熱休克因子1通過(guò)上調(diào)蛋白質(zhì)C減輕膿毒癥凝血功能障礙保護(hù)小鼠急性肺損傷*

王 浩 李 濤 肖 歸 劉梅冬 劉 可 張華莉 朱雅茜** 肖獻(xiàn)忠**

（1）中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，長(zhǎng)沙410008；2）膿毒癥轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙410008；3）醫(yī)學(xué)機(jī)能學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，長(zhǎng)沙410078；4）嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，梅州514031；5）中南大學(xué)湘雅護(hù)理學(xué)院，長(zhǎng)沙410008）

膿毒癥（sepsis）是宿主在嚴(yán)重感染等因素作用下，免疫反應(yīng)失調(diào)引起器官功能障礙的一種威脅生命的臨床綜合征［1-3］，是各種嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、感染以及大手術(shù)后常見(jiàn)的并發(fā)癥，其病情進(jìn)展迅速，病死率高，給臨床救治帶來(lái)許多挑戰(zhàn)［4］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年住院的嚴(yán)重膿毒癥病例數(shù)接近1 900萬(wàn)，每年有多達(dá)500萬(wàn)人死于膿毒癥［5-6］，是當(dāng)前危害人類健康的重要問(wèn)題。膿毒癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，當(dāng)膿毒癥發(fā)生時(shí)，病原體相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular patterns， PAMPs）和損傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）作用多個(gè)系統(tǒng)，導(dǎo)致各種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活和多種基因表達(dá)調(diào)控的改變，引起復(fù)雜的病理生理改變和多種組織器官損傷［7］。

凝血功能的紊亂是膿毒癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中重要的病理生理變化之一。當(dāng)凝血系統(tǒng)被激活，觸發(fā)凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生大量微血栓甚至彌散性血管內(nèi)凝血（disseminated intravascular coagulation， DIC）的形成，最終導(dǎo)致多器官功能衰竭，是患者死亡的重要原因［8-9］?？鼓委熆梢欢ǔ潭雀纳颇δ芪蓙y，提高患者膿毒癥DIC 患者的生存率［10］。研究膿毒癥凝血功能紊亂的發(fā)生機(jī)制，找到新的藥物干預(yù)靶標(biāo)，對(duì)提高患者的生存率具有重要意義。

熱休克因子1（heat shock factor 1，HSFl）是機(jī)體內(nèi)一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等病理過(guò)程中起到了重要的調(diào)控作用。課題組的前期研究顯示，HSF1 對(duì)小鼠內(nèi)毒素血癥具有明顯的保護(hù)作用，HSF1通過(guò)上調(diào)熱休克蛋白70的表達(dá)，抑制內(nèi)毒素所致晚期炎癥介質(zhì)高遷移率族蛋白1的釋放，減輕全身炎癥反應(yīng)［11-12］，也可以通過(guò)直接調(diào)控粒細(xì)胞集落刺激因子、白介素-10 等多種炎癥因子的表達(dá)［13-15］，減輕內(nèi)毒素血癥小鼠的多器官損傷。HSF1作為膿毒癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中重要的保護(hù)因子，對(duì)膿毒癥凝血功能紊亂起到調(diào)控作用目前報(bào)道較少。因此，本研究旨在探討HSF1是否通過(guò)改善膿毒癥小鼠的凝血活性從而對(duì)小鼠的肺組織起到一定的保護(hù)作用，以期揭示HSF1在膿毒癥凝血功能障礙中的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)小鼠為HSF1 基因敲除（HSF1-/-）和野生型（HSF1+/+）小鼠，由美國(guó)密爾沃基威斯康星州醫(yī)學(xué)院Ivor J Benjamin教授惠贈(zèng)［16］，中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心負(fù)責(zé)飼養(yǎng)，SPF級(jí)，經(jīng)過(guò)小鼠基因型鑒定、篩選及配種繁殖，獲取合格的HSF1-/-和HSF1+/+小鼠，性別和年齡同等匹配，雌雄各半，年齡8～12周，體重20～25 g。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 小鼠行盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（cecal ligation and puncture，CLP）構(gòu)建小鼠膿毒癥模型

