特異性。

1.3.7 靈敏性試驗(yàn) 用本研究建立的檢測方法和市售IDvet PEDV間接ELISA抗體檢測試劑盒分別檢測倍比稀釋的陽性對照，讀取吸光光度值并分析計(jì)算PI值，判定陰陽性，并與市售IDvet PEDV間接ELISA抗體檢測試劑盒檢測結(jié)果進(jìn)行對比，從而分析本方法的靈敏性。

1.3.8 批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn) 選取4份血清樣品(2份PEDV抗體陽性血清和2份PEDV抗體陰性血清)，用同批包被的酶標(biāo)反應(yīng)板檢測4份血清樣本，讀取吸光光度值并計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)(CV%)。用3個(gè)不同批次酶標(biāo)反應(yīng)板檢測上述4份血清樣本，讀取吸光光度值計(jì)算得到PI值，并分析計(jì)算批間變異系數(shù)(CV%)。

1.4 與商品化試劑盒的比較

用本研究建立的檢測方法和市售IDvet PEDV間接ELISA抗體檢測試劑盒共同檢測140份田間豬血清樣品，讀取吸光光度值計(jì)算得到PI值，分析計(jì)算陽性符合率、陰性符合率及kappa值。當(dāng)0

2 結(jié) 果

2.1 PEDV N蛋白的純化與鑒定

采用鎳柱層析法純化PEDV N蛋白，SDS-PAGE檢測得到1條約60 ku的條帶(圖1A)，純化后的目的蛋白條帶單一，與預(yù)測條帶大小一致，說明成功純化N蛋白。Western blot結(jié)果表明，N蛋白與PEDV陽性血清和Nb2納米抗體均能夠發(fā)生特異性反應(yīng)(圖1B、C)。

M.蛋白相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；A.PEDV N蛋白的SDS-PAGE分析；B.PEDV N蛋白與PEDV抗體陽性血清反應(yīng)原性鑒定；C.PEDV N蛋白與PEDV Nb2納米抗體反應(yīng)原性鑒定

2.2 PEDV N蛋白最佳包被濃度及血清樣品最佳稀釋度的確定

利用棋盤滴定法將濃度為0.15 mg·mL-1N蛋白用包被液從1 250 ng·mL-1倍比稀釋至156.25 ng·mL-1包被96孔酶標(biāo)反應(yīng)板，陰陽性待檢血清用樣品稀釋液分別稀釋成3個(gè)梯度1∶1、1∶5和1∶10后進(jìn)行檢測，計(jì)算NPI值和PPI值(圖2A、B)。

A.陰性待檢血清阻斷率；B.陽性待檢血清阻斷率；C.陽性待檢血清阻斷率/陰性待檢血清阻斷率。圖例示N蛋白濃度(單位:ng·mL-1)

根據(jù)PPI/NPI值最大為最佳條件原則，確定N蛋白的最佳包被濃度及血清樣品最佳稀釋度。結(jié)果顯示，當(dāng)N蛋白包被濃度625 ng·mL-1，血清稀釋度為1∶1稀釋時(shí)，PPI/NPI值最大(圖2C)。

2.3 樣品稀釋液的確定

用1、2、3號樣品稀釋液分別按照“2.2”最佳稀釋倍數(shù)對陰陽性待檢血清稀釋后進(jìn)行檢測，計(jì)算得到NPI值和PPI值。結(jié)果表明，用2號樣品稀釋液稀釋血清樣品時(shí)，PPI/NPI值最大，2號與1號、3號均差異顯著(P<0.05，P<0.01)。因此，最佳樣品稀釋液為1% BSA[0.9% NaCl，0.5% Tween-20，0.05 mol·L-1MOPS(pH7.0)]。

2.4 封閉液的確定

將已包被好的酶標(biāo)反應(yīng)板用1、2、3、4、5號5種不同的封閉液4 ℃封閉10 h。計(jì)算NPI值和PPI值。結(jié)果表明，1號封閉液封閉時(shí)，PPI/NPI值最大。因此最佳封閉液為0.5% BSA(1%蔗糖，2%海藻糖，100 mL PBS溶液)。

