川續(xù)斷組織培養(yǎng)外植體預(yù)處理方法研究*

于 花 晉海軍 張 嘉 朱 姍

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)中藥民族藥資源研究院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

川續(xù)斷（Dipsacus asperoidesC.Y.Cheng et T.M.Ai）為川續(xù)斷科川續(xù)斷屬藥用植物，其干燥根具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨及續(xù)折傷的功效[1]。隨著續(xù)斷藥材市場(chǎng)需求的日益增加，導(dǎo)致其供不應(yīng)求局面逐漸形成[2]。在貴州、湖北和云南等省出現(xiàn)了川續(xù)斷人工種植基地，但基地種源混雜、品種混亂，導(dǎo)致川續(xù)斷的種質(zhì)退化問題日趨嚴(yán)重[3]。目前，選育品質(zhì)優(yōu)良的川續(xù)斷種苗是解決其種質(zhì)退化的關(guān)鍵，而植物組織培養(yǎng)技術(shù)則是解決育種過程中種苗快繁的有效途徑之一[4]。植物組織培養(yǎng)外植體的預(yù)處理是此類實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵因素之一[5]，本研究擬通過對(duì)川續(xù)斷組織培養(yǎng)外植體消毒技術(shù)研究，獲得川續(xù)斷外植體消毒的最佳方式，為今后建立高效的川續(xù)斷組織培養(yǎng)體系提供技術(shù)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本研究所用川續(xù)斷外植體（一年生葉）采自貴州中醫(yī)藥大學(xué)中草藥種質(zhì)資源圃。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 植物組培過程中，外植體預(yù)處理一般包括流水沖洗、75%酒精消毒和0.1%升汞消毒，而后切分外植體轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基。

1.2.1 單因素試驗(yàn)

1.2.1.1 流水沖洗 將野外采集的川續(xù)斷葉片轉(zhuǎn)入網(wǎng)兜，分別用流水沖洗0.5 h、1 h、2 h、3 h 和4 h，而后用濾紙吸干葉片表面水分。用75%酒精浸泡10 s，再轉(zhuǎn)到0.1 %升汞中，15 min，然后用無菌蒸餾水沖洗4 次，轉(zhuǎn)入墊有濾紙的平皿（已消毒）將外植體切分成1.5 cm×1.5 cm 小塊，接入MS+6-BA 0.50 mg/L+NAA 1.00 mg/L的MS 培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件：溫度（25± 1）℃，光照時(shí)間8 h/d，光照強(qiáng)度1500 Lux，濕度60%的恒溫培養(yǎng)箱。40 d后統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)率（愈傷誘導(dǎo)率=愈傷外植體數(shù)/ 接種外植體總數(shù)×100%）。

1.2.1.2 75%酒精消毒 將流水沖洗2 h 的葉片用75%的酒精分別處理5 s、10 s、15 s、20 s、25 s，雙蒸水沖洗3 遍，轉(zhuǎn)入0.1%升汞消毒15 min。按照1.2.1.1 方式切分外植體并轉(zhuǎn)入愈傷相應(yīng)培養(yǎng)基誘導(dǎo)，培養(yǎng)條件同1.2.1.1。

1.2.1.3 0.1%升汞消毒 將流水沖洗2 h，75%的酒精處理10 s 的葉片用雙蒸水沖洗3 遍，轉(zhuǎn)入裝有0.1%升汞的玻璃瓶，分別處理5 min、10 min、15 min、20 min、25 min。雙蒸水沖洗3 遍，按照1.2.1.1 方式切分外植體并轉(zhuǎn)入愈傷相應(yīng)培養(yǎng)基誘導(dǎo)，培養(yǎng)條件同1.2.1.1。

1.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn) 以流水沖洗時(shí)間、75%酒精和0.1%升汞處理時(shí)間為因素，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，每個(gè)因素設(shè)計(jì)3 個(gè)水平，以愈傷組織誘導(dǎo)率為響應(yīng)值（見表1），用Design Expert V 8.0.6 軟件的Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)方案（見表2）進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。按照1.2.1.1 方式切分外植體并轉(zhuǎn)入愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA 0.50 mg/L+NAA 1.00 mg/L，培養(yǎng)條件同1.2.1.1。40 d 后統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)率。