小鼠CLP 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒖嘉墨I(xiàn)方法進(jìn)行［17-18］。具體步驟如下：取HSF1-/-和HSF1+/+小鼠，首先用2%異氟烷麻醉小鼠。充分暴露小鼠腹部，沿腹中線垂直剪開(kāi)腹部皮膚和肌層約0.5～1 cm，于左下腹腹腔中取出盲腸后，在靠近盲腸末端中外1/3 處穿線結(jié)扎，取21 號(hào)針在外1/3 處給予盲腸對(duì)穿孔，并用鑷子輕輕擠出少許糞便以保證穿孔處通暢，關(guān)閉腹腔，術(shù)后皮下注射1 ml 溫?zé)嵘睇}水液體復(fù)蘇。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，觀察小鼠的變化以判斷膿毒癥模型建模成功。

1.3 血液樣本采集和處理

心臟穿刺法采血。在穿刺前，在注射器中加入抗凝劑（3.8%檸檬酸鈉，1∶9），提取血液并上下顛倒充分混合。血液樣本立即在4°C，1 000g，離心15 min。血漿樣本立即用于凝血指標(biāo)分析。剩余的血漿樣品在-80℃下冷凍，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 小鼠肺組織病理學(xué)觀察

小鼠脫頸處死，迅速提取部分肺組織，置于4%多聚甲醛中固定24 h，經(jīng)脫水、透明、透蠟和石蠟包埋后切成3～5μm厚度的薄片，切片再使用二甲苯脫蠟后，各級(jí)濃度的乙醇水化及蒸餾水沖洗，蘇木精（hematoxylin，H）及伊紅（eosin，E）水溶液中染色5～15 min，常規(guī)清洗、酒精脫水，二甲苯透明后中性樹(shù)膠封片。HE 染色后的組織切片置于光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)的變化并進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分以判斷組織損傷程度。

1.5 肺組織濕/干重比（wet/dry ratio，W/D）檢測(cè)

采用肺組織濕/干重比檢測(cè)來(lái)評(píng)估小鼠肺水腫的程度。小鼠在CLP 后不同時(shí)間點(diǎn)脫頸處死，開(kāi)胸摘除一側(cè)肺組織并稱重（濕重）。肺組織在80°C下加熱24 h，以獲得干重并計(jì)算W/D比值。

1.6 組織免疫熒光染色

在不同時(shí)間點(diǎn)處死CLP 模型小鼠。立即取出左肺，用4%多聚甲醛固定24 h。石蠟包埋后，將組織切成4 μm的切片。經(jīng)抗原修復(fù)后，加5%山羊血清封閉液，室溫放置20 min。隨后，加入抗纖維蛋白/纖維蛋白原一抗（1∶200，Abcam），4oC 下避光孵育過(guò)夜。加入FITC 山羊抗兔IgG（1∶250，Abclonal）的熒光二抗，37℃避光孵育1～1.5 h。加抗熒光衰減封片液封片。熒光顯微鏡（全景MIDI全景250，匈牙利）進(jìn)行圖像采集。

1.7 qRT-PCR

使用TRIzol?試劑（Invitrogen Thermo Fisher，美國(guó)） 提取肺組織或細(xì)胞中的總RNA，經(jīng)PrimeScript 逆轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa，日本）和隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用Applied Biosystems 7500 PCR 儀器進(jìn)行PCR 反應(yīng)。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃30 s；變性95℃5 s；退火延伸60℃34 s；40個(gè)循環(huán)。在60℃設(shè)置熒光檢測(cè)點(diǎn)。qRT-PCR 的引物序列為：蛋白質(zhì)C （Pro C） 上游引物，5＇-ATCTGTGACTTCGAGGAGGC-3＇，下游引物，5＇-ATTGTTCACCCGACAGTCCT-3＇；β-actin 上 游 引物，5＇-CATTGCTGAC AGGATGCAGAAGG-3＇，下游引物，5＇-TGCTGGAAGGTGGACAGTGAGG-3＇。以2-△△Ct表示每個(gè)樣本mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

小鼠心臟采血后，立即4°C，1 000g，離心15 min，收集上清即血漿于新的滅菌EP 管中用于BCA 蛋白定量和活化蛋白質(zhì)C （APC）（CSBE09914m，湖北武漢）的含量檢測(cè)。方法按照廠家提供的標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行。

