熒光定量PCR在肺炎支原體感染早期診斷中的價值探索

肖志剛 肖宗浩 劉海歐 陳愛萍 羅舜燕 莊宇嫦

[摘要]目的：探討熒光定量PCR檢測肺炎支原體（MP）-DNA早期診斷MP感染的價值。方法：選取2018年10月至2019年11月本院187例確診為肺炎疾病的患兒，分別采用熒光定量PCR檢測MP-DNA和酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清免疫球蛋白M（MP-IgM）。觀察兩種檢查方法不同時間檢測陽性率，兩種方法及聯(lián)合檢測對不同年齡段患兒的檢測陽性率。結果：MP-DNA和聯(lián)合檢測入組時，MP感染陽性率高于MP-IgM檢測，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;入組1周、2周時，MP-DNA和聯(lián)合檢測MP感染陽性率高于MP-IgM檢測，但差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。MP-DNA、MP-IgM及聯(lián)合檢測的年齡<4歲、4～7歲、7～10歲和≥10歲患兒最終MP感染陽性率相比差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。進一步分析顯示，聯(lián)合檢測高于MP-DNA檢測的年齡主要在<4歲和4～7歲，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結論：熒光定量PCR檢測MP-DNA早期診斷MP感染的價值不低于MP-DNA和MP-IgM聯(lián)合檢測。

[關鍵詞]肺炎支原體;脫氧核糖核酸;聚合酶鏈反應

[中圖分類號]R725.6.

[文獻標識碼]A.

[文章編號]2096-5249（2022）02-0001-04

肺炎支原體（mycoplasma?pneumaniae，MP）是急性呼吸道感染、支氣管炎、哮喘等的常見病原體，是兒童社區(qū)獲得性肺炎的重要病原體，MP肺炎占住院兒童社區(qū)獲得性肺炎的10%～40%[1]。MP感染除呼吸道表現(xiàn)外，還可導致心肌炎、腦炎、腎炎等多種肺外并發(fā)癥及肺壞死，早期診斷、早期干預對預防重癥及減少并發(fā)癥有重要作用。MP肺炎臨床癥狀和特征與其他肺部感染相似，臨床易出現(xiàn)誤診，或僅僅依靠臨床癥狀體征難以與病毒、細菌、結核感染相互區(qū)別，需要借助臨床檢驗才能完成早期診斷。MP的常用病原學檢測方法包括MP培養(yǎng)和分離及MP血清學檢測。MP生長緩慢，一般培養(yǎng)法不能滿足臨床快速診斷需求，血清學檢測MP血清球蛋白M抗體（MP-IgM）受病程的影響，具有一定的臨床局限性。研究發(fā)現(xiàn)早期感染患兒要在病程1周后才能檢出IgM，而且患兒免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，也會導致其抗體生產能力受限，提高檢測方案的假陰性率，影響臨床疾病判斷，降低治療效果。近年來分子檢測技術廣泛用于MP診斷，包括普通聚合酶鏈反應（PCR）、反轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）等，可快速檢測到體內微量MP-DNA，其敏感性和特異性高，MP-DNA陽性率不受病程、是否達到高峰及感染程度的影響，在發(fā)病初期對MP患兒即具有診斷價值[2]。本研究通過對187例肺炎患兒同時采用MP-DNA和MP-IgM檢測，進一步探討MP-DNA檢測在小兒肺炎診斷中的應用價值，并嘗試觀察MP-DNA和MP-IgM聯(lián)合應用的診斷現(xiàn)將結果報告如下。

1對象與方法

1.1研究對象

選擇2018年10月至2019年11月在梅州市婦幼保健計劃生育服務中心兒科就診的187例肺炎患兒作為研究對象。187例患兒中，男99例，女88例;年齡3個月～13.4歲（5.63±2.78）歲;病程4h～7d（2.13±1.09）d;體溫（39.23±0.52）°C。

納入標準：（1）年齡1個月～14歲，性別不限;（2）符合《實用兒科學》[3]中呼吸道感染的診斷標準，發(fā)病至入院時間≤7d，入院前未接受過抗生素治療;（3）患兒監(jiān)護人對研究知情并簽署知情同意書。

排除標準：（1）合并免疫缺陷、嚴重貧血、肺結核、惡性腫瘤、先天性支氣管肺發(fā)育不良等疾病者;（2）精神疾病、認知功能障礙患兒;（3）嚴重心、肝、腎等功能不全者。

