竹節(jié)香附素A通過PI3K/Akt/mTOR信號通路對人宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖和凋亡的影響

張娟 李雪 蔣浩 黃曉萍

【摘要】目的 觀察竹節(jié)香附素A（RDA）對人宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并探討其作用機(jī)制。方法 分別使用0、5、10、20及40μmol/L的RDA干預(yù)HeLa細(xì)胞48 h，CCK-8實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞增殖率，計(jì)算半抑制濃度（IC50），確定藥物濃度。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，蛋白免疫印跡法檢測細(xì)胞中B細(xì)胞淋巴瘤2家族蛋白（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)x蛋白（Bax）、活化胱天蛋白酶-3（Cleaved-caspase-3）、磷酸化磷脂酰肌醇3激酶（p-PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）的蛋白表達(dá)水平。將HeLa細(xì)胞分為4組，即空白對照組、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）組、RDA組和聯(lián)合用藥組，檢測及比較各組細(xì)胞增殖率、凋亡率和p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白相對表達(dá)量。結(jié)果 隨著RDA濃度的增加，HeLa細(xì)胞的增殖率降低、凋亡率升高（P均< 0.05），Bax、Cleaved-caspase-3蛋白相對表達(dá)量升高（P均< 0.05），Bcl-2、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白相對表達(dá)量降低（P均< 0.05）;IGF-1激活PI3K/Akt/mTOR信號通路后，RDA仍然能抑制HeLa細(xì)胞增殖（P均< 0.05），降低p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白相對表達(dá)量（P均< 0.05）。結(jié)論 RDA可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路對人宮頸癌HeLa細(xì)胞產(chǎn)生抑制增殖與促進(jìn)凋亡的效果。

【關(guān)鍵詞】竹節(jié)香附素A;HeLa細(xì)胞;宮頸癌;細(xì)胞凋亡;PI3K/Akt/mTOR信號通路

【Abstract】Objective To investigate the effect of Raddeanin A （RDA） on the proliferation and apoptosis of cervical cancer HeLa cells and to explore the possible mechanism. Methods HeLa cells were cultured in vitro and treated with RDA at a concentration of 0， 5， 10， 20， and 40 μmol/L for 48 h. Cell proliferation rate was determined by CCK-8. The half-maximal inhibitory concentration （IC50） was calculated to determine the drug concentration. Flow cytometry was used to detect cell apoptosis， and western blot was employed to detect the expression levels of Bcl-2， Bax， Cleaved-caspase-3， p-PI3K， p-Akt， and p-mTOR proteins. Hela cells were divided into four groups： control group， IGF-1 group， RDA group and combined treatment group. The proliferation rate， apoptosis rate， relative expression levels of p-PI3K， p-Akt and p-mTOR proteins were detected and compared among different groups. Results The proliferation rate of HeLa cells was significantly declined， whereas the apoptosis rate was significantly elevated with the increasing concentration of RDA （both P < 0.05）， the relative expression levels of Bax and Cleaved-caspase-3 proteins were significantly up-regulated （both P < 0.05）， whereas those of Bcl-2， p-PI3K， p-Akt and p-mTOR proteins were significantly down-regulated （all P < 0.05）. After the activation of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway by IGF-1， RDA could still inhibit the proliferation of HeLa cells and down-regulate the relative expression levels of p-PI3K， p-Akt and p-mTOR proteins （all P < 0.05）. Conclusion RDA can inhibit the proliferation and promote the apoptosis of cervical cancer HeLa cells by suppressing the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.

【Key words】Raddeanin A; HeLa cell; Cervical cancer; Apoptosis; PI3K/Akt/mTOR signaling pathway

宮頸癌在全球女性常見惡性腫瘤中居第四位，在發(fā)展中國家常見惡性腫瘤中居第二位[1]。當(dāng)前的治療策略包括手術(shù)切除、化學(xué)治療和放射治療，但療效均有限[2]。如何預(yù)防與治療宮頸癌是全球醫(yī)學(xué)工作者們共同關(guān)注的課題。竹節(jié)香附素A（RDA）是從常用的傳統(tǒng)中草藥?？刑崛〉囊环N活躍三萜皂苷，通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖和血管生成產(chǎn)生抗腫瘤活性，同時(shí)能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，如大腸癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞[3]。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/ 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）信號通路是一條常見的細(xì)胞信號通路，由于mTOR能調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝活動，因此被作為抑制腫瘤細(xì)胞生長的靶點(diǎn)。有研究者發(fā)現(xiàn)，RDA可能通過激活p38MAPK通路和抑制mTOR活化誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡[4]。RDA在宮頸癌中未有相關(guān)報(bào)道。因此，本研究探究RDA對人宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并初步探討其可能的作用機(jī)制。

