丁 軍,付子琳,和俊豪,段曉微,馬 露,卜登攀,2*
(1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所 動物營養(yǎng)學國家重點實驗室,北京 100193;2.中國農(nóng)業(yè)科學院與世界農(nóng)用林業(yè)中心農(nóng)用林業(yè)與可持續(xù)畜牧業(yè)聯(lián)合實驗室,北京100193)
外泌體(exosomes)存在于正常生理或者病理條件下的各種體液中,如血液[1]、尿液[2]、腦脊液、支氣管灌洗液、精液[3]、腹水、汗液、唾液、淚液、乳汁和淋巴液等[4-5]。它是由細胞分泌到胞外的納米級囊狀小泡,外包磷脂雙分子層,內(nèi)含核酸、蛋白質(zhì)和磷脂,呈類細胞的拓撲結構,大小在30~150 nm之間[6]。與其他類型的細胞外囊泡(微囊泡、凋亡小體)相比,外泌體在大小、生物合成和內(nèi)含物上存在不同[7]。外泌體,最早(1983年)是由Pan等[8]研究體外培養(yǎng)的綿羊網(wǎng)織紅細胞向成熟紅細胞分化過程中,在細胞上清液中發(fā)現(xiàn)并分離得到的一種30~150 nm的細胞外膜性小囊泡。之后研究發(fā)現(xiàn),這種細胞外囊泡是受調(diào)控的,非隨機地包裹mRNAs、miRNAs、DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等物質(zhì)[9-12],并通過胞吐、融合等方式把內(nèi)含物釋放到細胞外,然后由臨近的或遠隔的受體細胞接受信號而發(fā)揮生理維護或者病理修復的作用[13]。外泌體作為細胞間信號標志物之一,在細胞間信號傳導上擁有極大的生物學價值[14-15],同時在疾病的診斷、治療和預防上也發(fā)揮極大的作用。例如在阿爾茨海默病和帕金森綜合征的診斷中,外泌體參與了β-淀粉樣蛋白和α-突觸核蛋白的傳播[16-18];在癌癥的研究上,外泌體還具有抗腫瘤[19]及腫瘤生物標記作用[20]。
幾乎所有的細胞都可以產(chǎn)生細胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs),但是外泌體不同于其他的細胞外囊泡,其大小在30~150 nm,呈囊泡狀。外泌體的生成是從細胞的內(nèi)出芽(胞吞)開始,然后依次形成早期內(nèi)吞小體(early endosome)、晚期內(nèi)吞小體(late endosome)。伴隨著細胞的代謝,晚期內(nèi)吞小體的脂膜內(nèi)陷,開始有選擇地分揀RNAs、miRNAs、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等內(nèi)含體[21-22]。目前的研究發(fā)現(xiàn),外泌體的產(chǎn)生主要有兩種途徑(圖1):1)晚期內(nèi)吞小體在囊泡分揀蛋白如轉(zhuǎn)運必需核內(nèi)復合物(endosomal complex required for transport,ESCRT)的作用下通過識別、分類、挑選內(nèi)含物而生產(chǎn)多囊泡體(multivesicular body);2)在神經(jīng)酰胺的協(xié)助作用下晚期內(nèi)吞小體生成多囊泡體。有的多囊泡體會和溶酶體融合,然后被分解,有的和細胞膜融合,釋放到細胞外形成外泌體[6, 23-25]。在乳中,外泌體來源于乳腺上皮細胞和一些免疫細胞[26]。日本科學家Hata等[27]通過乳脂肪球表皮生長因子8(milk fat globule epidermal growth factor 8,MFG-E8)確定了乳源外泌體來源于乳腺上皮細胞。最近,中國學者分離獲得牛乳腺上皮細胞來源的外泌體,并利用蛋白組學技術結合現(xiàn)有牛乳源外泌體庫進行了鑒定[28]。
圖1 外泌體的生物合成和釋放[6]
