魚(yú)腥草素鈉聯(lián)合亞胺培南西司他丁鈉對(duì)碳青霉烯耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌體外抑菌作用的研究*

周孟杰，毛建梅， 蔡 燕

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.產(chǎn)前診斷中心；3.風(fēng)濕免疫研究所，四川南充 637000)

鮑曼不動(dòng)桿菌是醫(yī)院感染中重要的多重耐藥細(xì)菌之一，其感染死亡率可達(dá)35%[1]。2019年全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率高達(dá)55.5%和57.1%，并呈現(xiàn)多重耐藥[2]，致使臨床能選擇的抗菌藥物越來(lái)越少。魚(yú)腥草具有抗菌作用，對(duì)金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌等均具有抑菌作用[3]，復(fù)方魚(yú)腥草能抑制鮑曼不動(dòng)桿菌生長(zhǎng)[4]。本研究以魚(yú)腥草揮發(fā)油中的活性成分癸酰乙醛亞硫酸鈉加成物(即魚(yú)腥草素鈉)為研究對(duì)象[3]，對(duì)魚(yú)腥草素鈉聯(lián)合亞胺培南西司他丁鈉對(duì)碳青霉烯耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(carbapenem resistant acinetobacter baumannii,CRAB)的抑菌效果進(jìn)行研究，以期為中藥治療CRAB感染提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1實(shí)驗(yàn)菌株來(lái)源

收集2018年1-4月川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院微生物室鑒定分離的10株CRAB，均為呼吸道來(lái)源標(biāo)本；質(zhì)控菌株ATCC19606為川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫研究所保存的菌株。

1.1.2儀器和主要試劑、藥品

SJ-CJ-2FD超凈工作臺(tái)、THZ-92A恒溫空氣搖床、DHP 420電熱恒溫培養(yǎng)箱、P200+超微量核酸蛋白分析儀、Tecan微孔板酶標(biāo)儀。魚(yú)腥草素鈉(西安開(kāi)來(lái)生物工程有限公司，規(guī)格10.0 g，批號(hào)K187155)；亞胺培南西司他丁鈉(美國(guó)Merck Sharp & Dohme Corp公司，規(guī)格1.0 g，其中含亞胺培南500 mg，西司他丁鈉500 mg，批號(hào)S026857)；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT，德國(guó)BioFroxx公司，批號(hào)EZ6688D183)；水解酪蛋白(MH)培養(yǎng)基(青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司)，MH瓊脂培養(yǎng)基(青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司)，二甲基亞砜(DMSO,成都市科隆化學(xué)品有限公司)。

1.2 方法

1.2.1菌懸液制備

將10株CRAB及ATCC19606在MH瓊脂平板中劃線(xiàn)培養(yǎng)9～12 h，挑取單克隆菌落接種于1 mL MH肉湯培養(yǎng)基中，置于37 ℃空氣恒溫?fù)u床(120 r/min)培養(yǎng)10～12 h。將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液離心(8 000 r/min)3 min，去上清液，加入1 mL生理鹽水重懸菌液；用超微量核酸蛋白分析儀在600 nm處檢測(cè)菌液吸光度(A)值，并用生理鹽水將菌液A值調(diào)至1.0 (約等于0.5麥?zhǔn)蠞岫?，菌量約1.5×108cfu/mL)，再用MH液體培養(yǎng)基將菌液稀釋1 000倍，放置于4 ℃冰箱中，30 mim內(nèi)使用。

1.2.2微量肉湯稀釋法測(cè)定最低抑菌濃度(MIC)

1.2.2.1MH肉湯培養(yǎng)基制備

稱(chēng)取6.25 g MH肉湯培養(yǎng)基于螺口試劑瓶中，加入250 mL去離子水，震蕩搖勻使培養(yǎng)基溶解，121 ℃高壓滅菌20 min，生物安全柜放涼備用。

