Toll樣受體9在呼吸系統(tǒng)疾病中的作用機制研究進展

燕江雪 曹囡囡 丁霞 倪倩

【摘要】Toll樣受體9（TLR9）是TLR家族中的一員，在機體天然免疫和適應性免疫活化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。TLR9與哮喘、肺癌、肺炎等多種常見呼吸系統(tǒng)疾病有密切關(guān)聯(lián)，影響疾病的轉(zhuǎn)歸與預后。該文結(jié)合近年相關(guān)研究，綜述TLR9在呼吸系統(tǒng)疾病中的作用及其相關(guān)機制。

【關(guān)鍵詞】Toll樣受體9;哮喘;肺癌;肺炎

【Abstract】Toll-like receptor 9（TLR9）is a member of the TLR family， which plays a key role in the activation of innate and adaptive immunity. TLR9 is closely associated with various common respiratory diseases， such as asthma， lung cancer and pneumonia， and affects clinical outcome and prognosis. In this article， the roles and related mechanisms of TLR9 in respiratory diseases were reviewed based on relevant studies in recent years.

【Key words】Toll-like receptor 9; Asthma; Lung cancer; Pneumonia

Toll樣受體（TLR）是一類模式識別受體，與配體結(jié)合后，啟動胞內(nèi)免疫信號蛋白的級聯(lián)反應、激活免疫應答信號通路，在激活宿主天然免疫和適應性免疫反應、增強免疫防御的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。人類TLR共包含10個功能性受體（TLR1～TLR10），TLR9可在識別配體未甲基化的CpG二核苷酸后，啟動下游免疫信號通路，激活免疫反應，從而在呼吸系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用[1-4]。本文就TLR9在呼吸系統(tǒng)常見疾病中的作用及其機制進行綜述。

一、TLR9

1. TLR9在細胞內(nèi)的運輸途徑及信號通路

TLR9位于靜息細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，需要內(nèi)體穿梭以啟動信號轉(zhuǎn)導。不協(xié)調(diào)的93同系物B1（UNC93B1）是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白，可調(diào)控TLR9包裝為外殼蛋白復合物Ⅱ（COPⅡ）囊泡，從而使TLR9轉(zhuǎn)運至高爾基體。靜息狀態(tài)下，TLR9與UNC93B1共同定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，TLR9通過COPⅡ囊泡，沿分泌途徑到達高爾基體、質(zhì)膜;而TLR9可與質(zhì)膜上的激活蛋白2（AP-2）以網(wǎng)格蛋白依賴的方式內(nèi)吞進入內(nèi)體溶酶體系統(tǒng)，在內(nèi)體酸化后，組織蛋白酶和肽鏈內(nèi)切酶水解TLR9。同時，TLR9的配體CpG也以網(wǎng)格蛋白依賴的方式內(nèi)吞后進入內(nèi)體溶酶體系統(tǒng)。當TLR9及其配體進入內(nèi)體溶酶體系統(tǒng)后，啟動信號轉(zhuǎn)導[5]。

TLR9信號轉(zhuǎn)導通路募集的參與分子取決于細胞類型。在巨噬細胞、漿細胞樣樹突狀細胞（pDC）和經(jīng)典DC中，活化的TLR9通過募集髓樣分化因子88（MyD88），激活I(lǐng)L-1受體相關(guān)激酶4（IRAK 4）、IRAK1和IRAK2等信號分子，繼而激活核因子-κB（NF-κB）的信號通路，合成促炎細胞因子，如TNF-α、IL-6和IL-12等[1， 5]。但在pDC上，TLR9主要啟動Ⅰ型IFN（IFN-Ⅰ）合成途徑，MyD88通過引導IFN調(diào)節(jié)因子7（IRF7）向細胞核易位，進而促進細胞合成IFN-I[2- 3， 5]。

