響應面法優(yōu)化桑葚多糖純化工藝及不同產(chǎn)物的抗運動疲勞活性比較

靳鐵柱

（西安財經(jīng)大學行知學院，陜西 西安 710038）

桑葚為桑科植物桑樹的成熟果穗，味甜多汁，富含多糖、黃酮、維生素、花色素和人體必需氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，具有滋陰補血、生津潤燥的功效，長期食用可增強免疫力，并有助于降糖、降脂，促進血紅細胞的生成[1-2]。有研究認為，以上功效的基礎活性成分之一為桑葚多糖。王強等[3]發(fā)現(xiàn)，桑葚多糖有利于調(diào)節(jié)糖尿病大鼠的血糖水平，且對羥基自由基和超氧自由基具有較好的清除作用；韓偉等[4]指出，桑葚多糖對1,1-二苯基-2-苦基肼基（DPPH）自由基的半數(shù)抑制率優(yōu)于常用抗氧化劑——抗壞血酸和蘆??；劉兵[5]利用動物疲勞模型研究發(fā)現(xiàn)，桑葚多糖可顯著提高小鼠的力竭游泳時間，并降低其運動后體內(nèi)血乳酸與尿素氮含量，具有較好的抗疲勞作用。

由于桑葚多糖的傳統(tǒng)制法采用石油醚脫色，Sevag試劑（V氯仿∶V正丁醇=1∶4）去除蛋白質(zhì)，不僅操作費時繁瑣，且易破壞多糖結(jié)構，并可殘留有毒溶劑，而大孔樹脂具有穩(wěn)定性高、吸附容量大、吸附速度快、選擇性好、可重復使用等優(yōu)點，已被廣泛用于去除粗多糖中色素與蛋白質(zhì)[6-7]。因此，本研究利用大孔樹脂具有機械篩分與化學吸附的特性，吸附桑葚粗多糖溶液中色素與蛋白質(zhì)雜質(zhì)，探討最佳純化工藝條件，并通過動物試驗比較純化前后多糖化合物的抗運動疲勞活性，從而為桑葚多糖的開發(fā)與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

桑葚，購于西安農(nóng)副產(chǎn)品批發(fā)市場；苯酚、濃硫酸、無水乙醇、無水乙醚、三氯醋酸（均為分析純），國藥集團化學試劑有限公司；D-無水葡萄糖對照品，中國食品藥品檢定研究院；H103、D101型大孔樹脂，粘津浩聚樹脂科技有限公司；HPD300、DA201、DM301、S-8、NKA-9型大孔樹脂，河北滄州寶恩化工有限公司；血乳酸（BLA）、乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒，廈門侖昌碩生物科技有限公司；考馬斯亮藍試驗試劑盒，南京建成生物工程研究所；試驗用水為純化水。

SPF級雄性昆明小鼠（2月齡，體重16～24 g，飼養(yǎng)環(huán)境溫度和相對濕度分別為20～25℃和50%～70%），購于西安益豐達生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設備

L9型紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；ME204型電子分析天平，梅特勒-拖利多有限公司；XC-600C型超聲波器，濟寧鑫欣超聲電子設備有限公司；RE-3000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海越眾儀器設備有限公司；TD5AWS型低速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 桑葚粗多糖制備

稱取500 g桑葚，于60℃烘箱干燥后粉碎，過80目篩，加入95%乙醇溶液1 000 mL浸泡12 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干溶劑，收集桑葚渣于60℃烘干。精密稱取100 g桑葚渣，按照料液比1∶27（g/mL）加入純化水，于72℃、320 W功率下超聲處理25 min，離心回收上清液，將提取液減壓蒸餾濃縮至浸膏后，加入95%乙醇溶液500 mL，4℃下靜置2 h后過濾，重復2次，合并沉淀物，經(jīng)冷凍干燥后，即得桑葚粗多糖[8]。