材料與方法

一、主要材料

人宮頸癌HeLa細(xì)胞，購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。RDA，純度≥98%，購自上海源葉生物科技有限公司，批號20190203;胰島素樣生長因子-1（IGF-1），純度≥98%，貨號PHG0078，購自美國Gibco公司。

二、主要試劑和儀器

高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清，均購自美國Gibco公司;B細(xì)胞淋巴瘤2家族蛋白（Bcl-2）抗體、β-actin抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）抗體、活化胱天蛋白酶-3（Cleaved-caspase-3）抗體、mTOR抗體、PI3K抗體、Akt抗體、羊抗兔二抗均購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司。

BA400Digital數(shù)碼三目攝像顯微鏡為麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司產(chǎn)品，Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件為美國Media Cybernetics公司產(chǎn)品，SpectraMAX Plus384酶標(biāo)儀為美谷分子儀器有限公司產(chǎn)品，Cytoflex流式細(xì)胞儀為美國貝克曼庫爾特公司產(chǎn)品。

三、方 法

1.細(xì)胞培養(yǎng)

將已經(jīng)凍存HeLa細(xì)胞株快速在37 ℃下解凍后，加入適量高糖DMEM完全培養(yǎng)基（10%胎牛血清+0.5%青鏈霉素雙抗），調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)72 h，中途更換完全培養(yǎng)基2～3次，然后進(jìn)行傳代備用。

2.實(shí)驗(yàn)分組

濃度篩選試驗(yàn)：將細(xì)胞分成5組（0、5、10、20和40 μmol/L），藥物干預(yù)48 h。機(jī)制檢測試驗(yàn)：將細(xì)胞分為空白對照組、IGF-1組（100 ng/L）、RDA組（20 μmol/L）與聯(lián)合用藥組（IGF-1 100 ng/L+RDA 20 μmol/L），各組藥物均干預(yù)48 h。

3. CCK-8法檢測細(xì)胞增殖率

待HeLa細(xì)胞培養(yǎng)至生長對數(shù)期，加入胰蛋白酶進(jìn)行消化，使用完全培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞密度調(diào)整為5×104/L，每孔取100 μL細(xì)胞懸液加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞完全生長貼壁后棄去培養(yǎng)基，使用磷酸鹽緩沖液清洗2次。將RDA溶于完全培養(yǎng)基，調(diào)整終濃度為0、5、10、20和40 μmol/L，每孔加入200 μL含RDA培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。藥物干預(yù)48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h，然后使用酶標(biāo)儀測定在450 nm波長下的吸光度值（A），以0 μmol/L濃度的吸光度為對照值，根據(jù)公式計(jì)算培養(yǎng)48 h的細(xì)胞增殖率，并計(jì)算半抑制濃度（IC50），每組3個復(fù)孔，結(jié)果取平均值。

細(xì)胞增殖率（%）=×100%

4.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

將處于生長對數(shù)期的HeLa細(xì)胞用完全培養(yǎng)基制成1×106/mL的細(xì)胞懸液，每孔取1 mL細(xì)胞懸液加入6孔板中，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h使細(xì)胞生長貼壁，分別按照前述步驟分組培養(yǎng)HeLa細(xì)胞48 h，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。每組3個復(fù)孔，凋亡結(jié)果取平均值。

5.蛋白免疫印跡法檢測各蛋白表達(dá)水平

分別按照前述步驟分組培養(yǎng)HeLa細(xì)胞48 h，然后收集細(xì)胞行蛋白免疫印跡法檢測細(xì)胞中Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase-3、磷酸化-PI3K（p-PI3K）、p-Akt、p-mTOR蛋白的表達(dá)量，并計(jì)算蛋白相對表達(dá)量。每組3個復(fù)孔，蛋白表達(dá)結(jié)果取平均值。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 25.0分析數(shù)據(jù)。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)使用 表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，多重比較采用Dunnett-t檢驗(yàn);析因設(shè)計(jì)資料組間比較采用析因設(shè)計(jì)方差分析，交互效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)采用LSD-t檢驗(yàn)分析單獨(dú)效應(yīng)，P < 0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、不同濃度RDA對HeLa細(xì)胞凋亡的影響

