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    玫瑰花復(fù)合煎劑的毒性及免疫活性研究

    2022-04-23 22:22:48鄭小娟
    醫(yī)學(xué)食療與健康 2022年3期
    關(guān)鍵詞:急性毒性免疫黃精

    鄭小娟

    [摘要]目的:玫瑰花復(fù)合煎劑的急性毒性反應(yīng)及對小鼠免疫活性的研究。方法:采用最大耐受劑量法,以15000.mg/(kg·BW)劑量玫瑰花復(fù)合煎劑給予小鼠灌胃,觀察動物在一周內(nèi)的活動及中毒情況,考察小鼠是否有死亡現(xiàn)象,并進行大體解剖觀察病理改變;在加S9與不加S9混合液的條件下進行Ames試驗,以2.5、5.0、.10.0.g/(kg·BW)玫瑰花復(fù)合煎劑灌胃小鼠,進行小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗、小鼠精子畸形試驗。保健功能試驗:以300、600、1200.mg/(kg·BW)劑量組連續(xù)灌胃小鼠30天,另設(shè)玫瑰花組和蒸餾水陰性對照組,測定臟器/體重比值,小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(耳腫脹法),小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)(Jerne改良玻片法)以及NK細(xì)胞活性(乳酸脫氫酶測定法),以考察其增強免疫力的作用。結(jié)果:急性經(jīng)口毒性實驗中,小鼠一般表現(xiàn)和行為均未見異常且無死亡;三項遺傳試驗結(jié)果均為陰性,未見遺傳毒性;增強免疫力實驗中,與陰性對照組相比,玫瑰花復(fù)合煎劑300、600、1200.mg/(kg·BW)各劑量組的小鼠左右耳片重量差值、溶血空斑數(shù)有顯著性差異(P<0.05);600、.1200.mg/(kg·BW)劑量組小鼠NK細(xì)胞活性均有顯著性差異(P<0.05);玫瑰花組小鼠左右耳片重量差值、溶血空斑數(shù)與陰性對照組相比均有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)論:玫瑰花復(fù)合煎劑無明顯的急性毒性反應(yīng),屬無毒級,且無遺傳毒性;玫瑰花與黃精組成配伍聯(lián)合應(yīng)用其增強免疫功能較玫瑰花單方更加顯著。

    [關(guān)鍵詞]玫瑰花;黃精;急性毒性;遺傳毒性;免疫

    [中圖分類號]R392.11.

    [文獻標(biāo)識碼]A.

    [文章編號]2096-5249(2022)03-0184-03

    玫瑰花是薔薇科植物玫瑰的干燥花蕾[1],《本草綱目拾遺》載:“玫瑰花活血、行血、健脾降火、理氣調(diào)經(jīng)、滋補養(yǎng)顏”。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為,玫瑰花甘、微苦,具有行氣解郁、止痛和血及活血散瘀等功效,常用于肝胃氣痛、月經(jīng)不調(diào),跌撲傷痛等,常被用來當(dāng)作茶飲。

    黃精為百合科黃精屬(Liliaceae)的干燥根莖,主要包括滇黃精Polygonatum kingianum Coll.Et Hemsl、黃精Polygonatum sibiricum Red或多花黃精Polygonatum cyrtonema Hua[2]。主要化學(xué)成分有多糖、皂苷、蒽醌等[3]。藥典記載,黃精性平、味甘,具有補氣養(yǎng)陰、益腎健脾的功效。李時珍引《神仙草芝經(jīng)》云:“黃精寬中益氣,使五臟調(diào)和,肌肉充盈,骨髓堅強,其力倍增,多年不老,顏色明顯,發(fā)白更黑,齒落更生”。我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為,黃精可長期用于治療脾胃虛弱、精血不足、腎虛虧損、倦乏無力等,自古以來就被認(rèn)為是補益類中藥中的上品[4]。