表1 不同預(yù)處理方式的Box-Behnken 試驗(yàn)因素水平

表2 不同預(yù)處理方式的Box-Behnken 試驗(yàn)

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用Design Expert V 8.0.6軟件的Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)模塊對(duì)川續(xù)斷愈傷組織誘導(dǎo)前的預(yù)處理方式進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果 植物愈傷組織誘導(dǎo)過程中，實(shí)驗(yàn)的預(yù)處理對(duì)降低外植體污染率，提高愈傷誘導(dǎo)率具有重要作用。在川續(xù)斷組培實(shí)驗(yàn)預(yù)處理過程中，流水沖洗最佳時(shí)間為1 h，75%酒精最佳處理時(shí)間為10 s，0.1%升汞最佳處理時(shí)間為15 min。見圖1。

圖1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 以流水沖洗時(shí)間（A）、75%酒精（B）及0.1%升汞（C）消毒時(shí)間為因素，愈傷誘導(dǎo)率為響應(yīng)值，構(gòu)建二次回歸方程：愈傷誘導(dǎo)率=（95.11+4.57）×（A+3.00×B）+（1.69×C）-（1.41×A×B）-（9.67×A×C）-（1.99×B×C）-（34.17×A2）-（16.23×B2）-（3.80×C2）。

通過對(duì)回歸方程的顯著性分析（見表3），流水沖洗時(shí)間（A）、75%酒精（B）及0.1%升汞消毒（C）時(shí)間對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的線性效應(yīng)極顯著（P ＜0.01），不同因素對(duì)愈傷誘導(dǎo)的影響順序?yàn)椋篈＞B＞C，AB對(duì)愈傷誘導(dǎo)率的交互影響顯著，AC 及BC 對(duì)愈傷誘導(dǎo)率的交互影響極顯著。方程的預(yù)測(cè)模型顯著性水平P ＜0.000 1，說明方程模型極顯著；R2=0.998 8，失擬項(xiàng)（P ＝0.2606 ＞0.05）不顯著，表明模型具有較高可信度及擬合度，可用此方程替代實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)，對(duì)愈傷誘導(dǎo)的預(yù)處理過程進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。

表3 愈傷組織誘導(dǎo)的回歸方程顯著性檢驗(yàn)及方差分析

依據(jù)不同預(yù)處理方式對(duì)愈傷誘導(dǎo)率的響應(yīng)面分析，得到川續(xù)斷愈傷誘導(dǎo)的最佳預(yù)處理方式為：流水沖洗1.02 h，75%酒精10.41 s，0.1%升汞15.72 min，預(yù)測(cè)得到愈傷誘導(dǎo)率為：98.6%。為驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果可靠性，在最佳預(yù)處理方式下，愈傷組織誘導(dǎo)率為95.32%，此誘導(dǎo)率與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為3.44%，說明此響應(yīng)面優(yōu)化法得到的不同預(yù)處理方式真實(shí)可靠。見圖2。

圖2 不同預(yù)處理方式對(duì)愈傷誘導(dǎo)的響應(yīng)面分析

3 討論

植物組培過程中預(yù)處理是影響整個(gè)組培過程的關(guān)鍵因素[6]，常用的外植體預(yù)處理方式流水沖洗、酒精消毒、肥皂水清洗、升汞消毒及青霉素鈉浸泡等方式[7]。宋微等[8]報(bào)道，鐵線蓮組培時(shí)，外植體流水沖洗1 h 效果較好。特有瀕危藥用植物羌活離體培養(yǎng)時(shí)，葉片的最佳滅菌方法就包含75%酒精處理10 s[9]。陳燦[10]對(duì)白芨進(jìn)行組培研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)0.1%升汞對(duì)外植體預(yù)處理15 min，消毒效果較好。本研究采用響應(yīng)面優(yōu)化法，獲得川續(xù)斷葉片預(yù)處理最佳方式為：流水沖洗1.02 h，75%酒精10.41 s，0.1%升汞15.72 min，本研究結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果基本一致。

本研究篩選的川續(xù)斷組培最佳預(yù)處理方式，可為今后建立高效的川續(xù)斷快繁體系提供基礎(chǔ)資料。