絲綿木果油的超臨界提取及其油脂組成

朱誠炎，李 磊，紀祖陽，王 雷，王翼南，周夢琳，李舒宇，王寶琴

（濱州學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院，山東 濱州 256600）

絲 綿 木（Euonymus bungeanusMaxim.）又 名E.maackiiRupr.，無患子目、衛(wèi)矛科、衛(wèi)矛屬小喬木，俗稱白杜、桃葉衛(wèi)矛、明開夜合。絲綿木的枝葉秀麗，果實紅色，是良好的園林綠化觀賞樹種，廣泛分布于中國境內(nèi)除陜西、西南和兩廣外的其他各省區(qū)。

絲綿木種子中含有木栓酮、木栓醇、蒲公英萜酮、鯊烯、β-谷甾醇、長葉艾菊烯、棕櫚酸等成分，還含有對人體有益的氨基酸，有機鍺、有機硒的含量也較高。其粗提物主要為倍半萜類成分，具有較好的殺蟲和拒食作用[1-2]。絲綿木種子的水提醇沉物還具有一定的降低SD大鼠血糖的作用[3]。絲綿木葉的乙酸乙酯和正丁醇提取物，具有良好的抗氧化作用和護肝保肝作用，其護肝作用與其含有的總黃酮相關(guān)[4]。絲綿木種子的果肉中含有類胡蘿卜素類黃色素，其乙酸乙酯或乙醇提取物也具有一定的抗氧化活性，同時該色素還具有較好的耐熱性[5]。另外，在絲綿木的果實中還含有大量可用乙醇提取的生物堿和皂苷等活性成分，其總皂苷對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌等均有抑制作用，其中對革蘭氏陰性細菌枯草芽孢桿菌和沙門氏菌的抑制作用尤為明顯。同時，該總皂苷對人肝癌細胞系SMMC、人宮頸癌細胞系HeLa和乳腺癌細胞系MCF7的生長有明顯的抑制作用，對正常細胞的生長沒有明顯影響[6]。目前，對絲綿木的研究報道，主要集中在育苗及園林栽培技術(shù)等方面[7-8]，在生物活性物質(zhì)方面，尚未檢索到有對其果實和種子油脂方面的系統(tǒng)研究。本研究旨在考察綿木果實中油脂的分布特點，通過超臨界CO2提取工藝和GC-MS聯(lián)用方法，分析其脂肪酸組成和化學(xué)成分。

1 材料與方法

1.1 材料

絲綿木果實和種子采自山東省博興益豐生態(tài)林場。

1.2 儀器設(shè)備

SFE-700S-2000R型超臨界CO2萃取裝置，7890A/5975C 型氣-質(zhì)聯(lián)用儀，DHS16-A紅外水分測定儀，DL-6M大容量冷凍離心機，250型索氏提取器，恒溫水浴鍋，電熱培養(yǎng)箱，分析天平等。

1.3 試劑

正己烷、甲醇、氫氧化鉀、無水乙醇、無水乙醚、無水硫酸鈉等（均為分析純），磷酸脂酶，95%氫氧化鈉（食品級）。

1.4 實驗方法

1.4.1 絲綿木果實油脂的分布

將絲綿木果分為果皮、種子、果實3種樣品，于60℃下通風(fēng)干燥4h，粉碎，索氏提取法[9]測定油脂。每種樣品進行索氏提取3次，取其平均值。

1.4.2 絲綿木種子的超臨界提取

1）絲綿木種子超臨界CO2提取的影響因素實驗：參考文獻[10]的相關(guān)方法，絲綿木種子的超臨界萃取過程采用一次加料、一級萃取、二級分離的方式進行，對萃取率影響較大的參數(shù)包括萃取壓力、萃取溫度、萃取時間等。每個因素設(shè)置5個梯度，重復(fù)3次，通過各因素萃取的油脂得率，確定最佳參數(shù)條件。