1.2研究方法

患兒于入院當日、入院后1周、入院后2周采用無菌咽拭子擦拭咽喉壁，利用熒光定量PCR檢測拭取物，采用ABI-7500熒光定量PCR儀檢測，試劑盒購自上海威正翔禹生物科技有限公司。分別于入院當日、入院后1周、入院后2周抽取患兒靜脈血，采用酶聯(lián)免疫法檢測MP-IgM，陽性判定標準為s/co值≥1.1定義為陽性?；純好鞔_診斷后給予抗支原體治療，治療方法包括休息、呼吸道隔離、積極化痰止咳、保持呼吸道通暢、必要時進行霧化吸入，抗生素選擇阿奇霉素10mg/（kg·d），5d為1個療程，6個月以下采用口服阿奇霉素，抗感染療程持續(xù)10～14d，部分難治性病例抗生素延長至3周。

1.3觀察指標

（1）觀察兩種檢查方法不同時間檢測陽性率;（2）觀察兩種方法及聯(lián)合檢測對不同年齡段患兒的檢測陽性率，聯(lián)合檢測陽性定義為MP-DNA或MP-IgM之一陽性。

1.4統(tǒng)計學方法

采用SPSS23.0進行統(tǒng)計學數(shù)據(jù)分析。計量資料—采用（x±s）表示，行t檢驗;計數(shù)資料采用[n（%）]表示，行χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結果

2.1不同檢測方法MP感染檢測情況比較

MP-DNA和聯(lián)合檢測入組時MP感染陽性率高于MP-IgM檢測，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;入組1周、2周時MP-DNA和聯(lián)合檢測MP感染陽性率高于MP-IgM檢測，但差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表1。

2.2不同檢測方法在患兒不同年齡階段最終MP感染陽性率的比較

MP-DNA、MP-IgM及聯(lián)合檢測的<4歲、4～7歲、7～10歲和≥10歲患兒最終MP感染陽性率相比差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。進一步分析顯示，聯(lián)合檢測高于MP-DNA檢測的年齡主要在<4歲和4～7歲，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表2。

3討論

現(xiàn)階段，隨著臨床對于肺炎疾病研究程度的加深，發(fā)現(xiàn)疾病產生的一項重要因素為病原體支原體感染，目前支原體病菌類型已達11種，能夠造成人體呼吸系統(tǒng)損傷的病原體主要為MP病菌。該類病菌細胞結構獨特，其外無細胞壁結構，因此更易通過濾菌器，含有RNA、DNA兩種結構，通過循環(huán)代謝產生生長所需能量。支原體的傳播方式較多，唾液、飛沫均會造成致病菌傳播，引起患者呼吸道感染疾病。受致病菌作用，大部分患者還會出現(xiàn)炎癥病灶，使得呼吸道分泌物進一步增多，造成患者排痰困難或支氣管堵塞。

MP肺炎約占社區(qū)獲得性肺炎的40%和住院患者的18%，如未得到及時治療，可導致一系列并發(fā)癥發(fā)生，嚴重影響患兒的身心健康。MP肺炎可發(fā)生于各個季節(jié)，多為亞急性發(fā)作，主要表現(xiàn)為咳嗽、咽痛、頭痛等臨床癥狀，易發(fā)生肺外播散，任何器官均可累加及，臨床報道的肺外表現(xiàn)包括自身免疫性溶血性貧血、非特異性肌痛或關節(jié)痛、心肌炎、心律失常、心功能不全等，嚴重者可并發(fā)中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)病變，甚至可導致死亡。小兒MP肺炎缺乏特異性臨床癥狀，其臨床癥狀與細菌或病毒感染引起的呼吸道感染相似，易導致被忽視、誤診和延誤治療。研究顯示[4]，延誤治療可導致約10.9%的MP肺炎患兒需要機械通氣，3%～4%的患兒出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征。研究顯示，非典型肺炎支原體感染患兒經(jīng)驗性用藥存在明顯缺點。近年來，兒童MP肺炎呈現(xiàn)新的特點，臨床上不斷有MP感染的報道，使用“重癥肺炎支原體肺炎”“難治性肺炎支原體肺炎”“大環(huán)內酯類耐藥肺炎支原體肺炎”等名稱[5]，給MP感染的臨床治療帶來新的問題和難點。因此早期、快速、敏感的診斷MP，對針對性用藥、預防MP引發(fā)的并發(fā)癥及減少MP感染的大規(guī)模爆發(fā)等具有現(xiàn)實的意義。