哺乳動物的乳汁是新生動物最主要的營養(yǎng)來源,乳汁中含有新生動物所需的所有營養(yǎng)物質(zhì),包括蛋白質(zhì)、脂肪、礦物元素、維生素及各種活性成分等,能夠促進動物個體生長發(fā)育和機體免疫力等功能[29]。有研究發(fā)現(xiàn),在哺乳動物的乳汁中存在外泌體,并已證實其具有生物活性[6]。乳源外泌體在疾病診斷、治療、預防以及人和動物的生長發(fā)育等方面都具有重要的研究價值。牛乳是外泌體的重要來源[30],牛奶樣品容易獲取,并且不會對奶牛產(chǎn)生負面影響,這為乳源外泌體的研究奠定了基礎。
乳源外泌體和其他來源外泌體在結構上相似,都具有與細胞相同的拓撲結構和脂質(zhì)雙分子層,膜上具有膜蛋白,內(nèi)含物中存在大量的蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)[31-32]。
乳源外泌體中的蛋白質(zhì)大致分為兩類,第一類是膜上的膜蛋白。其膜表面既有與其他源外泌體相同的保守膜蛋白,如CD6、CD81、CD9等[33],又有與其起源細胞密切相關的相對特異性蛋白,如MFG-E8[27]。目前研究發(fā)現(xiàn),在外泌體表面還有一類蛋白,其功能是阻止巨噬細胞識別和清除外泌體,如跨膜蛋白CD47[34]。第二類是內(nèi)含物蛋白,外泌體內(nèi)部通過非隨機、受調(diào)控的方式可以包裹原細胞的蛋白,如熱休克蛋白和肌動蛋白等。目前,國際上外泌體的統(tǒng)計數(shù)據(jù)庫主要是ExoCarta[35]和Vesiclepedia[36]。根據(jù)ExoCarta統(tǒng)計,從不同來源的外泌體中共檢測發(fā)現(xiàn)了41 860種蛋白[37]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn),人乳外泌體中含1 963種蛋白,牛乳外泌體中含有1 351種[38],值得注意的是,牛乳中有198種蛋白在人乳中未被檢測到[39]。上述研究表明,乳源外泌體中存在大量的蛋白質(zhì),這些蛋白質(zhì)可能會發(fā)揮某些生理或病理作用,需要更深入研究。
乳源外泌體中另一類重要組分是核酸,包括DNA、mRNA、miRNA和其他非編碼RNA[40]。由于脂質(zhì)雙分子層的保護,乳源外泌體中的核酸可以穩(wěn)定存在。目前,乳源外泌體中DNA的功能還不清楚,而大量的研究集中在乳源外泌體RNA的研究上。Izumi等[41]在牛乳乳清外泌體中提取鑒定了大約19 000種mRNA和2 838種miRNAs,約占乳源外泌體總RNA的13%[42]。另有研究顯示[43],牛乳中大約有400種miRNA的核苷酸序列和人乳外泌體相同,且牛乳來源的外泌體可以被人體巨噬細胞吞噬[41,44],表明牛乳外泌體來源的miRNA可能會被人體吸收而發(fā)揮作用。林德麟等[45]統(tǒng)計分析了不同動物乳中miRNAs的含量和種類,發(fā)現(xiàn)miR-148a、let-7家族、miR-182-5p、miR-378、miR-141、miR-30a-5p、miR-27b-3p、miR-146b-5p、miR-26a等能在動物乳中高表達,盡管這些乳源miRNAs的生物學功能尚未證實,但Gu等[46]在人、豬和牛乳源外泌體中發(fā)現(xiàn)了包括miR-148a和let-7a等與免疫相關的miRNA。
關于乳源外泌體脂質(zhì)類內(nèi)含物的報道較少。目前有研究對來源于早產(chǎn)兒和足月兒健康母親的乳源外泌體進行了分離,并通過LC-MS闡明了其脂質(zhì)表達譜,共鑒定出395種脂質(zhì),共15個脂質(zhì)亞類,包括磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰絲氨酸(PS)和磷脂酰乙醇胺(PE),通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)其中有50種脂質(zhì)(PC(18:0/18:2)、PC(18:1/16:0)、PS(18:0/18:1)、PS(18:0/22:6)等)通過細胞外信號調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)途徑調(diào)節(jié)腸上皮細胞功能[47]。