1.2.2.2藥物配制

電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)取魚(yú)腥草素鈉粉劑，加入滅菌MH肉湯培養(yǎng)基，用漩渦震蕩儀震蕩混勻，配制成濃度為500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000、3 500、4 000、4 500、5 000、5 500 μg/mL的魚(yú)腥草素鈉MH溶液；吸取1 mg/mL的亞胺培南西司他丁鈉原液，按上述方法配制成濃度為5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55 μg/mL的亞胺培南西司他丁鈉MH溶液；用生理鹽水配制濃度為5 mg/mL MTT溶液，以上溶液用0.25 μm的細(xì)菌濾器過(guò)濾后備用，放置于4 ℃冰箱避光保存。

1.2.2.3接種

取無(wú)菌的96孔板，各取20 μL稀釋好的菌懸液和含藥MH液體培養(yǎng)基80 μL接種到96孔板對(duì)應(yīng)的孔中，設(shè)置不含細(xì)菌的亞胺培南西司他丁鈉藥物對(duì)照、不含細(xì)菌的魚(yú)腥草素鈉藥物對(duì)照、不含細(xì)菌及藥物的MH陰性對(duì)照、不含藥物的細(xì)菌陽(yáng)性對(duì)照；每孔液體總體積100 μL，不足者以MH培養(yǎng)基補(bǔ)入。每個(gè)藥物濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。加樣完畢后置于37 ℃空氣搖床震蕩(100 r/min)培養(yǎng)8～9 h。到達(dá)培養(yǎng)時(shí)間后，每孔加入10 μL 濃度為5 mg/mL MTT，放置于37 ℃空氣搖床震蕩(100 r/min)培養(yǎng)2 h，加入100 μL DMSO，放置于震蕩(100 r/min)搖床10 min，將肉眼觀察無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)孔所對(duì)應(yīng)的藥物濃度作為相應(yīng)菌株的MIC。

1.2.3瓊脂二倍稀釋法測(cè)定MIC

1.2.3.1含藥MH瓊脂平板制備

制備魚(yú)腥草素鈉含藥MH瓊脂平板濃度為250、500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000、3 500、4 000、4 500 μg/mL,亞胺培南西司他丁鈉含藥MH瓊脂平板濃度為5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 μg/mL。含藥MH瓊脂平板按V藥物∶V瓊脂培養(yǎng)基=1∶9比例，總體積10 mL。用電子天平稱(chēng)取魚(yú)腥草素鈉粉劑所需量及移液槍準(zhǔn)確吸取所需亞胺培南西司他丁鈉原液量并加入無(wú)菌試管，加入1 mL滅菌MH液體培養(yǎng)基并混勻；MH瓊脂培養(yǎng)基用去離子水溶解后高壓滅菌，待冷卻至60 ℃左右用無(wú)菌吸管吸取9 mL至無(wú)菌試管，吹打混勻后倒入無(wú)菌平板，制成含藥MH瓊脂平板。凝固后密封保存，放置于4 ℃冰箱備用，放置時(shí)間不要超過(guò)10 d。

1.2.3.2接種

用生理鹽水將過(guò)夜培養(yǎng)的10株菌株及ATCC19606的菌液A值調(diào)至1.0，并用MH液體培養(yǎng)基將菌液稀釋1 000倍備用。取2 μL接種于劃區(qū)的含藥MH瓊脂平板，設(shè)置1個(gè)平行對(duì)照，放入37 ℃孵箱中正面放置30 min，待干后將培養(yǎng)皿倒置，培養(yǎng)9～10 h后，在接種區(qū)域加入5 μL濃度為5 mg/mL 的MTT,放置于孵箱中孵育1 h后觀察結(jié)果。將肉眼觀察無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)或生長(zhǎng)明顯受抑制的培養(yǎng)孔所對(duì)應(yīng)的藥物濃度作為相應(yīng)菌株的MIC，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4微量肉湯稀釋法-棋盤(pán)滴定法檢測(cè)聯(lián)合抑菌作用