1.9 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）

從肺組織或細(xì)胞中分離的蛋白質(zhì)樣品經(jīng)SDSPAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜后，5%牛奶封閉液中（TBST 配制） 封閉2 h，加入蛋白質(zhì)C（1∶1 000，GeneTex）和β-actin（1∶2 500，Cell Signalling Technology）抗體，4°C孵育過(guò)夜。加入用5%BSA 配制的相應(yīng)二抗，室溫?fù)u床孵育1.5 h。TBST 洗膜3 次后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光法顯色，結(jié)果采用ImageJ軟件對(duì)圖像進(jìn)行定量分析。

1.10 質(zhì)粒構(gòu)建及提取

組成活化型HSF1質(zhì)粒pcDNA3.1（+）/HSF1（+）（mHSF1）和空載體質(zhì)粒pcDNA3.1（+）/HSF1-wt 由瑞士Pharmaceuticals S.A.的Richard Voellmy博士提供。蛋白質(zhì)C 全長(zhǎng)質(zhì)粒pGL3-ProC-wt（ProC-wt，-621～-1 bp）和突變質(zhì)粒pGL3-ProC-mut（HSE1-mut，-584～-577 bp突變）的構(gòu)建由上海生物有限工程公司完成，通過(guò)測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證了合成序列的真實(shí)性。質(zhì)粒提取（D6950-01，Omega）根據(jù)廠家說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，提取后的質(zhì)粒-20°C下存儲(chǔ)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.11 細(xì)胞核蛋白的提取

bEnd.3 細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)皿中43°C 熱處理60 min［19］。 細(xì) 胞 核 蛋 白 提 ?。?0126ES50，Yeasen）按以下步驟進(jìn)行：細(xì)胞收集于離心管中，在細(xì)胞沉淀中按每20 μl 加入含PMSF 的試劑A 200μl。最高速劇烈渦旋5 s，完全懸浮分散細(xì)胞沉淀，冰浴10～15 min。加入胞漿蛋白抽提試劑B（試劑B）10μl，最高速劇烈渦旋5 s，冰浴1 min。最高速劇烈震蕩渦旋5 s，4℃離心，12 000～16 000g，5 min。去除上清，加入含PMSF的試劑C 50μl。最高速劇烈渦旋15～30 s，完全懸浮分散沉淀，置于冰中，每隔1～2 min 再高速劇烈渦旋15～30 s，共持續(xù)30 min。然后，4℃，12 000～16 000g離心10 min。立即吸取上清（細(xì)胞核蛋白）至另一預(yù)冷的離心管中。BCA 法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度后立即使用或-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.12 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

bEnd.3 細(xì)胞在含10% 的胎牛血清（FBS）（Gibco，Thermo Fisher Scientific）的高糖DMEM（Gibco，Thermo Fisher Scientific）培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞鋪板后，待生長(zhǎng)密度控制在70%～80%進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，使用Lipofectamine?3000 Reagent（L3000015，Invitrogen）進(jìn)行質(zhì)粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.13 凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn) （electrophoretic mobility shift assay，EMSA）

根據(jù)蛋白質(zhì)C 啟動(dòng)子區(qū)的HSE［20-21］序列進(jìn)行設(shè)計(jì)并由上海生物工程技術(shù)公司合成寡核苷酸探針（包括標(biāo)記探針、競(jìng)爭(zhēng)探針和突變探針）（表1）。蛋白質(zhì)C 寡核苷酸探針（顯示為單鏈） 如下： 5＇-ctggtcctgagctgaGAAGTTTCagacaacagcattt-3＇。EMSA 使用EMSA 試劑盒（20148，Thermo Fisher Scientific）操作，方法參照文獻(xiàn)進(jìn)行［22］。用鏈霉親和素-辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物和化學(xué)發(fā)光底物檢測(cè)生物素標(biāo)記的DNA。超遷移實(shí)驗(yàn)加用抗HSF1 抗體（ab2923，Abcam）2 μl 加入到反應(yīng)體系中。