傳統(tǒng)的MP檢測主要依靠分離培養(yǎng)法和免疫學方法檢測抗原或抗體。經(jīng)典分離培養(yǎng)法是臨床診斷主要依據(jù)，其主要是對咽拭子、氣道吸出物、胸腔穿刺液和肺泡灌洗液進行MP的分離培養(yǎng)。MP大小一般在0.2～0.3μM，內含一個環(huán)狀雙鏈DNA，可在固體培養(yǎng)基上形成“荷包蛋”樣菌洛，但MP基因組的大小僅為大腸埃希菌的1/6，故其生物合成和代謝能力，需從外界攝取各種基礎養(yǎng)分，人工培養(yǎng)營養(yǎng)要求高。臨床標本中MP含量低，易污染，分離培養(yǎng)時間長，在體外生長緩慢，判定結果需要3～4周，陽性率低，缺乏早期診斷的價值。MP-IgM抗體是MP感染后機體最早產生的抗體，但其形成仍需要一定時間，多于感染1周左右可檢測到，3～4周達到高峰，可持續(xù)數(shù)月，但嬰幼兒免疫功能相對低下，抗體產生較弱，早期診斷也比較困難。同時免疫學方法檢測時，因MP與其他支原體存在共同抗原，可導致非特異性交叉反應，降低了診斷的特異性[6]。近年來，分子診斷的方法因其特異性高，敏感性好，在MP的臨床檢測方面具有較大優(yōu)勢。

MPM129株基因組有816394bp，含677個開放閱讀框，39個RNA編碼基因，G+C含量為40%，MP基因組具有偏嗜性，照常使用的編碼是AUU、AAA、UUU、GAA和UUA，最少使用的編碼是UGC、CGA、AGG、UGU。MPPCR檢測的靶序列常選在16rRNA基因組可變區(qū)與保守區(qū)、特異的染色體片段、P1蛋白基因區(qū)敏感性和穩(wěn)定性高，但存在基因高效擴增造成擴增產物污染而導致假陽性的可能[7]。近年來，以標記特異性熒光探針為特點的熒光定量PCR逐步用于MP-DNA檢測，采用完全閉管式操作，減少了擴增產物污染的機會，提高了檢測特異性，并可對擴增產物進行精確定量分析[8]。楊文青等[9]對742例患兒進行熒光定量PCR檢測MP-DNA，結果提示熒光定量PCR法檢測患兒MP-DNA水平，具有高敏感性、高特異性、檢測迅速和不存在交叉反應等特點，可作為早期MP感染的診斷方法。鐘偉明等[10]研究則顯示，采用熒光定量PCR法檢測MP-DNA既有利于MP感染的早期診斷，又可提高診斷的準確性。張志英等[11]研究顯示，在對213例疑似患兒進行檢查，發(fā)現(xiàn)痰液MP-DNA檢測準確率要優(yōu)于血清MP-IgM抗體檢測準確率，聯(lián)合運用后特異性、敏感性、陰性預測值均較高。本課題組前期研究顯示，MP-DNA對MP的早期檢測具有積極意義[12]。本研究結果顯示，MP-DNA入組時檢測陽性率高于對照組，與既往研究一致。MP-DNA和MP-IgM聯(lián)合檢測在入組檢出率顯著高于單獨MP-IgM檢測，在入組時、1周、2周聯(lián)合檢測與MP-DNA單獨檢測無顯著差異;年齡分層分析顯示，聯(lián)合檢測主要在年齡<7歲以下兒童中陽性率高于MP-DNA，提示熒光定量PCR檢測MP-DNA檢測的陽性率不低于聯(lián)合檢測，對年齡<7歲的兒童可考慮聯(lián)合檢測。

綜上所述，本研究結果提示熒光定量PCR檢測MP-DNA早期診斷MP感染的價值不低于MP-DNA和MP-IgM聯(lián)合檢測，可作為年齡≥7歲兒童的主要檢測手段，對年齡<7歲兒童為減少漏診，可考慮MP-DNA和MP-IgM聯(lián)合檢測。

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