CCK-8結(jié)果顯示，與0 μmol/L組相比，5 μmol/L 濃度以上RDA對HeLa細(xì)胞有抑制作用（P < 0.05），抑制程度與RDA濃度呈正相關(guān)，IC50為20.90 μmol/L;細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，5 μmol/L濃度以上RDA對HeLa有促進(jìn)凋亡的作用（P

二、不同濃度RDA對HeLa細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

蛋白免疫印跡檢測顯示，與0 μmol/L組相比，20、40 μmol/L組中Bax和Cleaved-caspase-3的表達(dá)量均升高，Bcl-2的表達(dá)降低（P均< 0.05），0、5 μmol/L RDA對HeLa中Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase-3凋亡蛋白表達(dá)無明顯影響，10 μmol/L RDA對Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)無明顯影響（P均> 0.05），見圖2、表2。

三、RDA對HeLa細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR信號通路的影響

蛋白免疫印跡檢測顯示，與0 μmol/L組相比，10、20和40 μmol/L組3種蛋白磷酸化表達(dá)量均降低（P均< 0.05）。5 μmol/L組3種蛋白磷酸化表達(dá)量有降低趨勢，但p-Akt和p-mTOR與0 μmol/L組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05），見圖2、表3。綜合前述結(jié)果，采用40 μmol/L的RDA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

四、激活PI3K/Akt/mTOR通路后RDA對HeLa細(xì)胞的影響

檢測與析因分析結(jié)果顯示，IGF-1和RDA對細(xì)胞增殖率與凋亡率的主效應(yīng)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩者的交互作用對細(xì)胞增殖率（F = 11.028，P = 0.006）與凋亡率（F = 48.494，P < 0.001）有影響;估算邊際平均值后發(fā)現(xiàn)RDA對細(xì)胞增殖率與凋亡率影響明顯，見表4。

與空白對照組相比，IGF-1組細(xì)胞增殖率與凋亡率無明顯變化（P > 0.05），RDA組與聯(lián)合用藥組細(xì)胞的增殖率下降，凋亡率上升（P < 0.05）;與IGF-1組相比，RDA組與聯(lián)合用藥組細(xì)胞的增殖率下降，凋亡率上升（P < 0.05），RDA組抑制Hela細(xì)胞增殖與促進(jìn)凋亡的效果比聯(lián)合用藥組更明顯（P < 0.05），見表5、圖3。

五、激活PI3K/Akt/mTOR信號通路后RDA對HeLa細(xì)胞中該信號通路蛋白表達(dá)的影響

析因分析結(jié)果顯示，IGF-1和RDA對p-PI3K（F = 72.804，P < 0.001;F = 23.819，P = 0.001）、 p-Akt（F = 36.510，P < 0.001;F = 5.317，P < 0.001）、p-mTOR（F = 45.504，P < 0.001;F = 11.982，P = 0.009）的主效應(yīng)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩者的交互效應(yīng)對p-PI3K、p-Akt、p-mTOR無影響（F = 0.272，P = 0.616;F = 1.291，P = 0.289;F = 0.013，P = 0.912），估算平均邊際值后發(fā)現(xiàn)RDA對p-PI3K、p-Akt、p-mTOR影響明顯，見表6。故主要解析各因素的主效應(yīng)作用，其中IGF-1與RDA對HeLa細(xì)胞的PI3K/Akt/mTOR信號通路影響均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，IGF-1對PI3K/Akt/mTOR信號通路為激活效應(yīng)，而RDA對PI3K/Akt/mTOR信號通路表現(xiàn)抑制效應(yīng)，見表7、圖4。

討論

研究表明，RDA可在體外抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長，如肝癌、乳腺癌、胃癌及卵巢癌等，說明RDA有著強(qiáng)大的抗腫瘤活性[5]。由此推測RDA對宮頸癌可能有一定的抗癌作用。本研究采用人宮頸癌HeLa細(xì)胞進(jìn)行體外試驗(yàn)，從細(xì)胞凋亡率和PI3K/Akt/mTOR信號通路等方面探討RDA對人宮頸癌細(xì)胞的抑制作用。研究結(jié)果顯示，5～40 μmol/L的RDA對HeLa細(xì)胞均有抑制作用，且抑制效果與RDA濃度呈正相關(guān)，初步顯示RDA對HeLa細(xì)胞具有明顯的抑制效果。