    玫瑰花在免疫方面的試驗研究較少,本研究主要探討以玫瑰花及玫瑰花配伍黃精后對小鼠免疫指標(biāo)的影響,同時對其毒理學(xué)試驗進行評價,為臨床應(yīng)用提供一定的實驗基礎(chǔ)。

    1材料與對象

    1.1實驗動物

    昆明種小鼠420只,選用蘇州大學(xué)昭衍新藥研究中心培育的SPF級小鼠(合格證編號201900963)。雌雄各半,體重18~22g。

    1.2受試物與試劑

    玫瑰花組:取玫瑰花300g,加入12倍量水提取2次,每次2h,濾過,合并2次提取液減壓濃縮至1g/mL。

    玫瑰花復(fù)合煎劑:取玫瑰花、黃精各300g分別加入12倍量水提取2次,每次2h,濾過,合并2次提取液減壓濃縮至1g/mL。實驗時用蒸餾水配制,冷藏保存。

    1.3主要儀器和試劑

    100μL微量注射器、電子分析天平、手術(shù)器械、723分光光度儀、RPMI1640玻片架、顯微鏡、離心機、二氧化碳培養(yǎng)箱、SRBC、Hank’s液、DNFB、丙酮、乳酸脫氫酶、恒溫水浴等。

    1.4實驗方法

    急性經(jīng)口毒性實驗:采用最大耐受劑量法,設(shè)玫瑰花復(fù)合煎劑15000mg(/kg·BW)一個劑量組,小鼠20只,雌雄各半,隨機分為給藥組和對照組,均按20mL(/kg·BW)經(jīng)口灌胃。灌胃前動物禁食12h,不限飲水。對照組灌胃等體積的生理鹽水,期間試驗小鼠正常飲食和飲水。連續(xù)觀察一周,觀察外表體征、精神狀態(tài)等,每天記錄小鼠的體重、飲水量、進食量的變化以及動物的中毒表現(xiàn)以及是否有死亡現(xiàn)象發(fā)生,實驗結(jié)束后處死動物做大體解剖[5]。

    遺傳毒性試驗:(1)Ames試驗。將受試物高壓滅菌后置于4°C冰箱保存,試驗前用無菌去離子水等比例進行稀釋,設(shè)立濃度為8、40、200、1000、5000μg/皿5個劑量組,采用平板摻入法,在加與不加體外活化系統(tǒng)(S9混合液)的條件下進行。試驗同時設(shè)立溶劑對照組、未處理對照組(自發(fā)回變組)和陽性對照組。若受試物的回變菌落數(shù)高于自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍以上,且具有一定的劑量反應(yīng)關(guān)系,則表明細(xì)菌回復(fù)突變試驗結(jié)果為陽性,整個試驗在相同的條件下重復(fù)進行一次。(2)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗。小鼠雌雄各半,隨機分成5組(n=10),即2.5、5.0、10.0g(/kg·BW)劑量組,陽性對照組注射環(huán)磷酰胺40mg/kg,陰性對照組灌服等體積蒸餾水。給藥2次,間隔24h,第2次給藥后6h,將動物處死,制骨髓涂片、晾干、甲醇固定、Giemsa染色。鏡檢PCE,計算微核率。(3)小鼠精子畸形試驗。雄性小鼠隨機分成5組(n=10),即2.5、5.0、10.0g(/kg·BW)劑量組,陰性對照組和環(huán)磷酰胺陽性對照組(40mg/kg)。按20mL(/kg·BW)容量灌胃5d,繼續(xù)喂養(yǎng)1個月,35d后處死,取出其兩側(cè)睪丸、附睪,放入生理鹽水離心管中,制成精子懸液,過濾、濾液涂片,用體積分?jǐn)?shù)1%的伊紅染色,晾干,油鏡下檢查精子形態(tài),記錄畸形精子數(shù),計算精子畸形率。

