微納米圖案化表面對細(xì)胞行為的影響

顧寅偉，李 艷，凌晶晶，顧 寧

（東南大學(xué) 生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，生物電子學(xué)國家重點實驗室，江蘇省生物材料與器件重點實驗室，江蘇 南京 210096）

細(xì)胞與材料間的相互作用研究，尤其是材料對細(xì)胞行為的調(diào)控，對于基礎(chǔ)生物學(xué)、組織工程和再生醫(yī)學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域至關(guān)重要。1911年，Harrison發(fā)現(xiàn)蜘蛛網(wǎng)上生長的細(xì)胞會沿著網(wǎng)中的纖維方向生長，并將這種現(xiàn)象稱為物理導(dǎo)向［1］。1945年，Weiss證實了該現(xiàn)象，將其命名為“接觸引導(dǎo)”［2］。隨著微納米加工技術(shù)的迅速發(fā)展，研究者在不同基材上制備出了形貌、尺寸各異的圖案，并研究了這些圖案對成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、上皮細(xì)胞、干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞行為的影響。在過去的幾十年內(nèi)，材料調(diào)節(jié)細(xì)胞行為的研究層出不窮，但如何創(chuàng)造一個最佳的細(xì)胞外環(huán)境，始終是一項極具挑戰(zhàn)性的工作?？刂莆⒓{米尺度上材料表面與細(xì)胞的相互作用，在實現(xiàn)細(xì)胞調(diào)控這一研究方向上有著巨大的發(fā)展前景。

1 細(xì)胞形態(tài)變化原理

細(xì)胞的機械特性主要由細(xì)胞骨架決定。細(xì)胞骨架是真核細(xì)胞中由微管、微絲以及中間纖維構(gòu)成的蛋白纖維網(wǎng)架體系，在細(xì)胞形態(tài)、粘附、分裂、運動以及信號傳導(dǎo)中都起著重要作用。

細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）是由蛋白質(zhì)和多聚糖組成的復(fù)雜網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞及組織提供結(jié)構(gòu)支撐。在人體內(nèi)，細(xì)胞活動與細(xì)胞外基質(zhì)密切相關(guān)，沒有細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞無法正常完成包括分裂在內(nèi)的多種行為［3］。細(xì)胞受細(xì)胞外基質(zhì)影響的機制有以下3種：整合素與配體間的相互作用、表面化學(xué)信號、基底的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)效應(yīng)［4］。

整合素是ECM蛋白的粘附性受體，在非活性狀態(tài)下，它們在細(xì)胞膜內(nèi)自由擴散。當(dāng)細(xì)胞在ECM中遇到一個可作用的結(jié)合位點時，多種整合素發(fā)生構(gòu)象變化，通過物理聚集將大量細(xì)胞質(zhì)蛋白吸引到粘附部位，以增大粘附點、提高粘附強度、加強生化信號活性。這些較大的整合素、細(xì)胞質(zhì)蛋白聚集通常稱為焦點粘連。整合素介導(dǎo)的細(xì)胞粘連將細(xì)胞骨架與ECM連接起來，并在兩者之間提供動態(tài)的雙向聯(lián)系［5］。如此一來，力誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)構(gòu)象變化將會被轉(zhuǎn)化為生物化學(xué)信號，從而激活細(xì)胞內(nèi)多種信號通路，最終調(diào)節(jié)細(xì)胞活動。