1.2.2 樹脂純化效果指標測定

1.2.2.1 脫色率

不同樣品溶液分別于450 nm波長測定吸光度值A，計算脫色率[9]。

脫色率（%）=（A脫色前-A脫色后）/A脫色前×100

1.2.2.2 蛋白質(zhì)脫除率

采用考馬斯亮藍染色法測定不同樣品的蛋白質(zhì)含量[10]，計算蛋白質(zhì)脫除率。

蛋白質(zhì)脫除率（%）=純化后的蛋白質(zhì)含量/純化前的蛋白質(zhì)含量×100

1.2.2.3 多糖回收率

采用苯酚-硫酸法測定不同樣品的多糖含量，計算多糖回收率[11]。

多糖回收率（%）=純化后的多糖含量/純化前的多糖含量×100

1.2.2.4 綜合評價指數(shù)

參考劉沖英等[12]評價大孔樹脂純化地黃粗多糖的方法，對純化前、后樣品的脫色率、蛋白質(zhì)脫除率及多糖回收率加權求和計算綜合評價指數(shù)，以評價桑葚粗多糖不同條件下的純化效果，綜合評價指數(shù)計算公式如下：

綜合評價指數(shù)=0.3×脫色率+0.3×蛋白質(zhì)脫除率+0.4×多糖回收率

1.2.3 靜態(tài)吸附-解吸試驗

將經(jīng)過預處理的2 g不同型號樹脂分別置于100 mL錐形瓶內(nèi)，加入5 mg/mL桑葚粗多糖水溶液20 mL，于25℃振蕩吸附12 h后過濾，分別向過濾后的樹脂中加入50 mL去離子水，于相同條件振蕩解吸12 h后過濾，按照“1.2.2”中所述方法測定處理前、后樣品溶液中色素值、蛋白質(zhì)含量與多糖含量，比較不同類型樹脂的純化能力[13]。

1.2.4 動態(tài)吸附-洗脫試驗

1.2.4.1 試驗步驟

準確稱取10 g靜態(tài)吸附篩選的最佳型號樹脂，濕法裝柱（Ф2 cm×50 cm）后，加入一定質(zhì)量濃度的桑葚粗多糖溶液，控制流速為1.0 mL/min上樣后，靜置吸附30 min，采用去離子水作為洗脫液，按照一定流速洗脫目標化合物后，測定收集液中脫色率、蛋白質(zhì)去除率及多糖回收率。

1.2.4.2 上樣液濃度考察

固定上樣液體積60 mL，洗脫流速1.0 mL/min，洗脫液體積130 mL，按照“1.2.4.1”試驗步驟，考察不同上樣濃度（5、10、15、20、25 mg/mL）對脫色率、蛋白質(zhì)去除率和多糖回收率的影響。

1.2.4.3 上樣液體積考察

固定上樣液濃度15 mg/mL，洗脫流速1.0 mL/min，洗脫液體積130 mL，按照“1.2.4.1”方法，考察不同上樣液體積（20、40、60、80、100、120 mL）對脫色率、蛋白質(zhì)去除率和多糖回收率的影響。

1.2.4.4 洗脫流速考察

固定上樣液濃度15 mg/mL，上樣液體積60 mL，洗脫液體積130 mL，按照“1.2.4.1”方法，考察不同洗脫流速（0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL/min）對脫色率、蛋白質(zhì)去除率和多糖回收率的影響。

1.2.4.5 洗脫液體積考察

固定上樣液濃度15 mg/mL，上樣液體積60 mL，洗脫流速1.0 mL/min，按照“1.2.4.1”方法，考察不同洗脫液體積（100、110、120、130、140、150 mL）對脫色率、蛋白質(zhì)去除率和多糖回收率的影響。

1.2.5 響應面試驗設計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用Box-Behnken試驗設計原理，以綜合評價指數(shù)為考察指標，上樣液濃度、洗脫流速與洗脫液體積為考察因素，進行響應面優(yōu)化試驗，以確定桑葚粗多糖的最佳純化工藝，具體因素水平見表1。