根據(jù)MIC值分別設(shè)定2種藥物終濃度為2 MIC,1 MIC,1/2 MIC,1/4 MIC,1/8 MIC,1/16 MIC，采用棋盤(pán)滴定法測(cè)分級(jí)抑制濃度。設(shè)置藥物對(duì)照、MH陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照。每孔總體積100 μL，其中魚(yú)腥草素鈉80 μL，亞胺培南西司他丁鈉10 μL，菌液10 μL。加樣完畢后放置于37 ℃空氣搖床震蕩(120 r/min)培養(yǎng)9 h，加入MTT 10 μL，放入37 ℃空氣搖床震蕩(120 r/min)培養(yǎng)1 h，加入100 μL DMSO，輕輕震蕩混勻10 min，肉眼觀察以未出現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的孔對(duì)應(yīng)的濃度為MIC值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5瓊脂二倍稀釋法檢測(cè)聯(lián)合抑菌作用

根據(jù)菌株單藥時(shí)MIC值設(shè)定聯(lián)合用藥濃度，魚(yú)腥草素鈉濃度值為4 000、2 000、1 000、5 00、250、0 μg/mL與亞胺培南西司他丁鈉濃度值80、40、20、10、0 μg/mL聯(lián)合用藥組合制作含藥平板，設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、空白對(duì)照。取2 μL菌液接種于劃區(qū)的平皿，設(shè)置1個(gè)平行對(duì)照，放入37 ℃孵箱中正面放置30 min，待干后將培養(yǎng)皿倒置，培養(yǎng)9 h后，在接種區(qū)域加入5 μL濃度為5 mg/mL的MTT,放置于孵箱中孵育1 h，觀察結(jié)果。將肉眼觀察無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)孔所對(duì)應(yīng)藥物濃度作為相應(yīng)菌株的MIC，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6部分抑菌濃度(fractional inhibitory concentration,FIC)和部分抑菌濃度指數(shù)(fractional inhibitory concentration index,FICI)計(jì)算

2 結(jié) 果

2.1 微量肉湯稀釋法和瓊脂二倍稀釋法單藥MIC值

根據(jù)肉眼觀察無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)孔對(duì)應(yīng)的藥物濃度作為MIC值，微量肉湯稀釋法中亞胺培南西司他丁鈉對(duì)CRAB的MIC在20～45 μg/mL，瓊脂二倍稀釋法中亞胺培南西司他丁鈉對(duì)CRAB的MIC在25～55 μg/mL。參照臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)會(huì)耐藥折點(diǎn)藥敏結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判讀，10株實(shí)驗(yàn)菌株均為亞胺培南西司他丁鈉耐藥菌株。魚(yú)腥草素鈉能抑制CRAB的生長(zhǎng)，結(jié)果顯示在微量肉湯稀釋法中魚(yú)腥草素鈉對(duì)CRAB的MIC在1 500～3 500 μg/mL，瓊脂二倍稀釋法中魚(yú)腥草素鈉對(duì)CRAB的MIC在2 500～3 000 μg/mL。見(jiàn)表1。

2.2 亞胺培南西司他丁鈉和魚(yú)腥草素鈉的聯(lián)合抑菌效果

本實(shí)驗(yàn)采用2種方法檢測(cè)亞胺培南西司他丁鈉(A藥)和魚(yú)腥草素鈉(B藥)的聯(lián)合抑菌效果，在培養(yǎng)孔中未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)且FICI≤1時(shí)其聯(lián)合抑菌效果表現(xiàn)為協(xié)同作用。以3號(hào)菌株為例，在微量肉湯稀釋法中亞胺培南西司他丁鈉(A藥)MIC值為25 μg/mL,魚(yú)腥草素鈉(B藥)MIC值為2 500 μg/mL；在瓊脂二倍稀釋法中亞胺培南西司他丁鈉(A藥)MIC值為80 μg/mL(解釋?zhuān)涵傊♂尫ㄖ恤~(yú)腥草素鈉濃度采用4 000、2 000、1 000、5 00、250、0 μg/mL、亞胺培南西司他丁鈉濃度80、40、20、10、0 μg/mL制作含藥MH瓊脂平板),魚(yú)腥草素鈉(B藥)MIC值為4 000 μg/mL，圖1B、圖2C所示白色區(qū)域表示對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)孔中無(wú)肉眼可見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)，且2種藥物聯(lián)合時(shí)FICI≤1；3號(hào)菌株FICI在0.5～1.0，根據(jù)FICI值判讀2種藥物對(duì)3號(hào)菌株的聯(lián)合抑菌效果為協(xié)同作用,見(jiàn)圖1、2。