2）絲綿木種子超臨界CO2提取的正交實驗：根據(jù)影響因素的實驗結(jié)果，對萃取壓力、萃取溫度和萃取時間等因素設(shè)置3個水平，進行L9(3)3正交實驗，探討最優(yōu)萃取條件組合。

1.4.3 粗油脂的純化

粗油脂按照如下工藝流程進行精制和純化：酶法脫膠→堿法皂化脫酸→水洗→脫水。具體工藝過程如下：

脫膠（除磷脂）：取200mL粗油脂（毛油），加入0.05%磷酸脂酶（1200IU）10mL，用磁力攪拌器攪拌10 min 后，6000r·min-1離心 20min，收集上清液，棄去沉淀物。

脫酸（去除游離脂肪酸）：在脫膠油脂中加入適量95%的氫氧化鈉（油脂總量的2%），充分攪拌20min 后，6000r·min-1離心 20min，收集上清液，棄去沉淀物。

上清液加入適量純凈水（油脂總量的5%），充分攪拌、靜置后，用分液漏斗分離，去除水分。

油脂中加入10%的無水硫酸鈉，充分攪拌，6000r·min-1離心20min，分別收集上清液和沉淀物，上清液即為純化油脂。

1.4.4 堿甲酯化處理油脂

參考文獻[11]中的方法，稱取制備的純化油脂樣品約0.2g于10mL具塞試管中，加入1mL乙醚-正己烷（2∶1）混合溶劑溶解，再依次加入1mL甲醇、2%（W/V）KOH-甲醇溶液2mL，搖勻，于60℃水浴中加熱10min后取出，冷卻至室溫。加入正己烷至刻度，混勻，振蕩萃取，靜置分層，取上層溶液定容至10 mL，即得甲酯化處理的油脂樣品。

1.4.5 不皂化物的提取制備

稱取5g絲綿木種子油脂樣品，溶于裝有50mL KOH-乙醇溶液（1.0mol·L-1）的250mL燒瓶中，沸水浴回流皂化1h左右至溶液澄清。冷卻至室溫，加50mL水，再用50mL正己烷萃取3次。合并萃取液，用90%的乙醇溶液25mL洗滌至中性，濾出溶液，真空蒸干，烘干至恒重，計算油脂中不皂化物含量。

1.4.6 GC-MS分析絲綿木果油脂的成分

利用GC-MS聯(lián)用技術(shù)對甲酯化絲綿木果的油脂成分進行分析，用GC面積歸一化法計算各組分的相對百分含量[12]。油脂樣品用正己烷溶解后，在以下條件下進行GC-MS分析：HP-5MS石英毛細管柱（30 m×250μm×0.25μm）；載氣為氦氣，流速1mL·min-1，進樣口溫度250℃，傳輸線溫度320℃。轟擊源電子能量70eV，離子源溫度為230℃，四極桿溫度150℃。

升溫程序：初始溫度50℃，保持1min，20℃·min-1的速率升溫到190℃，4℃·min-1升溫到240℃，10℃·min-1升溫到280℃，保持2min。樣品進樣量1 μL，不分流方式進樣，全掃描(Scan)方式進行掃描。測定結(jié)果通過HP MSD CHEM Station化學(xué)工作站檢索NIST98.L標準質(zhì)譜圖庫，并對色譜峰中顯示出的主要成分進行歸類計算。

1.4.7 GC-MS分析絲綿木不皂化物的成分

檢測條件：HP-5MS分析柱，進樣量3 μL，分流比50∶1，進樣溫度300℃，離子源溫度230℃。升溫程序：初始溫度70℃，保持2 min，8℃·min-1升溫至250℃，保持5 min，10℃·min-1上升到300℃，保持8 min。定量分析以豆甾醇作為標準品，繪制標準曲線，根據(jù)峰面積比值計算相對含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 絲綿木果油脂的分布

絲綿木果實中，果皮、種子和全果實各部位的油脂分布情況見表1。以絲綿木果實中的含油率為100%計，種子的含油量占果實總含油量的70.09%，為果實含油的主要部位。果皮雖然含油率高于全果，但其重量僅占果實干重的29.91%，即絲綿木的油脂主要分布在種子的籽仁中，含油率達43.79%，后續(xù)實驗以種子為材料。