表1 響應面試驗設計因素與水平表Table 1 Factorsand levels of response surface experiment

1.2.6 抗運動疲勞活性測定

1.2.6.1 動物試驗設計

60只健康雄性小鼠經(jīng)適應性喂養(yǎng)7 d后，隨機分為對照組、提取組和純化組，每組各20只。對照組給予0.85%生理鹽水，而提取組和純化組小鼠每日分別灌胃純化前和純化后的桑葚多糖0.30 mg/g BW，灌胃體積均為0.2 mL/10 g BW，每天經(jīng)口灌胃1次，連續(xù)灌胃30 d[14]。

1.2.6.2 力竭游泳時間

末次灌胃后，各組隨機選擇10只小鼠，于鼠尾綁定重物后，置于泳池內(nèi)，記錄小鼠入水至沉沒15 s無法浮出水面的時間。

1.2.6.3 血液生化指標測定

末次灌胃后，將各組剩余小鼠置于泳池內(nèi)游泳30 min后，取出擦凈，休息10 min，于眼眶處取血離心，利用BLA、LDH檢測試劑盒測定運動后小鼠血清中BLA含量和LDH活力[15]。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.0軟件進行數(shù)據(jù)處理并作圖，動物試驗采用SPSS19.0軟件進行方差分析。試驗數(shù)據(jù)均為3次重復試驗結(jié)果的平均值，結(jié)果以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 靜態(tài)吸附-解吸試驗結(jié)果

表2為不同型號大孔樹脂對桑葚粗多糖的靜態(tài)吸附-解吸試驗結(jié)果。由表2可見，不同型號大孔樹脂對桑葚粗多糖的靜態(tài)吸附-解吸試驗結(jié)果差異較大。與其他類型樹脂相比，非極性類樹脂對桑葚粗多糖中色素與蛋白的去除效果較好，且回收率較高。這歸因于色素和多數(shù)蛋白質(zhì)的極性低，與該類型樹脂具有較好的吸附作用，而H103樹脂的比表面積≥900 m2/g，提供的吸附活性位點較多[16]。因此確定采用該樹脂進行后續(xù)桑葚多糖純化工藝研究。

表2 不同型號大孔樹脂對桑葚粗多糖的純化效果Table 2 Purification effect of different models of macroporousresin on mulberry crudepolysaccharide

2.2 不同上樣濃度對純化效果的影響

由圖1可知，H103樹脂對桑葚多糖的回收率初期較高，可維持在80%左右，但當上樣濃度超過15 mg/mL時回收率開始下降，這源于上樣濃度過高，使得樹脂過飽和吸附，易發(fā)生多糖化合物的泄漏。另外，其對蛋白質(zhì)與色素雜質(zhì)的吸附量也隨著上樣濃度的增大，而緩慢減少至達到飽和吸附平衡。因此選擇10、15、20 mg/mL上樣濃度作為后續(xù)響應面試驗的考察水平。

圖1 不同上樣濃度對脫色率、蛋白質(zhì)脫除率及多糖回收率的影響Fig.1 Effect of different sample concentrations on decolorization,protein removal and polysaccharide recovery rates

2.3 不同上樣液體積對純化效果的影響

由圖2可知，隨著上樣液體積的增大，脫色率與蛋白質(zhì)脫除率均逐漸下降，這與張迪等[17]利用大孔樹脂吸附純化雙孢菇多糖研究結(jié)果一致。多糖回收率則在上樣液體積為60 mL時快速下降，表明上樣量達到一定體積時，H103樹脂對多糖化合物的吸附達到飽和，繼續(xù)增大上樣量，不利于提高樹脂的吸附效率。因此最佳上樣液體積應為60 mL。

圖2 不同上樣液體積對脫色率、蛋白質(zhì)脫除率及多糖回收率的影響Fig.2 Effect of different sample volumeson decolorization,protein removal and polysacchariderecovery rates