Caspase是一組在細(xì)胞凋亡過程起關(guān)鍵作用的酶，而Bcl家族在抑制Bcl-2或促進(jìn)Bax導(dǎo)致細(xì)胞死亡的途徑中也起著關(guān)鍵作用[6-7]。本研究顯示，5～40 μmol/L的RDA能對HeLa細(xì)胞產(chǎn)生促凋亡作用，且作用隨RDA濃度的升高而增強(qiáng)，同時(shí)，20～40 μmol/L的RDA能使HeLa細(xì)胞中的Bcl-2蛋白表達(dá)降低，Bax和Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)升高，這說明RDA不僅對HeLa細(xì)胞既有抑制增殖作用，也有促進(jìn)凋亡作用。

PI3K/Akt/mTOR信號通路廣泛存在于多種細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，是目前惡性腫瘤研究的熱點(diǎn)之一[8]。該通路在腫瘤細(xì)胞的能量代謝、細(xì)胞增殖、侵襲能力、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期等生理活動中發(fā)揮重要作用[9-10]。PI3K/Akt/mTOR信號通路在許多人類惡性腫瘤（包括宮頸癌）中異常激活[11]。p-Akt和p-mTOR蛋白在50%～53%的宮頸腺癌中均有表達(dá)，說明這2種蛋白磷酸化過表達(dá)可能是導(dǎo)致宮頸癌的原因之一[12-13]。本研究顯示，使用RDA干預(yù)HeLa細(xì)胞后，p-PI3K、p-Akt和p-mTOR這3種蛋白的相對表達(dá)量均降低，且抑制作用隨RDA濃度的升高而增強(qiáng)。由此說明，RDA能通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路，降低HeLa細(xì)胞增殖率。

IGF-1通過活化Akt激活下游信號通路，是胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）和PI3K/Akt通路的強(qiáng)效刺激因子[14-15]。有研究者發(fā)現(xiàn)，IGF-1促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞的有絲分裂、轉(zhuǎn)移和抗凋亡，有助于腫瘤細(xì)胞的維持和促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[16]。因此本研究探討在PI3K/Akt/mTOR信號通路激活的環(huán)境下，RDA是否能發(fā)揮同樣的抗癌效果。結(jié)果顯示，IGF-1和RDA存在交互作用，RDA的單獨(dú)效應(yīng)隨IGF-1變化，說明RDA可能對IGF-1誘導(dǎo)細(xì)胞增殖與抑制細(xì)胞凋亡的效果有抑制作用。與IGF-1組相比，聯(lián)合用藥組能明顯降低細(xì)胞增殖率且提高細(xì)胞凋亡率，但效果不如單用RDA，說明在IGF-1的干預(yù)下，RDA仍然能發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞生存的效果。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1和RDA的交互作用并沒有對p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白相對表達(dá)量產(chǎn)生影響，說明IGF-1此時(shí)的作用只是單純的PI3K/Akt/mTOR信號通路激動劑，并未對RDA產(chǎn)生直接影響。與空白對照組相比，IGF-1組的p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白相對表達(dá)量升高，說明IGF-1激活了HeLa細(xì)胞中的PI3K/Akt/mTOR信號通路。而RDA能降低IGF-1干預(yù)后p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白相對表達(dá)量，說明無論P(yáng)I3K/Akt/mTOR信號通路是處于正常狀態(tài)還是異常激活狀態(tài)，RDA都能抑制HeLa細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR信號通路中PI3K、Akt和mTOR蛋白的磷酸化，從而誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞死亡，阻止腫瘤細(xì)胞的增殖。

綜上所述，RDA能對人宮頸癌HeLa細(xì)胞產(chǎn)生抑制增殖與促進(jìn)凋亡的作用，其作用機(jī)制是通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，降低p-PI3K、? p-Akt和p-mTOR蛋白的表達(dá)，產(chǎn)生抗癌的效果。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2021-05-10）

（本文編輯：林燕薇）