槲皮素抗非小細(xì)胞肺癌的靶點(diǎn)預(yù)測與驗(yàn)證

賀肖夢 鄭燕 徐煜彬

槲皮素是一種各類植物中廣泛存在的天然黃酮類有機(jī)化合物，化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1。槲皮素具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理學(xué)活性，在觸發(fā)與化學(xué)預(yù)防有關(guān)的多種細(xì)胞內(nèi)途徑（如凋亡、細(xì)胞周期、解毒、抗氧化復(fù)制、細(xì)胞侵襲、血管生成）中發(fā)揮多效作用[1-2]。研究顯示，槲皮素可以抑制NSCLC 腫瘤細(xì)胞株的增殖[3]，而槲皮素的抗NSCLC具體靶點(diǎn)尚不明確，仍需進(jìn)一步探討。本文采用系統(tǒng)的生物信息學(xué)研究方法，聯(lián)用多個數(shù)據(jù)庫分析并驗(yàn)證槲皮素抗NSCLC 的潛在靶點(diǎn)，為后續(xù)深入研究奠定基礎(chǔ)。

圖1 槲皮素的分子結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫及工具 槲皮素sdf 文件（PubChem CID:52803430）；TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）；Comparative Toxi -cogenomics Database（https://ctdbase.org/）；Swiss TargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）；Therapeutic Target Database（http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）；分子對接服務(wù)器（https://www.dockingserver.com/web/docking/449200/?）。

1.1.2 細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)藥物與試劑

NSCLC 細(xì)胞系A(chǔ)549、H1975 購自中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心，RPMI1640 培養(yǎng)基（22400089）購自Gibco 公司，胎牛血清（GNM12250）購自浙江吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。槲皮素（69022033）購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。CDK1抗體（ab201008）購自Abcam 公司，BCA 蛋白定量試劑盒（WLA004a）、β-actin 抗體（WL01372）、ECL 顯影試劑盒（WLA003a）等均購于沈陽萬類生物科技有限公司，CCK8 試劑盒（C0038）購自碧云天生物。

1.2 方法

1.2.1 關(guān)鍵藥理學(xué)和分子特性參數(shù) TCMSP 數(shù)據(jù)庫提供槲皮素體內(nèi)吸收、分布、代謝及排泄過程（ADME）和分子特性數(shù)據(jù)，有助于評價藥物成藥性。

1.2.2 藥物和疾病靶點(diǎn)預(yù)測 應(yīng)用CTD 對槲皮素進(jìn)行化學(xué)-蛋白/基因相互作用分析，Swiss Target Prediction 則基于藥物2D/3D 結(jié)構(gòu)，各自篩選數(shù)據(jù)庫中可能的藥物作用靶點(diǎn)。應(yīng)用TTD 預(yù)測NSCLC 疾病中的關(guān)鍵基因。

1.2.3 分子對接篩選靶點(diǎn) 在分子對接服務(wù)器上輸入候選靶點(diǎn)蛋白PDB ID，上傳槲皮素sdf 文件，模擬分子對接篩選作用靶點(diǎn)。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng) A549、H1975 細(xì)胞以含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基（1%雙抗），培養(yǎng)于37℃，5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱。相關(guān)實(shí)驗(yàn)均選用對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行。

1.2.5 Western blot 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證槲皮素對NSCLC 細(xì)胞CDK1 表達(dá)的影響 NSCLC 細(xì)胞系A(chǔ)549、H1975 以1×106個/孔接種于6 孔板，37℃，5%CO2條件下，培養(yǎng)24h。觀察細(xì)胞已貼壁且呈正常生長形態(tài)，即可進(jìn)行梯度濃度給藥，分別以槲皮素0、15、30μM 作用48h。提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法定量。以30μg/孔上樣量進(jìn)行電泳分離，分離后蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜，含5%脫脂奶粉的TBST 室溫封閉2h，TBST 清洗10min，重復(fù)3次。CDK1 的抗體液（1∶800）和β-actin 的抗體液（1∶1000）4℃搖床孵育過夜。TBST 洗膜，二抗（濃度分別為1∶1600 和1∶2000）室溫?fù)u床孵育2h，TBST 洗膜，ECL 發(fā)光顯影，凝膠成像儀記錄。

1.2.6 CCK8 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證槲皮素對NSCLC 細(xì)胞增殖的影響 NSCLC 細(xì)胞系A(chǔ)549、H1975 以8×103個/孔接種于96 孔板，37℃，5%CO2條件下，培養(yǎng)24h。觀察細(xì)胞已貼壁且呈正常生長形態(tài)，即可進(jìn)行梯度濃度給藥。槲皮素濃度分別為0、15、30μM，另設(shè)空白對照，每組3 個復(fù)孔，控制培養(yǎng)基體積200μL，繼續(xù)培養(yǎng)48h。每孔加入CCK8 試劑20μL，細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2h 后，酶標(biāo)儀測定各孔OD450 值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用Graphpad Prism 5 軟件處理分析數(shù)據(jù)并作圖，組間差異分析采用t-test，雙側(cè)檢驗(yàn)，95%置信區(qū)間。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素ADME 和分子特性參數(shù) 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得槲皮素體內(nèi)過程的ADME 和分子特性參數(shù)，見表1。

表1 槲皮素藥理參數(shù)