2.4 不同洗脫流速對純化效果的影響

由圖3可知，隨著洗脫流速的增大，脫色率與蛋白質(zhì)脫除率均不斷減小，而多糖回收率呈先增大后減小的趨勢。由于洗脫流速過慢，使得洗脫時間過長，而流速過快，使得多糖洗脫不充分，同時導致吸附在樹脂內(nèi)的雜質(zhì)易被洗脫。綜合考慮，選擇0.5、1.0、2.0mL/min洗脫流速作為后續(xù)響應面試驗因素考察水平。

圖3 不同洗脫流速對脫色率、蛋白質(zhì)脫除率及多糖回收率的影響Fig.3 Effect of different elution velocitieson decolorization,protein removal and polysacchariderecovery rates

2.5 不同洗脫液體積對純化效果的影響

由圖4可見，隨著洗脫液體積的增大，多糖回收率逐漸升高至平衡，當洗脫液體積為130 mL時，回收率基本穩(wěn)定，表明吸附在樹脂內(nèi)的桑葚多糖基本流出柱床，而脫色率與蛋白質(zhì)脫除率均緩慢下降，表明有部分蛋白質(zhì)或色素被洗脫。因此選擇洗脫液體積120、130、140 mL作為后續(xù)響應面試驗因素考察水平。

圖4 不同洗脫液體積對脫色率、蛋白質(zhì)脫除率及多糖回收率的影響Fig.4 Effect of different eluent volumes on decolorization,protein removal and polysacchariderecovery rates

2.6 響應面試驗結(jié)果與方差分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用Box-Behnken中心組合設計原理，以上樣液濃度（A）、洗脫流速（B）和洗脫液體積（C）為自變量，以桑葚多糖純化效果的綜合評價指數(shù)為響應值，進行三因素三水平響應面優(yōu)化試驗，試驗設計及結(jié)果見表3。

采用多元回歸擬合表3中的結(jié)果，得到以綜合評價指數(shù)為目標函數(shù)的二次多項回歸模型：Y=74.34-0.66A+0.14B+0.015C-0.25AB-0.38AC-0.47BC-3.67A2-2.57B2-1.30C2，對其進行顯著性檢驗與方差分析，結(jié)果見表4。

表3 響應面試驗設計方案及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiments

由表4可知，通過響應面試驗結(jié)果擬合的回歸模型為極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05）。模型R2=0.989 4，接近于1，表明模型可靠程度高。另外模型變異系數(shù)CV=0.79%＜1%，可知模型外因素對結(jié)果的影響較小，該模型可用于實際結(jié)果的預測。在所有一次項中，上樣液濃度的影響顯著（P＜0.05），所有二次項影響均為極顯著（P＜0.01）。由F值可知，各因素對桑葚多糖純化效果的影響大小順序為：上樣液濃度（A）＞洗脫流速（B）＞洗脫液體積（C）。

表4 響應面方差分析Table4 Variance analysisof response surface experiment

2.7 響應面分析與最佳純化工藝驗證

由圖5可見，所有交互曲面，隨著各因素水平的增加，綜合評價指數(shù)均升高緩慢，各因素之間交互作用不顯著。對上述回歸方程采用一階偏導，預測最佳工藝條件為：上樣濃度14.5 mg/mL，洗脫流速1.3 mL/min，洗脫液體積130 mL，預測綜合評價指數(shù)為76.2。

圖5 各因素交互作用對桑葚多糖純化綜合評價指數(shù)影響的響應面圖Fig.5 Responsesurfacemap of interaction of different factorson purificationcomprehensive evaluation index of mulberry polysaccharide

為了驗證模型預測的最佳工藝，采用上樣液濃度14.5 mg/mL，上樣液體積60 mL，洗脫流速1.3 mL/min和洗脫液體積130 mL對桑葚多糖粗提物進行純化，測得樣品中脫色率為78.2%±1.4%，蛋白質(zhì)脫除率為67.3%±2.2%，多糖回收率為81.5%±1.2%，綜合評價指數(shù)76.4±1.5，試驗值與預測值差異較小，表明擬合得到的二次多項回歸模型可較好地預測考察因素與響應值間的關系。