表1 微量肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法單藥MIC值(μg/mL)

A:微量肉湯稀釋法-棋盤(pán)滴定法檢測(cè)聯(lián)合抑菌作用;B:3號(hào)菌株聯(lián)合用藥結(jié)果。亞胺培南西司他丁鈉(A藥)MIC值為25 μg/mL,魚(yú)腥草素鈉(B藥)MIC值為2 500 μg/mL。B圖黑色區(qū)域表示對(duì)應(yīng)的孔中有肉眼可見(jiàn)的細(xì)菌生長(zhǎng)；灰色區(qū)域表示對(duì)應(yīng)孔中無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，且FICI>1.00；白色區(qū)域中孔中無(wú)肉眼可見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)，且FICI在0.50～1.00。3號(hào)菌株FICI在0.50～1.00，兩種藥物對(duì)3號(hào)菌株的聯(lián)合抑菌效果為相加作用。

2.3 FIC和最優(yōu)FICI

魚(yú)腥草素鈉對(duì)CRAB的FIC值與亞胺培南西司他丁鈉對(duì)CRAB的FIC值相加，將數(shù)值最小的FICI值作為最優(yōu)部分抑菌濃度指數(shù)，結(jié)果顯示在微量肉湯稀釋法和瓊脂二倍稀釋法中，其最優(yōu)FICI值在0.5～1.0，均表現(xiàn)為相加作用。在微量肉湯稀釋法中，亞胺培南西司他丁鈉與不同濃度魚(yú)腥草素鈉聯(lián)合時(shí)，亞胺培南西司他丁鈉MIC值可下降1～3個(gè)稀釋濃度；在瓊脂二倍稀釋法中亞胺培南西司他丁鈉與魚(yú)腥草素鈉聯(lián)用其MIC值可下降1～2個(gè)稀釋濃度。根據(jù)FICI值結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)，魚(yú)腥草素鈉聯(lián)合亞胺培南西司他丁鈉對(duì)10株CRAB的聯(lián)合用藥效果均表現(xiàn)為相加作用，且2種實(shí)驗(yàn)方法評(píng)價(jià)結(jié)果一致。見(jiàn)表2。

A:瓊脂二倍稀釋法檢測(cè)聯(lián)合抑菌作用;B:瓊脂二倍稀釋法接種示意圖;C:3號(hào)菌株聯(lián)合用藥結(jié)果。亞胺培南西司他丁鈉(A藥)MIC值為80 μg/mL,魚(yú)腥草素鈉(B藥)MIC值為4 000 μg/mL。C:黑色區(qū)域?qū)?yīng)的孔中有肉眼可見(jiàn)的細(xì)菌生長(zhǎng)；灰色區(qū)域?qū)?yīng)孔是魚(yú)腥草和培養(yǎng)基的顏色其中無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，且FICI>1.00；白色區(qū)域?qū)?yīng)孔中無(wú)肉眼可見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)，且FICI在0.50～1.00。3號(hào)菌株FICI在0.75～1.00，2種藥物的聯(lián)合抑菌效果為相加作用。