2. TLR9的配體

未甲基化的CpG二核苷酸是TLR9的配體，存在于天然的細菌、病毒及線粒體的DNA中。未甲基化的CpG二核苷酸激活TLR9及下游信號，可誘導強烈的1型輔助性T淋巴細胞（Th1）為主的免疫反應。Th1產(chǎn)生細胞因子如IFN-γ、 IL-12等，繼續(xù)活化自然殺傷（NK）細胞、增強CD8+T淋巴細胞的免疫應答。同時，這一級聯(lián)免疫反應可抑制Th2介導的免疫反應，減少細胞因子如IL-4、IL-5等的生成[6-7]。CpG寡脫氧核苷酸（CpG ODN）是人工合成的含有非甲基化CpG的ODN，有學者發(fā)現(xiàn)CpG ODN可通過TLR9/MyD88信號通路促進IL-10等產(chǎn)生，從而抑制過敏性氣道炎癥反應。因此，TLR9的配體可作為變應性哮喘中病理性Th2免疫應答反應的調(diào)節(jié)劑[6]。另外，CpG ODN聯(lián)合免疫靶點阻斷療法已用于腫瘤免疫治療的研究[8]。

二、TLR9與呼吸系統(tǒng)疾病

研究表明，TLR9與多種呼吸系統(tǒng)疾病，如哮喘、肺癌和肺炎等疾病發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)聯(lián)，并影響疾病的轉(zhuǎn)歸與預后[2， 6， 8-9]。

1. TLR9與哮喘

哮喘是慢性氣道免疫炎癥性疾病，其病理機制主要為：Th2生成的細胞因子（如IL-4、IL-5、IL-9和IL-13）增多，Th1生成的細胞因子（IL-2）減少，B淋巴細胞產(chǎn)生的IgE增多，募集肥大細胞、嗜酸性粒細胞等，促進哮喘的氣道炎癥[10-11]。

TLR9/IL-2軸通過抑制IL-17A的過度生成而加重哮喘。IL-2是Th17生成IL-17A的負調(diào)控因子。在屋塵螨誘導的過敏性哮喘動物模型中，TLR9缺失小鼠與野生型（WT）小鼠相比，嗜酸性粒細胞數(shù)量減少，氣道高反應性降低;同時Th2細胞因子IL-4、IL-5和IL-13的產(chǎn)生受到抑制，Th1生成的IL-2減少，導致Th17生成的IL-17A增多，而過量的IL-17A可抑制過敏性氣道炎癥反應，提示TLR9/IL-2軸通過抑制IL-17A的過量產(chǎn)生，從而促進氣道高反應性和氣道炎癥。另外，NaR9是TLR9抑制抗體，可以抑制屋塵螨誘導的氣道高反應性和Th2型炎癥反應;使用NaR9阻斷TLR9，IL-17A的生成增多，這與TLR9缺失小鼠表現(xiàn)類似，結(jié)合以上研究結(jié)果，證明在屋塵螨誘導的過敏性哮喘中，NaR9通過抑制TLR9/IL-2軸，促進IL-17A的過量生成，從而抑制過敏性哮喘的炎癥反應[12]。

c-Jun氨基末端激酶（JNK）/TLR9信號通路通過抑制褪黑素生物合成，介導過敏性氣道炎癥。SP600125是JNK的特異性抑制劑，可減輕卵清蛋白（OVA）誘導的WT小鼠過敏性氣道炎癥。有學者發(fā)現(xiàn)，由OVA誘導構(gòu)建的過敏性氣道疾病動物模型中，TLR9和磷酸化JNK的表達水平明顯升高。TLR9缺失可有效抑制氣道炎癥，使肺部炎癥細胞的募集和黏液分泌明顯減少，血清中特異性的IgE表達水平降低，支氣管肺泡灌洗液內(nèi)的炎癥因子，如IL-4、IL-13及IFN-γ表達水平明顯減少。TLR9缺失對JNK的磷酸化表達水平?jīng)]有影響，但通過SP600125抑制JNK后TLR9的表達水平明顯降低，提示JNK作為TLR9信號通路的上游分子，參與誘導過敏性氣道炎癥[13]。褪黑素屬于胺類激素，具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)功能，由色氨酸合成，其合成途徑涉及2種關(guān)鍵酶，分別是N-乙?；D(zhuǎn)移酶和羥基吲哚-氧-甲基轉(zhuǎn)移酶（HIOMT）。研究表明，哮喘患者的唾液或血清褪黑素表達水平明顯低于健康對照組，外源性和內(nèi)源性褪黑素均可抑制氣道炎癥。當OVA刺激小鼠后，肺組織中HIOMT蛋白表達減少，在支氣管肺泡灌洗液和血清中，褪黑素的表達水平降低;但在TLR9缺失后，這種作用消除。SP600125升高了OVA誘導小鼠模型中HIOMT蛋白表達和褪黑素表達水平，但這種影響在TLR9缺失后消除。以上結(jié)果表明OVA刺激可激活JNK/TLR9信號通路，該信號通路可作為負信號調(diào)節(jié)HIOMT蛋白的表達和褪黑素的產(chǎn)生，從而誘導過敏性氣道炎癥反應[13-14]。也有研究報道，MyD88缺失小鼠在OVA誘導下產(chǎn)生氣道炎癥，提示OVA通過激活非MyD88依賴性的TLR9信號通路，導致氣道炎癥[13]。