2.5 酶標(biāo)抗體工作液最佳工作濃度的確定

用抗體稀釋液將酶標(biāo)抗體稀釋成1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000、1∶6 000、1∶7 000、1∶8 000。計(jì)算NPI值和PPI值(圖3A)。根據(jù)PPI/NPI最大的原則確定1∶5 000為酶標(biāo)抗體工作液的最佳工作濃度(圖3B)。

A.陰陽性待檢血清阻斷率；B.陽性待檢血清阻斷率/陰性待檢血清阻斷率

2.6 判定標(biāo)準(zhǔn)的確定

圖4 100份已知PEDV陰性血清的PI結(jié)果分布

2.7 特異性試驗(yàn)

用本研究建立的PEDV抗體檢測方法，對PEDV、PRRSV、PCV2、TGEV、CSFV抗體陽性血清和健康豬血清進(jìn)行檢測，讀取OD450 nm值分析計(jì)算PI值，并與臨界值進(jìn)行比較。結(jié)果表明，以上5種豬病抗體陽性血清的PI值均小于45%，證實(shí)本研究建立的PEDV阻斷ELISA抗體檢測方法特異性良好(圖5)。

圖5 N蛋白阻斷ELISA特異性試驗(yàn)

2.8 靈敏性試驗(yàn)

用本研究建立的檢測方法和市售IDvet PEDV間接ELISA抗體檢測試劑盒分別檢測倍比稀釋的陽性對照，讀取吸光光度值并分析計(jì)算S/P值和PI值，判定陰陽性，并與市售IDvet PEDV抗體檢測試劑盒檢測結(jié)果進(jìn)行對比。結(jié)果表明，IDEVT PEDV抗體檢測試劑盒的最低稀釋度為1∶32(圖6A)，而本方法的最低稀釋度為1∶16(圖6B)，靈敏度只降低了一個(gè)稀釋度，因此本研究建立的抗體檢測方法具有良好的靈敏性。

圖6 IDvet間接ELISA和阻斷ELISA靈敏性試驗(yàn)

2.9 批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)

用本研究建立的抗體檢測方法對4份血清樣品(陽性血清和陰性血清各2份)進(jìn)行檢測，以評估該方法的批內(nèi)重復(fù)性。選取3個(gè)不同生產(chǎn)批次的酶標(biāo)反應(yīng)板對上述4份血清樣品進(jìn)行檢測，用于批間重復(fù)性的評估。每個(gè)血清設(shè)置3個(gè)平行孔，通過阻斷率PI值計(jì)算變異系數(shù)(CV%)。結(jié)果顯示，批次1批內(nèi)變異系數(shù)分別為0.71%、1.00%、4.66%、4.08%；批次2批內(nèi)變異系數(shù)分別為0.74%、0.98%、2.86%、2.34%；批次3 的批內(nèi)變異系數(shù)分別為0.85%、1.01%、3.75%、1.89%。批次1、2、3的批間變異系數(shù)分別為1.07%、1.32%、5.46%、7.16%。因此批內(nèi)及批間變異系數(shù)均小于10%，表明本研究建立的抗體檢測方法重復(fù)性好。

2.10 與商品化試劑盒的比較

用本研究建立的PEDV阻斷ELISA抗體檢測方法與市售IDvet PEDV間接ELISA抗體檢測試劑盒共同檢測140份田間豬血清樣品，由圖7A、B可知，阻斷ELISA檢出陽性17份，陰性123份；間接ELISA檢出陽性19份，陰性121份；因此兩種檢測方法的陽性符合率為89.5%(17/19)，陰性符合率為98.4%(121/123)，說明阻斷ELISA與商品化試劑盒的敏感性和特異性相近；同時(shí)兩種方法檢測的陰陽性結(jié)果均存在極顯著差異(P<0.001，P<0.001)。

圖7 阻斷ELISA(A)和間接ELISA(B)臨床試驗(yàn)