    1.5增強免疫力實驗

    劑量選擇:玫瑰花復(fù)合煎劑設(shè)300、600、1200mg(/kg·BW)三個劑量組,另設(shè)玫瑰花組和蒸餾水陰性對照組。各組小鼠每日灌胃量均為0.2mL/10(g·BW),連續(xù)灌胃30d。

    脾臟/體重比值、胸腺/體重比值:試驗結(jié)束時稱量動物體重,于處死動物后,取出脾臟和胸腺,并進行稱重,計算脾臟/體重比值、胸腺/體重比值。

    二硝基氟苯誘導(dǎo)小鼠DTH試驗(耳腫脹法):在小鼠右耳兩面均勻涂抹DNFB溶液,以此進行攻擊。攻擊后24h頸椎脫臼處死小鼠,剪下左右耳殼,按要求進行稱重。用左右耳重量之差表示DTH的程度。方法參照《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》(2003年版)試驗方法進行[7]。

    抗體生成試驗(Jerne改良玻片法):脫纖維綿羊紅細(xì)胞免疫5d處死動物,取脾臟制成脾細(xì)胞懸液,將表層培養(yǎng)基加熱溶解后,放45~50°C水浴保溫,與等量中性2倍的Hank’s液混合,分裝小試管,每管0.5mL,向管內(nèi)加入50μL10%SRBC,25μL脾細(xì)胞懸液,迅速混勻,傾倒于已刷瓊脂糖薄層的玻片上,待凝固后,放入二氧化碳培養(yǎng)箱1.5h,用SA緩沖液稀釋的補體

    (1∶8)加入到片架凹槽內(nèi),繼續(xù)溫育1.5h,計數(shù)溶血空斑數(shù)。

    NK細(xì)胞活性測定(乳酸脫氫酶LDH測定法):頸椎脫臼處死小鼠,制備濃度為2×107個/mL的脾細(xì)胞懸液。將脾細(xì)胞和靶細(xì)胞YAC-1細(xì)胞各100μL分置于96孔培養(yǎng)板中,參考保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范(2003年版)操作,在490nm處測定OD值,計算NK細(xì)胞活性率。

    1.6統(tǒng)計學(xué)分析

    所有數(shù)據(jù)采用SPSS21.0軟件進行處理。計量資—料用(x±s)表示,組間比較采用t檢驗;計數(shù)資料用[n(%)]表示,組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2結(jié)果

    2.1急性經(jīng)口毒性實驗

    給予玫瑰花復(fù)合煎劑后,小鼠一般表現(xiàn)和行為均未見異常,觀察期內(nèi)未見動物死亡,灌胃最大給藥劑量連續(xù)觀察7d小鼠外觀、精神等均無異常。對照組和給藥組平日進食量和飲水量無顯著差異,未出現(xiàn)毒性反應(yīng)。實驗結(jié)束時處死動物,大體解剖肉眼觀察未見病理異常改變。說明玫瑰花復(fù)合煎劑對小鼠急性經(jīng)口MTD值均大于15000mg(/kg·BW),按急性毒性分級,該受試物屬于無毒級。

    2.2遺傳毒性試驗結(jié)果

    對TA97、TA98、TA100和TA102試驗菌株,不同濃度受試物在加和不加S9條件下的回變菌落數(shù)與陰性對照組無顯著差異(P>0.05),而陽性對照組回變菌落數(shù)均高于陰性對照組回變菌落數(shù)2倍以上(P<0.05)。玫瑰花復(fù)合煎劑細(xì)菌回復(fù)突變試驗檢測結(jié)果為陰性,重復(fù)試驗仍得出相同結(jié)果。

    與陰性對照組比較,玫瑰花復(fù)合煎劑各劑量組微核率無顯著性差異(P>0.05);與陰性對照組比較,環(huán)磷酰胺陽性對照組微核率有顯著性差異(P<0.01)。