但在多種OVA誘導的過敏性疾病的動物模型中，CpG ODN可抑制過敏性氣道炎癥反應，這是由于純化的CpG ODN可通過TLR9/MyD88信號通路，促進IL-10等產(chǎn)生，從而改善氣道炎癥[14-15]。目前TLR9作為過敏性氣道疾病新的治療靶點仍存在爭議，因此需要更多的研究進一步探索TLR9在哮喘等過敏性疾病中的機制。

2. TLR9與肺癌

肺癌是人體常見腫瘤之一。炎癥是腫瘤的標志性反應之一，在腫瘤微環(huán)境中存在的TLR在識別特異性配體后激活，并誘導宿主產(chǎn)生適應性免疫反應。TLR就像一把雙刃劍，一方面識別腫瘤特異性抗原并激活天然免疫反應，另一方面通過誘導持續(xù)的適應性反應來促進潛伏的慢性炎癥，從而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。目前已發(fā)現(xiàn)TLR9在肺癌進展中發(fā)揮了重要作用，但其相關(guān)機制有待進一步闡明[2]。

有研究者通過體外實驗發(fā)現(xiàn)肺腺癌細胞中激活的TLR9可誘導神經(jīng)酰胺酶活化，導致1磷酸鞘氨醇（S1P）形成甚至過表達，從而介導NF-κB通路釋放TNF-α等，表明TLR9/S1P軸依賴性的炎癥信號通路通過誘導有利于S1P的神經(jīng)酰胺/S1P的失衡，在炎性呼吸疾病的惡化中發(fā)揮重要作用[16]。

程序性死亡受體1（PD-1）及其配體作為靶點的免疫療法，是臨床上針對非小細胞肺癌等惡性腫瘤的一個重要的治療方案。但當抗PD-1抗體單獨用于治療非小細胞肺癌時，僅對約20%患者有效，這表明需要進一步聯(lián)合治療[9， 17]。Perry等[4]在肺腺癌和肺鱗癌的小鼠原位癌轉(zhuǎn)移模型中，以非潤濕模板粒子復制技術(shù)生產(chǎn)的納米顆粒作為載體，經(jīng)口氣管滴注，將CpG遞送到小鼠肺臟中，明顯促進了腫瘤的消退，并限制了與可溶性CpG相關(guān)的全身毒性反應，證明局部CpG可以協(xié)調(diào)天然免疫和獲得性免疫反應的活化，加強機體抗腫瘤免疫反應。研究表明，吸入霧化TLR9激動劑聯(lián)合抗PD-1治療可增強機體免疫細胞對肺內(nèi)、肺外腫瘤的殺傷作用，這與腫瘤微環(huán)境中功能性效應CD8+T淋巴細胞的增多有關(guān)[9]。IMO-2055是一種CpG ODN，屬于TLR9激動劑，目前已在Ⅰ期和Ⅱ期試驗中證實其可聯(lián)合靶向免疫藥物治療肺癌。一項晚期非小細胞肺癌的I期臨床試驗證明，IMO-2055與厄洛替尼和貝伐珠單抗聯(lián)合治療具有良好的耐受性和抗腫瘤活性[8]。以上研究提示，TLR9能否成為肺癌免疫治療的新靶點仍需進一步的探索研究。