關于外泌體的分離依然缺乏公認方法。目前常用的分離方法有超速離心法[48]、尺寸排阻法、免疫親和捕獲法、試劑盒法[49]和微流體技術等[50-52]。這些分離方法得到的外泌體純度和濃度不高[48],同時均存在一定的優(yōu)缺點[49]。超速離心法和試劑盒法是外泌體分離提取最常用的方法。超速離心法操作難度低,分離耗時短[53],該方法利用乳汁樣品中外泌體、蛋白質(zhì)、脂肪、細胞和細胞碎片等物質(zhì)沉降速度的差異, 通過控制不同的離心力和離心時間, 將其劃分為上清液和沉淀,然后進行分離。試劑盒法又被稱為聚合物沉淀法,其主要是利用聚乙二醇或其類似物將外泌體沉淀,然后使用低速離心分離外泌體,這樣避免了因差速離心耗時而提高了外泌體的分離效率[54]。范士杰等[48]比較了差速離心法和試劑盒法提取娟珊牛乳外泌體,發(fā)現(xiàn)試劑盒法提取的外泌體數(shù)量多且無細胞毒性。一般的單一分離方法并不能準確獲得單一的外泌體,因此,多技術聯(lián)合使用,會更容易得到單一的外泌體。Abramowicz等[50]通過研究發(fā)現(xiàn),超速離心結合碘克沙醇密度梯度離心或凝膠過濾,盡管勞動強度大,但可以獲得高質(zhì)量的外泌體。Somiya等[55]將樣品進行酸化處理,然后再進行超速離心,也獲得了單一的、無細胞毒性的外泌體。不同分離方法所得到的乳源外泌體的特征有所不同(表1)。且由于乳汁不同于其他體液,其成分復雜,含有大量小分子的乳蛋白和乳脂,有些小分子物質(zhì)的大小與外泌體相似,這導致分離獲得的乳源外泌體濃度和純度較低。到目前為止,還沒有公認的可以獲得高純度、濃度和生物活性的分離方法,因此對于乳源外泌體的分離技術還有待進一步優(yōu)化研究。
表1 不同分離方法獲得的乳源外泌體特性
乳源外泌體的鑒定需要從兩方面進行:首先是物理特性的鑒定,利用電子顯微鏡、動態(tài)光衍射(dynamic light scattering, DLS)和納米粒子跟蹤分析(nanoparticle tracking analysis, NTA)技術,確定乳源外泌體的形態(tài)和大小,確定其基本的囊泡狀結構,這被稱為外泌體檢測的金標準[58-59]。在電子顯微鏡下,幾乎所有表征都顯示乳源外泌體呈杯狀結構,大小在30~150 nm之間。DLS是利用分子的布朗運動捕捉光散射,然后計算外泌體大小的方法,其對于單一尺寸的分子檢測較為準確。由于外泌體大小不一,導致其檢測結果準確率降低[49]。NTA是一種直接可視化的光學粒子追蹤技術,它可以同時顯示外泌體的濃度和大小。其最小檢測單位是50 nm的外泌體[60-61]。其次再利用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(Western blot)和酶聯(lián)免疫法通過外泌體表面特異性標志蛋白,如:四跨膜蛋白(CD9,CD63和CD81)、熱休克蛋白HSP70、Alixs等的免疫結合進行鑒定核實[62]。同時也可以對外泌體中的特異性內(nèi)含物進行鑒定[63]。此外,還有研究人員通過對外泌體膜上表面標志物進行標記,然后利用流式細胞術(flow cytometry, FCM)檢測陽性表達,以此對外泌體進行定性和定量[64]。
在一些疾病中,乳源外泌體會隨著疾病的發(fā)生發(fā)展而發(fā)生變化,這為外泌體作為疾病診斷標志物奠定了基礎[65]。在奶牛乳房炎的研究中,研究人員通過培養(yǎng)牛乳腺上皮細胞,然后利用熱滅活大腸埃希菌刺激,結果發(fā)現(xiàn),乳腺上皮細胞中有1 478條基因發(fā)生差異表達。GO分類富集分析發(fā)現(xiàn),其中有21條基因定位于外泌體,這在細胞層面上證明乳腺炎病原感染可引起宿主細胞所分泌的外泌體成分發(fā)生改變[66]。Reinhardt等[32]通過采集健康牛和患乳腺炎牛的乳汁分析乳源外泌體也證實了這一點。在組學分析上,有研究者通過對健康牛和患乳腺炎牛的乳源外泌體進行了全面RNA的分析,檢測到492個 已知的和980個未知的miRNAs,其中健康牛和患乳腺炎牛的乳源外泌體差異表達的miRNA有18個,顯著差異表達的有2個,分別是miR-223和miR-142-5p,這被視為乳腺炎診斷的潛在候選者[67-68]。張修奇[69]利用差速離心法分離了健康牛和乳房炎牛的乳源外泌體,再次證實了miR-223和miR-142-5p在乳房炎奶牛乳源外泌體中顯著表達,然后又補充了miR-146a和miR-29a為牛乳房炎潛在候選者。