    與陰性對照組比較,玫瑰花復(fù)合煎劑各劑量組小鼠精子畸形率無顯著性差異(P>0.05);與陰性對照組比較,環(huán)磷酰胺陽性對照組小鼠精子畸形率有顯著性差異(P<0.01)。

    2.3免疫功能試驗結(jié)果

    連續(xù)灌胃30d后,玫瑰花組、玫瑰花復(fù)合煎劑300、600、1200mg(/kg·BW)三個劑量組動物的脾臟/體重比值、胸腺/體重比值與陰性對照組相比,均無顯著性差異(P>0.05),見表1。

    連續(xù)灌胃30d后,與陰性對照組相比,玫瑰花復(fù)合煎劑三個劑量組動物的左右耳片重量差值,300、600、1200mg(/kg·BW)三個劑量組動物均有顯著性差異(P<0.05)。玫瑰花片組左右耳片重量差值也明顯增加(P<0.05),見表2。

    連續(xù)灌胃30d后,玫瑰花復(fù)合煎劑三個劑量組動物的溶血空斑數(shù)與陰性對照組相比,300、600、1200mg(/kg·BW)三個劑量組動物均有顯著性差異(P<0.05)。玫瑰花片組溶血空斑數(shù)也明顯增加(P<0.05),見表3。

    連續(xù)灌胃30d后,玫瑰花復(fù)合煎劑三個劑量組、玫瑰花組動物的NK細(xì)胞活性與陰性對照組相比均有不同程度的增加,玫瑰花復(fù)合煎劑600、1200mg(/kg·BW)劑量組有顯著性差異(P<0.05),見表4。

    3結(jié)論

    免疫是機體識別和排除抗原性異物,維護自身生理平衡和穩(wěn)定的一種功能。人體的免疫系統(tǒng)由免疫器官(如胸腺、脾臟等)、免疫細(xì)胞(如吞噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等)和免疫分子(如補體、細(xì)胞因子等)所組成,通過先天性免疫(非特異性免疫)和獲得性免疫(特異性免疫)來執(zhí)行,發(fā)揮免疫防御、免疫穩(wěn)定和免疫監(jiān)視三大功能。

    玫瑰花含有黃酮類、多酚、多糖等多種化學(xué)成份,具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗癌抗菌、降血脂和預(yù)防心臟病等生理活性[8]。黃精在臨床中是重要的扶正固本類中藥,常被用于補益脾腎、填精補腎,增強機體免疫的功效。黃精多糖作為黃精中主要的有效成分,具有多種生物活性[9-10],沈建利等[11]以黃精多糖(100、400、800mg/kg)灌胃環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制模型小鼠,免疫抑制小鼠的臟器指數(shù)、血清溶血素水平及吞噬指數(shù)顯著提高(P<0.05);表明黃精多糖可增強機體免疫力。葉紹凡[12]的研究顯示,給予黃精多糖,可顯著提高運動小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、巨噬細(xì)胞吞噬率、吞噬指數(shù),與單純運動組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,且作用呈現(xiàn)劑量相關(guān)性。提示黃精多糖可提高長期力竭訓(xùn)練小鼠的免疫能力,具有顯著免疫增強效應(yīng)。

    本研究實驗結(jié)果表明玫瑰花、黃精復(fù)合煎劑連續(xù)灌胃小鼠30d后,能顯著提高小鼠的遲發(fā)變態(tài)反應(yīng)、溶血空斑數(shù)以及NK細(xì)胞活性。可初步判定,玫瑰花及黃精配伍可增強動物細(xì)胞免疫、體液免疫和NK細(xì)胞活性,具有增強免疫力的功能,且功效較玫瑰花單用更加顯著。本實驗毒理結(jié)果表明,玫瑰花與黃精復(fù)合煎劑對小鼠急性經(jīng)口毒性試驗結(jié)果MTD值>15000mg(/kg·BW),屬無毒級,小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗、小鼠精子畸形試驗、Ames試驗均未見遺傳毒性,為用藥劑量及安全性提供了參考。

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