表2 微量肉湯稀釋法和瓊脂二倍稀釋法聯(lián)合抑菌最優(yōu)FICI結(jié)果

3 討 論

隨著社會(huì)老齡化趨勢(shì)，醫(yī)院中高齡的重癥患者、多基礎(chǔ)疾病患者數(shù)量增加，住院時(shí)間長(zhǎng)、侵入性檢查治療等危險(xiǎn)因素導(dǎo)致醫(yī)院鮑曼不動(dòng)桿感染率上升[7]。亞胺培南是碳青霉烯抗生素的代表藥物，是非典型β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，其具有殺菌能力強(qiáng)、超廣譜抗菌活性等優(yōu)點(diǎn)[8]，是治療鮑曼不動(dòng)桿菌感染的常選藥物。但隨著亞胺培南西司他丁鈉在臨床上的廣泛使用，以及鮑曼不動(dòng)桿菌天然感受態(tài)特性，使其擁有獲得外源性耐藥基因的能力，CRAB的檢出率不斷上升。鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥機(jī)制與產(chǎn)生抗菌藥物相關(guān)的酶類(lèi)、藥物作用靶點(diǎn)改變、膜孔道蛋白的缺失、外排泵過(guò)度表達(dá)、可移動(dòng)遺傳元件如整合子、生物被膜等因素有關(guān)[9]。多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌感染可供選擇的抗菌藥物很少，即使菌株對(duì)替加環(huán)素和多粘菌素的敏感率相對(duì)較高，但單藥治療失敗率高，且這些藥物不良反應(yīng)大。多粘菌素常見(jiàn)的不良反應(yīng)有腎毒性，會(huì)造成急性腎損傷[10];替加環(huán)素最常見(jiàn)不良反應(yīng)有惡心、嘔吐、腹瀉等胃腸道反應(yīng)[11]，給鮑曼不動(dòng)桿菌感染的治療帶來(lái)困境。

隨著細(xì)菌耐藥形勢(shì)的加劇，越來(lái)越多的目光聚集到傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中抗菌植物是新型抗菌化合物的重要來(lái)源，世界范圍內(nèi)批準(zhǔn)的藥物中大部分來(lái)源于天然產(chǎn)品，大部分藥物都是從天然植物中提取的[12]。魚(yú)腥草具有“中藥抗生素”之稱(chēng)，其魚(yú)腥草注射液臨床上常用于上呼吸道感染、盆腔炎、尿路感染等疾病的治療且價(jià)格便宜，但由于其可能導(dǎo)致嚴(yán)重過(guò)敏反應(yīng)，限制了臨床的廣泛應(yīng)用。中藥復(fù)方制劑成分和藥理作用復(fù)雜多樣，可能造成藥物不良事件。魚(yú)腥草素鈉在臨床用藥上以靜脈注射、肌肉注射效果優(yōu)于口服用藥，但用藥安全性和有效性的問(wèn)題仍需解決，中藥單體因純度高、成分明確、活性高成為研究的重點(diǎn)。魚(yú)腥草素鈉具有抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫力、抑菌、抗病毒的作用[13]，對(duì)多種革蘭陽(yáng)性細(xì)菌和革蘭陰性細(xì)菌如金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、肺炎雙球菌、卡他球菌、白喉?xiàng)U菌、變形桿菌、痢疾桿菌、腸炎桿菌等均有不同程度的抑制作用，其中對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌及枯草桿菌的抑菌結(jié)果較強(qiáng)[14]；魚(yú)腥草素鈉可增強(qiáng)金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯桿菌生物被膜早期黏附的清除作用，抑制生物被膜形成[15]。

綜上，本研究結(jié)果顯示魚(yú)腥草素鈉能抑制耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌生長(zhǎng)，在微量肉湯稀釋法中檢測(cè)到MIC在1 500～3 500 μg/mL，瓊脂二倍稀釋法中MIC在2 500～3 000 μg/mL，與亞胺培南西司他丁鈉聯(lián)用后能增加其抑菌效果，使亞胺培南西司他丁鈉的MIC下降，其最優(yōu)FICI在0.5～1.0，2種藥物聯(lián)合效應(yīng)為相加作用。采用微量肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法2種方法進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)，2種方法結(jié)果一致。但是魚(yú)腥草素鈉的抑菌機(jī)制目前暫不清楚，可能與抑制細(xì)菌生物被膜形成有關(guān)、抑制細(xì)菌主動(dòng)外排泵、消除耐藥質(zhì)粒等有關(guān)，其機(jī)制需要進(jìn)一步進(jìn)行研究。