膝關節(jié)骨性關節(jié)炎miR-138 HIF-2α表達與意義

林利忠 關助明 林澤金

膝關節(jié)骨性關節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是臨床上較為常見的一種慢性骨關節(jié)疾病[1-2]，早期診斷及積極治療可有效延緩疾病進展并及早對預后做出判斷。微小核糖核酸(microribonucleic acid，miRNA)是由20～24核苷酸組成的小分子非編碼RNA，可通過調(diào)控下游靶基因表達而參與多種生理病理過程[3]。穆尚強等[4]研究證實，在KOA患者的關節(jié)液中有多種miRNAs的表達均有異常。關節(jié)軟骨主要從流動的關節(jié)液及軟骨下骨中獲取營養(yǎng)和氧，關節(jié)軟骨中低氧誘導因子-2α(hypoxia inducible factor-2α，HIF-2α)能夠調(diào)控軟骨細胞對低氧環(huán)境的適應性[5]。相關研究[6-7]發(fā)現(xiàn)，在KOA患者的關節(jié)液中miR-138呈顯著下調(diào)，關節(jié)軟骨中HIF-2α信使RNA(Messenger RNA，mRNA)呈顯著上調(diào)，二者均有可能是KOA前期

的檢查和診斷的監(jiān)測標志物。為了進一步研究KOA患者關節(jié)液中miR-138和關節(jié)軟骨中HIF-2α的作用，本研究利用檢測二者的表達，并探討其變化與意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年3月至2019年1月深圳龍華區(qū)中心醫(yī)院收治的46例KOA患者作為研究組，參照凱爾格倫-勞倫斯(Kellgren-Lawrence，K-L)分級標準[8]對KOA患者(研究組)進行分級：Ⅱ級11例、Ⅲ級22例、Ⅳ級13例。同時選取46例同期非KOA患者(因發(fā)生車禍或嚴重損傷等需要進行下肢截肢手術且均為非KOA患者)作為對照組。兩組患者一般資料進行比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 納入與排除標準 研究組納入標準：均符合美國風濕病學會KOA診斷標準[9]者。研究組排除標準：膝關節(jié)創(chuàng)傷者；膝關節(jié)有手術史者；近期接受非甾體類抗炎藥或糖皮質(zhì)激素類治療者；有自身免疫性疾病或炎癥性關節(jié)炎者。對照組排除標準：有嚴重心、肝、腎疾病者；關節(jié)軟骨破損嚴重者；有血液病者；有惡性腫瘤者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(審批號：201802-001)，所有患者均知情同意。

1.3 樣本的收集及儲存

1.3.1 關節(jié)液標本 無菌收集兩組患者的關節(jié)液各約3 mL，室溫條件下靜置1 h后，于離心機內(nèi)以3 500 r/s轉(zhuǎn)速離心處理10 min。去除細胞和關節(jié)組織殘存碎片，分離上清液于新的EP管，-80℃超低溫冰箱中保存待測。

1.3.2 關節(jié)軟骨標本 兩組患者均在術中切除關節(jié)軟骨，所有標本均在離開體后30 min內(nèi)取材完成并于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 檢測方法

1.4.1 關節(jié)液中miR-138表達檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測。分別取兩組患者關節(jié)液各3 mL并提取其中的總RNA，使用微量分光光度計檢測濃度和純度。然后將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補的脫氧核糖核酸(complementary Deoxyribonucleic Acid，cDNA)。逆轉(zhuǎn)錄反應條件：16℃ 30 min→42℃ 30 min→85℃ 5 min。U6的逆轉(zhuǎn)錄反應條件為：37℃ 30 min→85℃ 5 min。取1 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行進行qRT-PCR。以U6作為內(nèi)參，正向引物為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物為：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；miR-138正向引物為5’-AGCTGGTGTTGTGAATCAGGCCG-3’，反向引物為：5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’；反應條件：95℃ 10 s；95℃ 15 s→60℃ 20 s 40個循環(huán)；60℃ 3 min。2-ΔΔCt法計算關節(jié)液中miR-138的相對表達量。

采用qRT-PCR法檢測關節(jié)軟骨中HIF-2α表達情況：分別取兩組患者軟骨組織標本各80 mg，提取軟骨組織總RNA，應用紫外分光光度計測定每個樣本總RNA的A260/A280的比值，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。HIF-2α上游序列：5’-GAGGGTTTCATTGCTGTGGT-3’，下游序列：5’-CTCACGGATCTCCTCATGGT-3’；內(nèi)參為β-actin，上游序列：5’-TCGATATAGCTATAGCTAGC-3’；下游序列：5’-TCGATAGAGAGCAAGCTAGC-3’。反應條件：94℃ 10 s；94℃ 10 s→60℃ 35 s，共40個循環(huán)；60℃ 3 min。2-ΔΔCt法計算關節(jié)軟骨中HIF-2α的相對表達量。

研究組患者膝關節(jié)置換術后隨訪1年，復發(fā)判斷標準[10]：①近1個月大多時間感到膝痛；②有骨贅形成；③膝關節(jié)活動時有骨膜擦音；④晨僵<0.5 h。將隨訪期間符合上述標準者記為復發(fā)，不符合則記為未復發(fā)。

1.5 觀察指標 觀察比較兩組患者關節(jié)液中miR-138及關節(jié)軟骨中HIF-2α表達比較；比較研究組不同分級患者關節(jié)液中miR-138和關節(jié)軟骨中HIF-2α表達；比較研究組未復發(fā)及復發(fā)患者關節(jié)液中miR-138和關節(jié)軟骨中HIF-2α表達情況。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者關節(jié)液中miR-138及關節(jié)軟骨中HIF-2α表達比較 研究組關節(jié)液中miR-138表達低于對照組，研究組關節(jié)軟骨中HIF-2α表達高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組患者關節(jié)液中miR-138與關節(jié)軟骨中HIF-2α表達比較