2.8 桑葚多糖純化前后抗運動疲勞活性比較結(jié)果

2.8.1 小鼠力竭游泳時間比較

由表5可知，與對照組相比，提取組小鼠的力竭游泳時間延長了2.6 min，而純化組小鼠的力竭游泳時間延長了6.1 min，均具有極顯著性差異（P＜0.01），同時純化組小鼠的力竭游泳時間較對照組明顯延長，具有極顯著性差異（P＜0.01）。動物的力竭游泳時間反映其運動耐力，在高強度運動過程中，肌肉的快速收縮誘導活性氧與NO的水平升高，相關肌蛋白S-亞硝基化，促使體內(nèi)自由基數(shù)量增多，導致各組織、器官供氧不足，機體生理環(huán)境發(fā)生改變，不能維持預定的運動強度，從而產(chǎn)生疲勞感[18]。純化產(chǎn)物中桑葚多糖含量增大，致使抗氧化能力增強，有助于進一步提高動物的運動耐力，因此抗運動疲勞作用較好，這與張濤濤[14]考察不同杜仲多糖產(chǎn)物對小鼠的抗運動疲勞影響結(jié)果相同。

表5 桑葚多糖純化前后對小鼠力竭游泳時間的影響Table5 Effect of mulberry polysaccharidesbeforeand after purification on exhaustive swimming time in mice

2.8.2 小鼠血液生化指標比較

由于運動過量導致肌肉收縮加劇，使得供氧不足生成乳酸，四肢開始出現(xiàn)“酸痛”，乳酸脫氫酶可加快體內(nèi)乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸，緩解運動后的機體不適感[19]，桑葚多糖對運動后小鼠相關血液生化指標的影響見表6。由表6可知，與對照組相比，提取組小鼠的BLA含量降低了1.2 mmol/L，差異具顯著性（P＜0.05），LDH活力提高了46.3 U/L，差異具極顯著性（P＜0.01），而純化組小鼠的BLA含量降低了2.3 mmol/L，LDH活力提高了124.1 U/L，差異均具極顯著性（P＜0.01）。灌胃不同純度多糖的兩組動物體內(nèi)BLA含量和LDH活力的差異分別為顯著性和極顯著性，表明純化后的桑葚多糖有助于進一步提高體內(nèi)乳酸脫氫酶活力，加快運動時生成的乳酸代謝。

表6 桑葚多糖純化前后對小鼠的BLA含量與LDH活力的影響Table6 Effect of mulberry polysaccharidesbefore and after purification on BLA content and LDH activity in mice

3 結(jié)論

色素和蛋白質(zhì)作為桑葚粗多糖的主要雜質(zhì)，會影響其結(jié)構分析與活性，而采用雙氧水法、Sevage法在去除色素與蛋白質(zhì)的過程中，多糖保留率較低。因此，本研究采用大孔樹脂對桑葚粗多糖進行純化，并考察桑葚多糖純化前后對小鼠抗運動疲勞效果的影響。通過對7種大孔樹脂的靜態(tài)吸附與解吸性能考察，確定采用H103樹脂純化桑葚多糖粗提物，在單因素試驗結(jié)果基礎上，根據(jù)響應面試驗確定最佳純化工藝為：上樣液濃度為14.5 mg/mL，上樣液體積為60 mL，上樣流速為1.0 mL/min，洗脫流速為1.3 mL/min和洗脫液體積為130 mL。經(jīng)該工藝純化后的桑葚多糖樣品脫色率為78.2%±1.4%，蛋白質(zhì)脫除率為67.3%±2.2%，多糖回收率為81.5%±1.2%，綜合評價指數(shù)76.4±1.5。與粗提物相比，純化后的桑葚多糖可進一步延長小鼠的力竭游泳時間，增強其乳酸脫氫酶的活力，并加快小鼠運動時體內(nèi)生成的乳酸代謝，具有較好的抗運動疲勞活性，有利于其在營養(yǎng)領域的深度開發(fā)。