2 表面圖案化方法及其意義

至今為止，表面圖案化技術(shù)已較為成熟，根據(jù)制備原理，主要分為以下兩種類型：（1）自上而下的制備途徑。該類方法從材料本體著手，通過外部調(diào)控使圖案的尺寸由宏觀進入微觀，形成具有特定性能或形狀的微納米結(jié)構(gòu)，主要包括光刻技術(shù)［6］、軟刻蝕技術(shù)［7］、納米壓?。∟IL）［8］等；（2）自下而上的制備途徑。通過原子、分子或分子聚合物間的非共價鍵力，得到尺寸逐漸增大的微納米結(jié)構(gòu)材料，該類方法包括自組裝［9］、共價鍵固定［10］、靜電逐層沉積［11］等技術(shù)。本課題組研究了一種利用交流磁場誘導(dǎo)磁性納米顆粒的準(zhǔn)一維組裝技術(shù)，該方法將直徑約10～11 nm的超順磁性四氧化三鐵納米顆粒暴露于垂直的交變磁場下，利用磁偶極相互作用，使納米粒子在磁場作用下形成纖維結(jié)構(gòu)，隨著磁場強度的增加，其構(gòu)象發(fā)生從非晶形聚合物到纖維狀結(jié)構(gòu)的顯著轉(zhuǎn)變［12］。相似地，運用交變磁場還可以完成辣根過氧化物酶（HRP）的準(zhǔn)一維自組裝，同時可以幾乎完全保留其催化活性［13］。另外，本課題組還開發(fā)了一種旋轉(zhuǎn)磁場組裝盤狀磁性水凝膠復(fù)合材料的制備方法，三維有序排列的磁性納米鐵顆粒可以增強材料的磁熱性能以及機械強度［14］。與化學(xué)修飾或物理蝕刻方法相比，該組裝方法具有操作簡單、成本低廉的優(yōu)點。

人體內(nèi)的ECM是一種復(fù)雜的三維網(wǎng)格架構(gòu)，為細(xì)胞提供復(fù)雜的化學(xué)、物理微環(huán)境，錨固提供底物，并作為組織支撐，指導(dǎo)細(xì)胞的生長遷移。缺損組織的修復(fù)需要ECM替代支架的參與。細(xì)胞與材料表面的結(jié)合包括細(xì)胞附著、細(xì)胞鋪展、肌動蛋白細(xì)胞骨架的變化以及局部粘連的形成。當(dāng)由體外被接種到人造材料表面時，細(xì)胞會從圓形轉(zhuǎn)變?yōu)楸P狀形態(tài)，細(xì)胞鋪展的初始階段類似于液滴在可濕性表面上的扁平化過程［15］。隨后，細(xì)胞內(nèi)的肌動蛋白微絲發(fā)生重組，細(xì)胞和底物之間形成局部黏連，細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的內(nèi)部收縮控制進一步的細(xì)胞鋪展行為，如層狀延伸和細(xì)胞運動。

圖案化技術(shù)可以在細(xì)胞培養(yǎng)基底上產(chǎn)生各種形狀、大小的表面形貌，全面了解細(xì)胞粘附、鋪展在不同圖案表面上的具體過程及后續(xù)功能，對于生物材料的設(shè)計極其重要。

3 表面圖案化對細(xì)胞行為的影響

在化學(xué)圖案化中，特異性細(xì)胞感應(yīng)機制起主要作用，而形貌表面圖案化對細(xì)胞行為的調(diào)節(jié)，依賴于材料表面的結(jié)構(gòu)與尺寸。一般而言，微納米圖案可分為各向異性和各向同性兩種。各向異性圖案指脊和槽形圖案，溝槽、條紋圖案可以使細(xì)胞在微納米尺度上與形貌方向?qū)R，形成接觸引導(dǎo)反應(yīng)，對細(xì)胞的影響以細(xì)胞導(dǎo)向、形貌、骨架改變?yōu)橹?。而各向同性圖案指隨機或均勻分布的圖案，如島、坑、樁等，一般不會誘導(dǎo)細(xì)胞定向，但能夠在微納米尺度上影響細(xì)胞群體化行為，諸如細(xì)胞粘附程度、細(xì)胞鋪展面積、增殖率、分化程度、上調(diào)或下調(diào)細(xì)胞信號傳導(dǎo)等。

3.1 各向異性微納米圖案

各種尺寸的凹槽形貌構(gòu)成了各向異性圖案最經(jīng)典的例子，用于研究體外“接觸引導(dǎo)”現(xiàn)象。所謂“接觸引導(dǎo)”是指細(xì)胞在微納米級各向異性圖案表面生長時，會出現(xiàn)的調(diào)節(jié)自身取向并沿著圖案方向生長的現(xiàn)象。該現(xiàn)象除了可以用于高度材料引導(dǎo)取向的細(xì)胞組織的再生，例如肌腱、神經(jīng)、骨的修復(fù)，還能夠引起許多其他細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)。Gerecht等［16］發(fā)現(xiàn)使用松胞素D破壞細(xì)胞骨架的細(xì)胞在圖案化表面上表現(xiàn)出較差的取向性，表明細(xì)胞骨架在接觸引導(dǎo)現(xiàn)象中起著不可或缺的作用。