1.14 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

bEnd.3 細(xì)胞培養(yǎng)并鋪24 孔板，用500 ng 蛋白質(zhì)C 報(bào)告基因質(zhì)粒、500 ng mHSF1 質(zhì)?；蚩蛰d體質(zhì)粒pcDNA3.1 和20 ng 內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK 共轉(zhuǎn)染（L3000015，Invitrogen）48 h。使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（E1910，Promega）進(jìn)行操作，并使用SynergyHI 熒光酶標(biāo)儀（BioTek）分析檢測(cè)。數(shù)據(jù)以螢火蟲(chóng)熒光量與海腎熒光量的比值表示。

1.15 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

收集并整理數(shù)據(jù)，使用SPSS21.0 和GraphPad Prism7.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用ANOVA單因素方差分析，然后采用Bonferroni 事后檢驗(yàn)（Bonferroni post hoc test）。以P＜0.05 表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HSF1減輕膿毒癥小鼠的急性肺損傷

首先采用CLP 構(gòu)建小鼠膿毒癥模型，在不同的時(shí)間點(diǎn)觀察CLP后小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)變化。HE 染色結(jié)果表明，CLP 后，小鼠的肺組織出現(xiàn)了不同程度的損傷，如肺臟血管充血、肺泡腔及肺間質(zhì)水腫、肺泡隔增厚、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)等；通過(guò)半定量分析評(píng)估［23］膿毒癥小鼠的肺組織損傷程度，顯示肺組織損傷隨著時(shí)間的推移而逐漸增加（圖1a，b），而且，膿毒癥小鼠肺組織濕/干比增大（圖1c）。與HSF1+/+組相比，HSF1-/-組小鼠的肺損傷表現(xiàn)更明顯（圖1a-c）。結(jié)果表明，HSF1對(duì)膿毒癥所致肺組織損傷起到保護(hù)作用。

2.2 HSF1改善膿毒癥小鼠的凝血紊亂以及減少肺微血栓的形成

凝血功能的異常是膿毒癥的一個(gè)重要的病理生理學(xué)變化，為了了解膿毒癥小鼠的凝血功能，檢測(cè)了小鼠CLP 后凝血指標(biāo)的變化。活化部分凝血活酶 時(shí) 間 （activated partial thromboplastin time，APTT）和凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）是反映機(jī)體凝血功能的重要檢測(cè)指標(biāo)，分別反映內(nèi)源性凝血系統(tǒng)功能紊亂和外源性凝血系統(tǒng)功能紊亂。結(jié)果顯示，CLP 術(shù)后12 h 和24 h，小鼠APTT和PT均升高，HSF1-/-組明顯低于HSF1+/+組，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖2a，b）。結(jié)果表明，膿毒癥發(fā)生后，凝血系統(tǒng)被激活，與膿毒癥早期高凝狀態(tài)相符合，也說(shuō)明HSF1對(duì)凝血過(guò)程激活產(chǎn)生了有效的抑制作用。微血栓形成是膿毒癥后凝血活化的重要標(biāo)志，而纖維蛋白原是血栓形成的重要反應(yīng)底物，在凝血過(guò)程中網(wǎng)羅紅細(xì)胞、血小板等形成穩(wěn)定血栓結(jié)構(gòu)，微血栓的形成與纖維蛋白（原）的沉積有著密切聯(lián)系［24-25］。因此，觀察了膿毒癥小鼠肺組織中纖維蛋白（原）的沉積。組織免疫熒光結(jié)果顯示（圖2c，d），在CLP后12 h，即可觀察到小鼠肺組織中有纖維蛋白（原）沉積，24 h 時(shí)逐漸增多，HSF1-/-組小鼠相比HSF1+/+組纖維蛋白（原）沉積明顯增多，說(shuō)明膿毒癥小鼠的凝血系統(tǒng)被激活，大量的纖維蛋白（原）形成，從而促進(jìn)了微血栓的形成導(dǎo)致組織損傷。同時(shí)，也說(shuō)明HSF1能夠通過(guò)減少小鼠肺組織中纖維蛋白（原）的沉積改善膿毒癥肺損傷。