用表格對兩種方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算Kappa值，結(jié)果表明，Kappa值為0.87(>0.75)，說明兩種檢測方法幾乎完全一致(表1)。綜合以上，本研究建立的PEDV阻斷ELISA抗體檢測方法與市售IDvet PEDV間接ELISA抗體檢測方法檢測效果相當(dāng)。

表1 阻斷ELISA與商業(yè)化間接ELISA的比對結(jié)果

3 討 論

據(jù)報(bào)道，PEDV主要感染新生仔豬，一旦被感染，死亡率可高達(dá)100%[27]。在過去的十年，我國多地經(jīng)常有PED的暴發(fā)，該病發(fā)病迅猛，傳播速度快，當(dāng)前市面上尚無特異性針對該病的特效藥及疫苗，因此快速準(zhǔn)確的血清學(xué)抗體檢測方法對于PED的流行病學(xué)調(diào)查和后續(xù)疫苗免疫效果的評估具有重要的意義。

當(dāng)前我國檢測PEDV抗體大多采用國外進(jìn)口的間接ELISA檢測試劑盒，雖然特異敏感，準(zhǔn)確度高，但其價(jià)格昂貴，應(yīng)用于基層大批量的檢測不太現(xiàn)實(shí)。N蛋白一般在病毒感染早期表達(dá)和分泌，并且高度保守，故常作為早期診斷的優(yōu)勢蛋白。根據(jù)肖教授實(shí)驗(yàn)室[8]前期已發(fā)表文章可知，Nb2納米抗體是通過噬菌體展示技術(shù)和PE-ELISA連續(xù)3次從高質(zhì)量的噬菌體展示VHH文庫中成功分離而得到。Nb2可以特異性結(jié)合PEDV N蛋白，而不與TGEV N蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)，說明特異性好；測定抗體對特定抗原的親和力，對篩選抗體十分重要。親和力的大小既可以用結(jié)合常數(shù)Ka表征，也可以用解離常數(shù)Kd表征。通過表面等離子體共振(SPR)分析，Ka值為9.21×105·(M·s)-1，說明Nb2與PEDV N蛋白結(jié)合力高，同時(shí)綜合Ka/Kd值(5.32×108M)，表明Nb2與PEDV N蛋白具有很好的結(jié)合活性和親和力[8]。同時(shí)本研究將N蛋白、PEDV陽性血清和Nb2均進(jìn)行了反應(yīng)性驗(yàn)證，結(jié)果也顯示反應(yīng)性良好。綜合以上特性擬建立一種特異、敏感且可應(yīng)用于基層的PEDV阻斷ELISA抗體檢測方法。

目前，最常用于ELISA的兩種抗體標(biāo)記的探針是辣根過氧化物酶(HPR)和生物素[21,28-29]。HRP活性高，穩(wěn)定，分子量小，同時(shí)標(biāo)記方法也更加簡便和成熟，因此采用HRP作為標(biāo)記的探針。本研究通過檢測與PEDV在臨床上相似而容易混淆的豬源CSFV、PRRSV、TGEV、PCV2陽性血清，結(jié)果證明本方法特異性好；通過檢測不同稀釋度的陽性對照，同時(shí)與進(jìn)口IDvet ELISA進(jìn)行比較，證明其敏感性較高；為了評估本研究制備的ELISA檢測方法的實(shí)用性，將其與進(jìn)口IDvet ELISA同時(shí)檢測140份血清，結(jié)果證明兩種方法的kappa值為0.87，為幾乎完全一致，kappa值是檢驗(yàn)兩個(gè)檢測方法一致性的重要指標(biāo)，kappa值越大說明兩種檢測方法的一致性越高[30-31]。綜上所述，本研究建立的阻斷ELISA抗體檢測方法可應(yīng)用于基層快速、靈敏的特異性檢驗(yàn)。

4 結(jié) 論

成功建立了一種檢測豬流行性腹瀉病毒抗體的阻斷ELISA檢測方法，可通過計(jì)算陰陽性阻斷率判定血清中抗體水平，可用于豬流行性腹瀉的流行病學(xué)調(diào)查和抗體水平的監(jiān)測。