接觸引導(dǎo)發(fā)生程度的影響因素包括溝槽圖案的脊寬、深度，所選細(xì)胞的種類，材料的類別以及實驗條件等。大多數(shù)細(xì)胞通過沿著圖案主軸的對齊和伸長來響應(yīng)平行排列的凹槽和脊，而平坦表面的細(xì)胞通常表現(xiàn)出隨機取向和更圓潤的形態(tài)。Charest等［17］使用深度相同、脊寬不同的納米溝槽圖案對成肌細(xì)胞進行培養(yǎng)，結(jié)果表明細(xì)胞發(fā)生接觸引導(dǎo)的程度在一定范圍內(nèi)與脊寬成反比，同時，脊寬還存在一個最適尺寸，可以使接觸引導(dǎo)的發(fā)生程度最大化。超過臨界尺寸時，細(xì)胞對凹槽圖案的響應(yīng)將逐漸消失，細(xì)胞行為趨于在平坦表面上觀察到的行為。相對地，也有相關(guān)研究［18］報道了溝槽的最小尺寸閾值，在該閾值下同樣不再觀察到細(xì)胞排列變化。對于不同細(xì)胞類型，存在不同的最佳形貌尺寸范圍。除了溝槽的寬度和深度之外，還有研究表明凹槽的縱橫比也會對細(xì)胞行為產(chǎn)生影響。Crouch［19］、Wong［20］等的研究分別發(fā)現(xiàn)人類間充質(zhì)干細(xì)胞和人類真皮成纖維細(xì)胞的細(xì)胞對齊、伸長程度，在一定范圍內(nèi)會隨溝槽縱橫比單調(diào)增加。另外，Holle等［21］還發(fā)現(xiàn)胰腺癌細(xì)胞中的角蛋白細(xì)胞骨架能夠增強細(xì)胞對溝槽深度的形態(tài)響應(yīng)，但沒有影響對寬度的響應(yīng)。綜上所述，與接觸引導(dǎo)相關(guān)的細(xì)胞形態(tài)變化與溝槽的脊寬、深度關(guān)系最為密切，但并不僅僅受上述兩種因素的影響，其最終效果取決于多種條件的協(xié)同作用。

除細(xì)胞形態(tài)變化外，細(xì)胞在溝槽圖案上的遷移運動也是研究的重點之一。在溝槽圖案化表面上培養(yǎng)時，許多細(xì)胞類型（如成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞、免疫細(xì)胞或神經(jīng)元）顯示出平行于溝槽的定向遷移，這與在光滑平面上觀察到的細(xì)胞隨機運動截然不同，并且細(xì)胞運動強度取決于溝槽尺寸。表1歸納整理了部分研究中溝槽圖案的尺寸因素對細(xì)胞形態(tài)、運動的影響。

表1 微納米溝槽對細(xì)胞行為的影響Table 1 The effect of micro/nano grooves on cell behavior

另外，由于近年來制備技術(shù)的發(fā)展以及研究者們對多數(shù)溝槽圖案存在鋒利邊緣的不合理性產(chǎn)生爭議，越來越多的學(xué)者開始轉(zhuǎn)向研究彎曲/波浪形表面的微納米溝槽圖案。Linke等［31］在波長（峰間距離）為1.7～6.3μm的波浪形表面上培養(yǎng)成肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞向圖案方向生長，并隨著波長的增加顯示出更明顯的取向。Song等［32］研究發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞會優(yōu)先定位于波浪形溝槽圖案的凹面區(qū)域，并沿著溝槽方向遷移，當(dāng)溝槽波長從20μm增加到160μm時，T細(xì)胞的方向性和遷移速度均趨于消失；Cheng等［33］在血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)實驗中也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象，并觀察到細(xì)胞在波長150μm的溝槽上仍能表現(xiàn)出一定的接觸引導(dǎo)現(xiàn)象。