2.3 HSF1通過(guò)增強(qiáng)蛋白質(zhì)C的表達(dá)改善膿毒癥小鼠凝血功能障礙

本課題組前期運(yùn)用組織芯片已發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)C 在HSF1-/-組和HSF1+/+組內(nèi)毒素血癥小鼠模型中存在明顯差異［26］。分別收集HSF1-/-和HSF1+/+膿毒癥小鼠的血漿并提取肺組織中的mRNA和蛋白質(zhì)，檢測(cè)蛋白質(zhì)C的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CLP后血漿中蛋白質(zhì)C 水平升高，于術(shù)后12 h 達(dá)到高峰，而HSF1-/-小鼠血漿中的蛋白質(zhì)C 水平明顯低于HSF1+/+小鼠（圖3a）。膿毒癥造模后24 h，小鼠肺組織中蛋白質(zhì)C mRNA 和蛋白質(zhì)水平顯著降低，其中HSF-/-小鼠顯著低于HSF+/+小鼠（圖3b，c）。以上結(jié)果提示，膿毒癥發(fā)生后，凝血系統(tǒng)功能紊亂同時(shí)伴隨抗凝血系統(tǒng)的激活，蛋白質(zhì)C等抗凝血蛋白被釋放到血液中，參與了凝血平衡調(diào)控，HSF1可能通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)C表達(dá)從而抑制膿毒癥小鼠凝血系統(tǒng)活化。

Fig.2 Effects of HSF1 on the coagulatory function and pulmonary microthrombosis in septic mice

Fig.3 Effects of HSF1 on the gene expression and protein expression of activated protein C in plasma and lung tissue of septic mice

2.4 HSF1調(diào)控bEnd.3細(xì)胞中脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)C表達(dá)

為了探究HSF1 對(duì)蛋白質(zhì)C 表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制，采用HSF1 siRNA 或HSF1 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒干預(yù)LPS 刺激的血管內(nèi)皮bEnd.3 細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS 刺激bEnd.3 細(xì)胞后，蛋白質(zhì)C mRNA 和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平均顯著增加。當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染HSF1 siRNA，蛋白質(zhì)C mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)水平與對(duì)照組細(xì)胞比較有顯著降低（圖4a，b），而HSF1過(guò)表達(dá)使蛋白質(zhì)C mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（圖4c，d）。以上結(jié)果表明，LPS刺激顯著上調(diào)bEnd.3細(xì)胞中蛋白質(zhì)C 表達(dá)，轉(zhuǎn)染HSF1 siRNA 或HSF1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒分別抑制或促進(jìn)蛋白質(zhì)C的上調(diào)。

Fig.4 Effects of HSF1 on protein C mRNA and protein expression level in LPS-stimulated bEnd.3 cells

2.5 HSF1通過(guò)上調(diào)蛋白質(zhì)C轉(zhuǎn)錄保護(hù)膿毒癥小鼠凝血功能障礙

HSF1 作為轉(zhuǎn)錄因子，主要與靶基因的啟動(dòng)子HSE 元件結(jié)合調(diào)控它們的轉(zhuǎn)錄。利用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)在蛋白質(zhì)C 啟動(dòng)子區(qū)存在HSF1 結(jié)合元件（HSE）（圖5a，b），推測(cè)HSF1 可能通過(guò)與蛋白質(zhì)C 啟動(dòng)子區(qū)域的HSEs 結(jié)合，直接調(diào)控蛋白質(zhì)C 的轉(zhuǎn)錄。運(yùn)用EMSA 和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)探究HSF1 是否調(diào)控蛋白質(zhì)C 的轉(zhuǎn)錄。EMSA 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HSF1 可以直接結(jié)合蛋白質(zhì)C 啟動(dòng)子區(qū)HSE1（-584～-577 bp）（圖5c）。此外，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示，共轉(zhuǎn)染mHSF1質(zhì)粒和ProCwt 報(bào)告質(zhì)粒后，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。然而，共轉(zhuǎn)染mHSF1 質(zhì)粒和ProC-mut 報(bào)告質(zhì)粒后，熒光強(qiáng)度顯著降低，與EMSA的結(jié)果相一致（圖5d）。以上結(jié)果證實(shí)了HSF1在蛋白質(zhì)C的啟動(dòng)子區(qū)域與HSEs結(jié)合，從而直接上調(diào)蛋白質(zhì)C的轉(zhuǎn)錄。