槲皮素符合TCMSP 平臺建議的藥物篩選標(biāo)準(zhǔn)（OB≥30%，DL≥0.18），且其口服生物利用率高（OB=46.43%，RBN＜10），HL≥8h 則表明其屬于慢速消除組，半衰期較長。Lipinski 5 原則是根據(jù)口服藥物總結(jié)出的經(jīng)驗(yàn)型規(guī)律，是篩選類藥分子的基本法則[4]。槲皮素的MW＜500Da，LogP＜5，Hdon=5，Hacc 和RBN 均小于10，表明槲皮素具有較好的藥代動力學(xué)性質(zhì)。以上數(shù)據(jù)提示槲皮素成藥性良好，具有一定的應(yīng)用前景。

2.2 槲皮素抗NSCLC 候選靶點(diǎn) 正確篩選靶向蛋白是藥物研發(fā)中的關(guān)鍵步驟。本研究利用CTD 數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)槲皮素潛在靶點(diǎn)共778 個；從Swiss Target－Prediction 篩選出前100 個潛在藥物靶點(diǎn)，兩個數(shù)據(jù)庫交集靶點(diǎn)共46 個。TTD 直接檢索NSCLC 疾病靶點(diǎn)基因共82 個。綜合考慮藥物和疾病靶點(diǎn)，共發(fā)現(xiàn)潛在目標(biāo)靶點(diǎn)9 個，見表2。

表2 槲皮素抗NSCLC 候選靶點(diǎn)

2.3 候選靶點(diǎn)分子對接篩選 分子對接結(jié)果顯示，槲皮素與CDK1、CDK2 和CDK6 的結(jié)合能均較低，其中與CDK1 達(dá)到-7.85kcal/mol，表明兩者對接結(jié)果較穩(wěn)定（見圖2）。槲皮素與CDK1 可能通過疏水殘基LEU135、ILE10、VAL18 和PHE80 等發(fā)生相互作用，進(jìn)而發(fā)揮藥理學(xué)效應(yīng)。

圖2 槲皮素與CDK1 分子對接示意圖

2.4 槲皮素對NSCLC 細(xì)胞CDK1 表達(dá)和細(xì)胞增殖的影響

在A549 細(xì)胞中，15μM 和30μM 槲皮素均能減少CDK1 的表達(dá)，而在H1975 中僅30μM 槲皮素能有效降低CDK1 水平（見圖3）。雙細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，體外實(shí)驗(yàn)中30μM 槲皮素能有效減少NSCLC 細(xì)胞中CDK1 的表達(dá)，可能進(jìn)一步影響腫瘤細(xì)胞周期，阻滯細(xì)胞惡性增殖。

圖3 槲皮素降低NSCLC 細(xì)胞CDK1 表達(dá)水平

進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，30μM 濃度的槲皮素對兩個NSCLC 細(xì)胞系的增殖抑制作用均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖4）。其中A549 細(xì)胞系更為敏感，兩個藥物濃度均能有效降低細(xì)胞增殖速率（P＜0.01）。槲皮素的細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其對CDK1 表達(dá)水平改變相一致，提示槲皮素可能通過降低細(xì)胞CDK1 表達(dá)水平發(fā)揮抗NSCLC 作用。

圖4 槲皮素抑制NSCLC 細(xì)胞增殖

3 討論

NSCLC 占臨床肺癌的近85%，是癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[6]。NSCLC 起病多隱匿，早期癥狀不明顯，導(dǎo)致疾病常在中晚期才被確診，使手術(shù)切除等早期治療手段無法及時實(shí)施，延誤了最佳治療時機(jī)[7]。此外，肺癌靶點(diǎn)治療藥物耐藥現(xiàn)象頻發(fā)，限制了肺癌靶向治療的臨床療效[8]。尋找新型靶點(diǎn)治療藥物已成為當(dāng)前肺癌治療藥物的研究重點(diǎn)。有研究指出，槲皮素對肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌和結(jié)腸癌等多種腫瘤均具有良好的抗癌活性[9]，其抗腫瘤作用具有良好的研究前景。

CDK1 是細(xì)胞周期調(diào)控中的關(guān)鍵性激酶，主要與細(xì)胞周期蛋白B（cyclinB）相互作用來驅(qū)動G2-M 轉(zhuǎn)換，也可與其他間期細(xì)胞周期蛋白結(jié)合（cyclin D1、E、A）調(diào)節(jié)G1 進(jìn)展和G1-S 轉(zhuǎn)換[10]。疾病進(jìn)展中，CDK1 的高表達(dá)誘導(dǎo)NSCLC 的細(xì)胞周期加速，抑制細(xì)胞凋亡，同時影響患者對順鉑的耐藥性[11]。研究表明，通過下調(diào)CDK1 表達(dá)能有效抑制NSCLC 細(xì)胞增殖和遷移，同時通過使細(xì)胞周期停滯在放射敏感的G2/M 期，有助增強(qiáng)放射治療療效[12]。本研究結(jié)果顯示，一定濃度槲皮素有效降低NSCLC 細(xì)胞CDK1 表達(dá)的同時能抑制細(xì)胞增殖，且兩者變化相一致。后續(xù)將構(gòu)建shRNA 進(jìn)一步研究槲皮素通過調(diào)節(jié)CDK1水平對細(xì)胞增殖、遷移能力的影響及其可能作用的下游通路，同時探討其對藥物耐藥和放射敏感性的有益作用。