各向異性的微納米圖案對細(xì)胞基因表達影響的研究相對比較少見。Gwon等［34］使用聚己內(nèi)酯（PCL）材料設(shè)計的一種間距、高度均為5μm的放射狀溝槽圖案表面的骨修復(fù)移植支架，可以顯著促進其上培養(yǎng)細(xì)胞的取向延伸、增殖和成骨分化（圖1）。本課題組將靜磁場組裝和凝膠化相結(jié)合制備了一種各向異性磁性水凝膠材料，可以提升所培養(yǎng)細(xì)胞的活力和多能性［35］。

圖1 放射狀溝槽圖案支架用于修復(fù)骨缺損［34］Fig.1 The radial groove pattern scaffold is used to repair bone defects［34］

3.2 各向同性微納米圖案

在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，多數(shù)支架都會采用各向同性孔洞結(jié)構(gòu)，以增強細(xì)胞浸潤，促進新組織生長。在隨機圖案化基底上培養(yǎng)時，理論上細(xì)胞將不會出現(xiàn)接觸引導(dǎo)等有取向性的現(xiàn)象。與在凹槽上觀察到的細(xì)長形態(tài)相反，當(dāng)各向同性圖案表面的特征尺寸在微米范圍內(nèi)時，細(xì)胞會表現(xiàn)出分支形態(tài)。細(xì)胞的形變、粘附程度與圖案類型及尺寸有著直接關(guān)聯(lián)。Zhou［36］在聚二甲基硅氧烷（PDMS）微納米孔圖案上培養(yǎng)Hela細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)微納米孔直徑在1～12μm之間時，細(xì)胞膜較容易發(fā)生變形，變形程度與孔深度成正比，并且細(xì)胞粘附性顯著上升。Lim等［37］的研究發(fā)現(xiàn)，與85 nm的島狀結(jié)構(gòu)及平面聚苯乙烯（PS）基底相比，在高度為11 nm的島狀結(jié)構(gòu)上培養(yǎng)成骨細(xì)胞時，細(xì)胞的粘附性以及堿性磷酸酶（ALP）活性都有一定提升。

各向同性圖案表面也會對細(xì)胞運動產(chǎn)生影響。Nasrollahi等［38］通過在氧化鋁膜內(nèi)部制備相同間距直徑分別為40、80 nm的孔狀圖案，觀察到成纖維細(xì)胞在較大孔上的遷移速度更快。Jeon等［39］使用具有不同密度納米孔圖案的材料培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，觀察到細(xì)胞向高密度區(qū)域遷移，表明高納米孔密度可增強細(xì)胞運動。

細(xì)胞粘附配位體的尺度及空間分布能夠影響細(xì)胞功能的實現(xiàn)。Arnold等［40］利用不同間距的環(huán)狀RGD（由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸組成）多肽包覆金納米圓點圖案進行實驗，發(fā)現(xiàn)配位體間距超過73 nm時會顯著降低成骨細(xì)胞粘附、延展和焦點粘連的形成，而較小的空間間距則有助于整聯(lián)蛋白的聚集和活化。Huang等［41］在有序/無序RGD環(huán)肽納米圖案上培養(yǎng)成骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)當(dāng)配體間距大于70 nm時，細(xì)胞在有序RGD納米圖案上不會發(fā)生粘附，而在無序圖案上仍會出現(xiàn)。Oh等［42］研究發(fā)現(xiàn)直徑約30 nm的TiO2納米管能夠提升表面培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的粘附性，但對分化無明顯影響，而直徑約70～100 nm的納米管會促進細(xì)胞向成骨方向分化。Chen等［43］在PDMS基底上制備了直徑1.83μm、間距4μm的均勻微米柱圖案，結(jié)果表明間充質(zhì)干細(xì)胞在較硬的基底上傾向于向成骨方向分化，而在較軟的基底傾向于向成脂肪方向分化。

表2展示了幾種各向同性圖案對細(xì)胞行為的調(diào)控作用。由于各向同性圖案存在形狀、尺寸、分布等多種可調(diào)節(jié)因素，故難以橫向比較。從目前研究可以得出的結(jié)論是，較小的納米形貌尺度（約10 nm高或深）對細(xì)胞基因表達功能的影響更顯著，當(dāng)尺度增大至約100 nm時，這種影響將變?nèi)跎踔料А?/p>

表2 各向同性的圖案化表面對細(xì)胞行為的影響Table 2 The effect of isotropic patterned surface on cell behavior