Fig.5 HSF1 directly upregulates protein C transcription

3 討 論

膿毒癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病情進(jìn)展迅速，病死率高。全球每年住院的嚴(yán)重膿毒癥病例數(shù)接近1 900萬(wàn)，其中高達(dá)25%的嚴(yán)重膿毒癥患者和50%的膿毒性休克患者遭受死亡威脅［27］。凝血功能紊亂是膿毒癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要病理過(guò)程，加速膿毒癥及多器官功能的惡化［28-29］。當(dāng)膿毒癥發(fā)生時(shí)，凝血系統(tǒng)被激活，觸發(fā)凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，血小板消耗減少，微血栓形成，嚴(yán)重者引起DIC，患者可能出現(xiàn)明顯的血栓栓塞并發(fā)癥或臨床上表現(xiàn)不易察覺(jué)的微血管血栓形成，最終導(dǎo)致多器官功能衰竭［8-9］。本研究基于HSF1 敲除小鼠的CLP 模型，證實(shí)了HSF1 通過(guò)參與并抑制膿毒癥凝血系統(tǒng)激活，從而減輕小鼠膿毒癥所致肺損傷，并首次證實(shí)了HSF1通過(guò)直接上調(diào)蛋白質(zhì)C的轉(zhuǎn)錄對(duì)膿毒癥凝血功能紊亂起到部分保護(hù)作用。

本研究采用的是CLP 動(dòng)物模型，該模型較好地模擬人類的膿毒癥，已被認(rèn)為是研究膿毒癥的金標(biāo)準(zhǔn)模型［30］。在該模型的基礎(chǔ)上，首先探討了HSF1 在整體動(dòng)物水平對(duì)組織器官的保護(hù)作用，并觀察了HSF1是否參與了膿毒癥凝血過(guò)程。組織病理學(xué)結(jié)果顯示，HSF1 敲除小鼠在膿毒癥所致肺組織損傷中比野生型小鼠更明顯。凝血相關(guān)指標(biāo)APTT、PT以及肺組織中大量的纖維蛋白（原）沉積也反映了膿毒癥后，小鼠凝血系統(tǒng)激活，觸發(fā)了凝血活化過(guò)程，導(dǎo)致微血栓形成，從而加重了肺組織的缺血缺氧和肺功能損傷，且該病理變化在HSF1-/-組小鼠中比在HSF1+/+小鼠更明顯，這表明HSF1 參與了膿毒癥的凝血活化過(guò)程，而且HSF1能夠有效抑制膿毒癥的凝血系統(tǒng)活化從而對(duì)膿毒癥所致肺損傷起到保護(hù)作用。

蛋白質(zhì)C是一種維生素K依賴的血漿酶原，被凝血酶-凝血調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物激活后形成APC，在凝血的生理調(diào)節(jié)中起著重要作用［31］。蛋白質(zhì)C 能夠通過(guò)APC 和凝血酶激活的纖溶抑制劑（TAFI）來(lái)調(diào)節(jié)凝血和纖溶［32-33］。已有研究表明，在動(dòng)物模型中，蛋白質(zhì)C系統(tǒng)的損傷可顯著惡化DIC，增加發(fā)病率和死亡率，而恢復(fù)APC 的功能可預(yù)防凝血功能障礙，減輕器官功能障礙［34］。蛋白質(zhì)C 水平的降低和蛋白質(zhì)C系統(tǒng)的抑制與膿毒癥相關(guān)凝血功能障礙的發(fā)生密切相關(guān)［35］。然而，HSF1是否能通過(guò)調(diào)控蛋白質(zhì)C減輕膿毒癥的凝血功能障礙尚不清楚。因此，首先構(gòu)建了HSF1敲除小鼠的膿毒癥模型，通過(guò)結(jié)合前期芯片結(jié)果，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)C在內(nèi)毒素血癥的HSF1-/-和HSF1+/+小鼠之間存在差異表達(dá)。基于此，推測(cè)蛋白質(zhì)C 可能在HSF1 敲除小鼠的膿毒癥肺損傷過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，通過(guò)對(duì)膿毒癥小鼠血漿和肺組織進(jìn)行了ELISA、qRT-PCR和Western blot。結(jié)果顯示，膿毒癥后小鼠血漿中蛋白質(zhì)C 水平升高，于12 h 達(dá)峰值，隨后降低，且HSF1-/-組水平明顯低于HSF1+/+組。膿毒癥后，小鼠肺組織中蛋白質(zhì)C的蛋白質(zhì)和mRNA 水平均顯著下降，相比HSF1+/+組，HSF1-/-降低更明顯，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，LPS刺激增加了對(duì)照組bEnd.3細(xì)胞中蛋白質(zhì)C的蛋白質(zhì)和mRNA 的表達(dá)水平；而在細(xì)胞在轉(zhuǎn)染HSF1 siRNA 后，蛋白質(zhì)C 的蛋白質(zhì)和mRNA 的表達(dá)水平相比對(duì)照組明顯降低，在HSF1 過(guò)表達(dá)后，結(jié)果發(fā)生了相反的變化，與肺組織的實(shí)驗(yàn)相一致。既往研究表明，在膿毒癥中，凝血系統(tǒng)的激活導(dǎo)致活化蛋白質(zhì)C系統(tǒng)嚴(yán)重破壞，是由于其持續(xù)的消耗和蛋白質(zhì)降解［36］，致其水平顯著降低。在嚴(yán)重膿毒癥時(shí)，內(nèi)源性不活躍的前體蛋白質(zhì)C的水平由于其在肝臟產(chǎn)生減少以及酶降解作用（如中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶）而降低，以及顯著下調(diào)血栓調(diào)節(jié)蛋白和內(nèi)皮蛋白質(zhì)C受體，導(dǎo)致蛋白質(zhì)C活化為APC量受損明顯［37-38］。研究的結(jié)果與這些報(bào)告相一致。本研究表明，蛋白質(zhì)C在膿毒癥早期階段快速分泌以增加其抗凝功能，之后因快速消耗和蛋白質(zhì)降解大量減少，削弱了其對(duì)凝血過(guò)程的抑制作用從而加速了微血栓的形成。在此過(guò)程中，也發(fā)現(xiàn)HSF1對(duì)肺組織和細(xì)胞中蛋白質(zhì)C的表達(dá)變化具有調(diào)控作用從而抑制凝血系統(tǒng)激活從而減輕膿毒癥器官損傷。