4.2.1 乳源外泌體與藥物 外泌體存在于各種體液中(血液、尿液、乳汁、組織液等),乳汁中外泌體具有量多、易提取、更易使人接受等優(yōu)點,是配合藥物生產(chǎn)的最佳原料。其次,其天然的脂質(zhì)雙層結構可以保護內(nèi)含物免受破壞、傳遞酶類和遺傳物質(zhì)、介導細胞間信號傳導[70]、遞呈抗原和免疫應答[71]。在醫(yī)學載藥領域,目前主要應用的載體是脂質(zhì)體和聚合物載體,外泌體和這些載體相比,其具有更強的穩(wěn)定性、生物相容性、靶向性和可改造性,這使得藥物通過外泌體能夠更加穩(wěn)定和準確地作用于靶位[72]。外泌體屬于納米級的脂質(zhì)體,藥物借助外泌體后,可以更好地被吸收。另外,外泌體無免疫原性,可以透過血腦屏障,這使得其可以大大提高藥物的血腦屏障透過率。據(jù)報道,目前外泌體可以用于遞送:siRNA、miRNA、蛋白質(zhì)、小分子藥物和納米顆粒等,用于治療各種疾病[73]。有研究人員對牛乳源外泌體分離純化后與紫杉醇共孵育,獲得了粒徑108 nm的乳源外泌體-紫杉醇復合物,這使藥物的生物利用度顯著提高,同時降低了用藥劑量和毒性[74]。還有研究通過將包裹siRNAs的外泌體復合物用于研究胰腺癌小鼠模型,發(fā)現(xiàn)其可以特異性地靶向抑制癌細胞[75]。Kim等[76]通過將姜黃素、RNA結合蛋白(RBP)和外泌體膜蛋白結合制成工程化外泌體,然后通過氣管滴入急性肺損傷模型,發(fā)現(xiàn)結合外泌體的姜黃素藥物效果顯著好于單獨使用姜黃素。外泌體作為藥物載體可以極大程度地協(xié)助藥物運輸,使其更好地發(fā)揮作用,是藥物運輸最佳的載體[77]。但是外泌體載藥也存在一些不足,其載藥效率較低,需低溫保存,并且臨床產(chǎn)量不足,這將是未來乳源外泌體載藥面臨的最大挑戰(zhàn)。
4.2.2 乳源外泌體與疾病 乳源外泌體還參與一些疾病的發(fā)生發(fā)展。在感染性疾病中,外泌體的大小與某些病毒非常相近,其次,其脂膜上包含有參與細胞間信號傳導的膜蛋白,內(nèi)含遺傳物質(zhì),甚至可以包裹整個病毒[78]。N?slund等[79]研究人乳源外泌體和血漿外泌體對I型人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus Type 1, HIV-1)感染的作用時,發(fā)現(xiàn)人乳源外泌體可以通過與HIV-1競爭與單核細胞來源的樹突狀細胞上的受體DC-SIGN結合而抵抗HIV-1垂直傳播。Yun等[80]通過使用糖皮質(zhì)激素誘發(fā)了小鼠骨質(zhì)疏松,然后將分離純化后的牛乳源外泌體給小鼠口服,發(fā)現(xiàn)與未經(jīng)外泌體治療的糖皮質(zhì)激素誘導的骨質(zhì)疏松組相比,外泌體喂養(yǎng)小鼠組的骨礦物質(zhì)密度顯著提高。在炎癥性疾病的研究中,研究人員使用膠原蛋白誘導制造了自發(fā)性關節(jié)炎的小鼠模型,然后給該小鼠模型口服牛乳源外泌體,發(fā)現(xiàn)牛乳外泌體處理使單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)和IL-6的血清水平以及脾細胞產(chǎn)生的水平下降[63]。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的機制可能與牛乳源外泌體的內(nèi)含物miR-148a[81]、miR-21[82]以及TGF-β[83]有關。Gao等[84]通過LPS致炎大鼠結腸上皮細胞(IEC-6),然后添加牛乳源外泌體和牦牛乳源外泌體,發(fā)現(xiàn)牦牛乳和牛乳外泌體通過激活 PI3K/AKT/C3 信號通路,促進 IEC-6 存活,并且顯示CD46是減輕IEC-6細胞炎癥的調(diào)節(jié)劑。另外,牛乳源外泌體的內(nèi)含物(miRNA)可能參與疾病的發(fā)生發(fā)展,如前列腺癌、乳腺癌[85]、結腸癌、肝細胞癌[86]、鼻咽癌、B淋巴細胞瘤、肥胖以及II型糖尿病[87](表2)。綜上所述,乳源外泌體主要是通過其內(nèi)含物蛋白質(zhì)和miRNAs在一些疾病中發(fā)揮作用,但是其內(nèi)含物種類較多,是否是單一內(nèi)含物發(fā)揮作用,還有待進一步研究。