3.3 復(fù)雜微納米圖案

至今為止，材料表面圖案對細(xì)胞行為影響的研究已經(jīng)取得了不少成果，然而大部分實驗仍基于簡單表面圖案進行。但單一尺度的結(jié)構(gòu)并不符合自然界中多數(shù)細(xì)胞的生長環(huán)境，細(xì)胞依附的表面通常為不同尺度、多級結(jié)構(gòu)的復(fù)合狀態(tài)。隨著材料表面修飾技術(shù)的快速發(fā)展，研究者們開始將目光轉(zhuǎn)向混合、復(fù)雜圖案對細(xì)胞產(chǎn)生的多重影響。與單一結(jié)構(gòu)相比，微納多級結(jié)構(gòu)可以發(fā)揮協(xié)同生物效應(yīng)，多尺度精確調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)行為。

混合、復(fù)雜圖案結(jié)構(gòu)能在一定程度上更好地模仿細(xì)胞外基質(zhì)中的復(fù)雜形貌結(jié)構(gòu)，有利于仿生生物材料的設(shè)計和應(yīng)用。Guo等［48］通過水肽噴墨打印和位點特異性生物礦化相結(jié)合的方法，制備了一種具有微米溝槽和納米二氧化硅復(fù)合多級結(jié)構(gòu)表面的水凝膠材料，該微納復(fù)合結(jié)構(gòu)系統(tǒng)能夠在誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞沿溝槽方向生長、排列的同時，促進細(xì)胞的成骨分化。Oyunbaatar等［49］發(fā)現(xiàn)與常規(guī)光滑的微柱陣列相比，在多級蘑菇型PDMS微柱陣列上培養(yǎng)的心肌細(xì)胞肌動蛋白聚合更為顯著，收縮力增強約20%。

細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的一項重要機制是整合素與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合位點的相互作用。因而，可以通過表面化學(xué)修飾的方法控制細(xì)胞與材料的結(jié)合位點。目前常用的自組裝方法是在無機材料表面形成一層有序的有機分子膜，再根據(jù)需要在有機分子層上修飾相應(yīng)的化學(xué)官能團，從而實現(xiàn)細(xì)胞功能的調(diào)控。使用較多的有機分子有疏水烴基硫醇、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、RGD［50］等。本課題組采用層層自組裝方法（LBL）制備的γ-Fe2O3/PLA復(fù)合多層結(jié)構(gòu)材料，可以通過磁效應(yīng)促進小鼠骨髓細(xì)胞的生長以及成骨分化（圖2）［51］。另外還制備出一種磁性水凝膠，可以有效模仿ECM，用作新型多細(xì)胞球體培養(yǎng)平臺，且在一定范圍內(nèi)調(diào)節(jié)凝膠內(nèi)磁性納米顆粒濃度可控制細(xì)胞粘附程度及細(xì)胞間的相互作用［52］。

圖2 磁性納米顆粒組裝薄膜對細(xì)胞作用機制的示意圖［51］Fig.2 Schematic showing of the mechanism for effect of the assembled film of magnetic nanoparticles on the cells［51］

4 總結(jié)與展望

微納米表面圖案化技術(shù)一直是研究材料與細(xì)胞相互作用的重要方法之一，通過使用不同幾何拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的圖案，調(diào)節(jié)并研究不同細(xì)胞的行為和功能，可以探知具體作用原理。隨著微納米圖案化技術(shù)的發(fā)展，后續(xù)的研究重心主要有以下幾個方面：（1）圖案化與外部作用力相結(jié)合，如電場、磁場，以通過這些復(fù)合作用更有效地控制細(xì)胞生理行為；（2）智能材料的運用，如利用溫敏材料形成微納米表面圖案，使材料能夠?qū)ν饨缱兓龀鲰憫?yīng)，更精確地調(diào)控細(xì)胞；（3）體內(nèi)環(huán)境下表面圖案化對細(xì)胞調(diào)控的可行性。近年來越來越多的研究關(guān)注于三維結(jié)構(gòu)對細(xì)胞的影響，這些研究對組織工程與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域所使用材料的設(shè)計及應(yīng)用都將具有重大指導(dǎo)意義。