HSF1 是機(jī)體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)對(duì)多種基因的調(diào)控影響了疾病的發(fā)病過(guò)程。在應(yīng)激狀態(tài)下，HSF1 被激活形成三聚體，然后移位到細(xì)胞核中，與基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定HSE 元件結(jié)合，啟動(dòng)熱休克（應(yīng)激）基因的轉(zhuǎn)錄激活［39-40］。此外，HSF1 也通過(guò)調(diào)節(jié)多種炎癥因子的表達(dá)，參與了炎癥反應(yīng)過(guò)程［15，41］。本研究中，分析了蛋白質(zhì)C 啟動(dòng)子區(qū)域的序列，并確定了在基因啟動(dòng)子區(qū)域含有HSEs，基于HSF1 的作用機(jī)制，推測(cè)HSF1 可能通過(guò)與蛋白質(zhì)C 啟動(dòng)子的HSEs 結(jié)合，直接調(diào)控蛋白質(zhì)C 的轉(zhuǎn)錄。為了驗(yàn)證上述假說(shuō)，分別進(jìn)行了EMSA和雙熒光素酶報(bào)告基因分析，EMSA結(jié)果顯示HSF1 可以與蛋白質(zhì)C 啟動(dòng)子區(qū)域的一個(gè)HSE（-584～-577 bp）結(jié)合。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步揭示了HSF1直接上調(diào)蛋白質(zhì)C的轉(zhuǎn)錄。以上結(jié)果一致證實(shí)HSF1 通過(guò)與蛋白質(zhì)C 啟動(dòng)子中HSEs 結(jié)合，上調(diào)蛋白質(zhì)C 的轉(zhuǎn)錄水平，抑制膿毒癥的凝血活化過(guò)程，從而減輕小鼠肺組織損傷。

4 結(jié) 論

本研究探討了HSF1 在膿毒癥發(fā)生發(fā)展中的作用，揭示了HSF1參與膿毒癥急性肺損傷的發(fā)生過(guò)程。HSF1 通過(guò)直接上調(diào)蛋白質(zhì)C 的轉(zhuǎn)錄抑制膿毒癥凝血活化過(guò)程從而減輕急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展。本研究不僅揭示了膿毒癥凝血功能障礙的發(fā)生機(jī)制，而且為膿毒癥中凝血功能障礙的干預(yù)提供了新的理論依據(jù)。

推薦編委熊煒