2.2 研究組不同分級患者關節(jié)液中miR-138和關節(jié)軟骨中HIF-2α表達比較 不同分級患者關節(jié)液中miR-138和關節(jié)軟骨中HIF-2α表達比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與Ⅱ級相比，研究組患者Ⅲ級和Ⅳ級關節(jié)液中miR-138表達均顯著降低，Ⅳ級又顯著低于Ⅲ級，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；相較于Ⅱ級，研究組患者Ⅲ級和Ⅳ級關節(jié)軟骨中HIF-2α表達均顯著升高，Ⅳ級又顯著高于Ⅲ級，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 研究組不同分級患者關節(jié)液中miR-138與關節(jié)軟骨中HIF-2α表達比較

2.3 研究組未復發(fā)及復發(fā)患者關節(jié)液中miR-138和關節(jié)軟骨中HIF-2α表達情況比較 研究組患者術后1年，共有7例患者出現(xiàn)復發(fā)。復發(fā)患者關節(jié)液中miR-138表達低于未復發(fā)患者，復發(fā)患者關節(jié)軟骨中HIF-2α表達高于未復發(fā)患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 未復發(fā)與復發(fā)患者關節(jié)液中miR-138和關節(jié)軟骨中HIF-2α表達情況比較

3 討論

本研究結(jié)果顯示，研究組患者關節(jié)液中miR-138表達低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示KOA患者關節(jié)液中miR-138表達顯著下調(diào)，且患者分級越高關節(jié)液中miR-138表達越低，提示KOA患者關節(jié)液中miR-138表達減少，且與患者病情嚴重程度有關。關節(jié)液主要由關節(jié)滑囊及腱鞘的滑液膜分泌，若膝關節(jié)發(fā)生病變，分泌的關節(jié)液中會出現(xiàn)病變代謝產(chǎn)物，并潴留在關節(jié)腔內(nèi)。miRNA主要是通過與RNA上對應的應答元件相結(jié)合發(fā)揮功能。有研究[11-12]顯示，miRNA廣泛參與機體的生理病理過程，當miRNA與靶基因結(jié)合時，可起到抑制或促進基因表達的作用。另有報道[13]指出，miR-138可作用于G蛋白偶聯(lián)受體激酶6，調(diào)節(jié)B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)及Bcl-2同源水溶性相關蛋白Bax，進而促進軟骨細胞增殖并抑制其凋亡，根據(jù)上述報道可推測KOA患者關節(jié)液中miR-138表達下降，對軟骨細胞的增殖和凋亡調(diào)節(jié)功能減弱，使得軟骨細胞增殖減少而凋亡增多，因此可加重軟骨病理改變。此外，miR-108表達下降可影響局部代謝，使得有害代謝物質(zhì)如促炎癥因子等潴留，也是誘發(fā)并加重關節(jié)軟骨病變的主要原因[14]。本研究與上報道和分析相符，提示miR-108可能是KOA治療研究的潛在靶點。

本研究結(jié)果顯示，研究組關節(jié)軟骨中HIF-2α的表達高于對照組，且研究組分級越高其表達越高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示KOA患者HIF-2α表達顯著上調(diào)，且可能參與病情進展。HIF-2α對關節(jié)軟骨中的低氧誘導極為重要，主要在高分化的軟骨細胞中表達，是胚胎骨骼發(fā)育和培養(yǎng)軟骨細胞的軟骨內(nèi)成骨所必須的細胞因子[15]。研究[16]發(fā)現(xiàn)，HIF-2α可能與關節(jié)軟骨細胞的破壞及凋亡有關，是關節(jié)軟骨的主要調(diào)控因子，可以通過調(diào)控基質(zhì)分解酶類和多種炎癥因子等的表達誘發(fā)軟骨破損。另一方面，HIF-2α高表達可致使關節(jié)軟骨更易受到損害，進而加重KOA患者的病情。此外，本研究中,研究組復發(fā)患者關節(jié)液中miR-138表達低于未復發(fā)患者，而關節(jié)軟骨中HIF-2α表達高于未復發(fā)患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，推測二者異常表達可能與KOA復發(fā)風險有關。有報道[17]指出，miR-138表達下降可能導致關節(jié)炎患者細胞免疫紊亂，而細胞免疫紊亂則是影響患者預后的重要因素，但既往尚未見關于關節(jié)液中miR-138及關節(jié)軟骨中HIF-2α異常表達與KOA患者復發(fā)的關系報道，但是結(jié)合上述分析可以推測關節(jié)液中miR-138表達下降可導致軟骨細胞大量凋亡，關節(jié)軟骨中HIF-2α高表達則可參與關節(jié)軟骨損害，因而二者均可增加KOA復發(fā)的風險。

綜上所述，關節(jié)液中miR-138及關節(jié)軟骨中HIF-2α表達與KOA的發(fā)生、發(fā)展及復發(fā)風險評估均有關。推測關節(jié)液中miR-138、關節(jié)軟骨中HIF-2α可能是KOA篩查、診斷的分子監(jiān)測物質(zhì)。由于KOA與多種因素調(diào)節(jié)相關，發(fā)病機制較復雜，miR-138、HIF-2α是否能單獨適用于KOA篩查、診斷及評估復發(fā)風險的監(jiān)測標志物還需深入進行研究。