3. TLR9與肺炎

3.1 TLR9與非感染性肺炎

TLR9可加重矽肺小鼠的肺部炎癥和纖維化的程度。在矽肺動物模型中，WT小鼠暴露于二氧化硅（SiO2）顆粒后出現(xiàn)肺部炎癥、形成肉芽腫和纖維化。暴露于SiO2顆粒的TLR9缺失小鼠的肺部炎癥和纖維化程度相對較低，且肺功能得到改善。接觸SiO2顆粒會導致線粒體損傷、DNA釋放和線粒體自噬，釋放的游離線粒體DNA （mtDNA）可激活TLR9，進而加重肺部炎癥反應。以上證據(jù)表明，TLR9與矽肺的疾病進展密切相關(guān)[18]。

游離mtDNA是線粒體損傷相關(guān)分子模式（DAMP）的主要成分，在病理狀態(tài)下釋放增加，并參與各種炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展。游離mtDNA含有大量未甲基化的CpG二核苷酸，通過TLR9激發(fā)促炎信號，導致嚴重的炎癥反應[7， 19]。

紅細胞內(nèi)的TLR9可清除游離mtDNA，從而減輕肺損傷[19]。Hotz等[19]通過研究發(fā)現(xiàn)紅細胞可表達TLR9，DNA與紅細胞的結(jié)合是由TLR9介導的，紅細胞可從循環(huán)中清除CpG-DNA，紅細胞的DNA清除功能缺陷可增強CpG-DNA介導的肺損傷，表明紅細胞上TLR9介導的游離mtDNA清除對減輕肺損傷是必要的。

3.2 TLR9與感染性肺炎

TLR9可增強流行性感冒（流感）患者繼發(fā)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）感染的易感性。流感病毒屬于單鏈RNA病毒。人流感病毒分為甲型、乙型及丙型。流感可引起季節(jié)性流行，并可繼發(fā)細菌性肺炎，如肺炎鏈球菌肺炎和金黃色葡萄球菌肺炎，增加流感患者的病死率[20-21]。流感病毒感染可誘導IFN-Ⅰ介導的免疫信號，抑制中性粒細胞的募集及IL-17的免疫反應，從而導致宿主繼發(fā)細菌感染的易感性增加。在流感病毒感染繼發(fā)細菌感染后，機體代償性募集中性粒細胞，提高宿主對細菌感染的抵抗力[20]。甲型流感病毒（IAV）感染可增加人單核細胞和DC中TLR9的表達水平。與WT小鼠相比，TLR9缺失小鼠對IAV或MRSA感染的易感性未見差異;但在IAV繼發(fā)MRSA感染后，TLR9缺失小鼠存活率提高，肺部細菌清除能力增強，而病毒載量未見差異。另外，在IAV繼發(fā)肺炎鏈球菌感染后，細菌清除作用沒有改善。以上結(jié)果表明，TLR9可增強流感繼發(fā)MRSA的易感性，但對繼發(fā)性肺炎鏈球菌肺炎的易感性無影響[20-21]。

在鮑曼不動桿菌肺炎的小鼠模型中，TLR9缺失小鼠的肺部細菌負荷明顯增加，肺外細菌播散增多，肺損傷加重，證明TLR9介導的信號通路對于宿主防御鮑曼不動桿菌具有重要意義[22]。在肺炎克雷伯菌和肺炎鏈球菌感染的動物模型中，TLR9缺失小鼠的病死率升高，細菌負荷增多[23-24]。與WT小鼠相比，TLR9缺失小鼠更易感染隱球菌，且IFN-γ和IL-17的生成減少，感染后的肺損傷加重，病死率升高，證明在宿主抵御隱球菌感染的過程中TLR9發(fā)揮了重要作用[25]。以上研究均表明，TLR9與肺部炎癥的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，但TLR9能否作為治療靶點尚不能下定論，還需要更深入的研究探討。

三、結(jié) 論

TLR9在免疫細胞和非免疫細胞的內(nèi)體膜上均有大量表達，其與配體結(jié)合活化后，通過激活天然和適應性免疫系統(tǒng)，在哮喘、肺癌和肺炎等呼吸系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用。TLR9的配體有可能是預防及治療呼吸系統(tǒng)上述疾病的潛在治療靶點[1-2， 6， 8]。目前需要更多的研究來深入了解TLR9與呼吸系統(tǒng)疾病的相關(guān)致病機制，為呼吸系統(tǒng)疾病的治療開拓新思路。

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（收稿日期：2022-01-26）

（本文編輯：林燕薇）