表2 乳源外泌體中miRNA相關的疾病
初乳中含有免疫球蛋白,可直接被新生動物吸收,提供被動免疫獲得抗體,抵抗病原感染。而外泌體作為近年來發(fā)現(xiàn)的內(nèi)含蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)的細胞外囊泡,也可以通過其內(nèi)含物為幼畜的疾病預防提供幫助。乳源外泌體內(nèi)含與免疫相關的miRNAs,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在人、豬、牛、山羊和熊貓的乳汁中有相同保守的miRNAs如:let-7a、let-7b、let-7f和miR-148a,可能參與調(diào)節(jié)機體的免疫[65]。研究發(fā)現(xiàn),人乳源外泌體可以抑制白介素-3和干擾素的產(chǎn)生,從而使調(diào)節(jié)性T細胞的數(shù)量增加,調(diào)節(jié)新生兒的免疫系統(tǒng)發(fā)育[98],可預防新生兒壞死性小腸結腸炎(necrotizing enterocolitis,NEC)、支氣管肺發(fā)育不良(broncho-pulmonary dysplasia,BPD)等相關疾病的發(fā)生,同時在生命早期,其還具有預防過敏的潛力[99],但作用機制還不太清楚。Baier等[100]通過交叉試驗設計,對26~49歲的3名男性和2名女性給予牛奶飲食,發(fā)現(xiàn)牛乳源外泌體中的miRNA可以補償人內(nèi)源性miRNA。
在腸道發(fā)育方面,乳源外泌體也具有至關重要的作用[101-102]。乳源外泌體可以耐受蛋白酶和核糖核酸酶消化,能夠順利通過消化道并被吸收[103]。有研究顯示,通過給小鼠口服飼喂豬乳源外泌體,小鼠十二指腸和空腸的絨毛高度、隱窩深度和絨毛高度與隱窩深度之比(villus height/crypt depth,V/C)顯著增加[104]。另有研究通過低蛋白飲食誘導小鼠形成營養(yǎng)不良,然后口服牛乳外泌體,發(fā)現(xiàn)牛乳外泌體組的小鼠腸上皮通透性、屏障功能和腸細胞增殖較對照組顯著改善[105]。在人體腸道發(fā)育方面,牛乳源外泌體被證實可以通過抑制p53(tumor suppressor gene p53,p53)蛋白表達,增加 IEC-6 細胞的存活,以此調(diào)節(jié)腸道的屏障功能[106-107]。人乳源外泌體通過其內(nèi)含物circRNAs與相關miRNAs結合,誘導人結腸上皮細胞(FHC)增殖和遷移[108]。Zeng等[109]通過提取豬乳源外泌體,然后灌服小鼠和仔豬,發(fā)現(xiàn)乳源外泌體通過其包含物circ-XPO4(circRNA)抑制腸上皮細胞中miR-221-5p的表達來促進分泌性免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A,SIgA)的表達。
乳源外泌體還可以影響腸道微生物,以此調(diào)節(jié)腸道健康[58]。有研究通過給小鼠飼喂正常牛乳和破壞外泌體結構的牛乳,對比兩組小鼠腸道微生物的生長情況,發(fā)現(xiàn)正常牛乳顯著提高了小鼠腸道微生物的豐度[110]。綜上所述,乳源外泌體可以促進機體腸道發(fā)育,改善腸道菌群結構,發(fā)揮類似于益生元的功能,這為乳源外泌體作為一種新型益生元奠定了一定的基礎。
目前,乳源外泌體的研究主要集中在乳房炎等疾病的診斷檢測和作為益生元或藥物載體應用方面。但是,因規(guī)?;崛〖兓に嚨戎萍s,乳源外泌體的臨床應用仍然面臨著很多挑戰(zhàn),仍有待進一步深入研究。