表1 絲綿木果油脂的分布

2.2 絲綿木種子油脂超臨界提取的影響因素實驗

2.2.1 萃取壓力的影響

根據(jù)文獻，20～35 MPa是較為合適的提取壓力，大規(guī)模生產(chǎn)的提取壓力為25MPa甚至更低[13-14]。為得到最高的萃取率，本實驗在溫度25℃、萃取時間2h的條件下，測定了20～40MPa范圍內(nèi)絲綿木種子油脂的提取率情況，結(jié)果見圖1。壓力為35MPa時，絲綿木種子油脂的萃取率最高，為36.17%。

圖1 萃取壓力對油脂萃取率影響

2.2.2 萃取溫度的影響

如圖2所示，適宜提取溫度為30～40℃。在萃取時間2h、萃取壓力30MPa的條件下，萃取溫度為30℃時，絲綿木種子油脂的萃取率最高，為34.36%。

圖2 萃取溫度對油脂萃取率影響

2.2.3 萃取時間的影響

由圖3可知，萃取溫度為25℃、萃取壓力30MPa時，隨萃取時間的延長，萃取率呈增加的趨勢，萃取時間為2h時，萃取率趨于平緩，故選擇2h為最佳萃取時間。此條件下的種子油脂萃取率為39.18%。

圖3 萃取壓力對油脂萃取率影響

2.3 正交實驗優(yōu)化超臨界CO2萃取法的提取工藝

根據(jù)單因素實驗確定的最佳參數(shù)，以壓力35MPa、溫度30℃、萃取時間2h為最佳水平，前后各設(shè)置一個水平，設(shè)計了三因素三水平L9（33）正交實驗（表2），按正交實驗條件進行9次實驗，根據(jù)萃取率數(shù)據(jù)，確定最大的影響因素和實驗條件的最佳組合。

表2 絲綿木種子油脂萃取的正交實驗因素表

由表3 可知，壓力、溫度、萃取時間這3個參數(shù)中，極差最大的是萃取時間，為11.23，最小的是溫度，為3.32，因此，對絲綿木種子油脂萃取率的影響順序為：萃取時間＞壓力＞溫度。由極差分析結(jié)果可知，3個參數(shù)的最佳組合為A3B2C2，即壓力40MPa，溫度 30℃，萃取時間 2h。

表3 絲綿木種子油脂萃取正交實驗結(jié)果

2.4 最優(yōu)工藝條件的驗證

采用2.3中確定的最佳參數(shù)條件即壓力40 MPa，溫度30℃，萃取時間2h，對800g絲綿木種子進行超臨界提取，所得油脂為338.4g，相對于種子含油率42.3%，即種子油脂的提取率為96.6%。

2.5 粗油脂的純化

將超臨界CO2提取的200mL粗油脂進行脫膠、脫酸、水洗、脫水等處理，共獲得188.6g純化油脂，得率為94.3%。

2.6 不皂化物的提取制備

5g種子油脂樣品經(jīng)KOH-乙醇溶液皂化后，用正己烷對不皂化物進行萃取，乙醇進行洗滌，干燥后得到不皂化物0.0275g，得率為0.55%。

2.7 GC-MS分析絲綿木果油脂的成分

采用GC-MS聯(lián)用法對絲綿木種子油脂進行分析，其脂肪酸組成見表4。由表4和圖4可知，絲綿木油脂的脂肪酸組成主要為：棕櫚酸12.545%、亞油酸25.215%、油酸59.830%、硬脂酸2.410%，其中不飽和脂肪酸以油酸和亞油酸為主，達85.045%，屬于高單不飽和脂肪酸油類。

表4 絲綿木種子油脂脂肪酸組成

圖4 絲綿木油脂的GC-MS分析圖譜

2.8 絲綿木不皂化物的成分分析

采用GC-MS分析絲綿木種子油脂中的不皂化物，結(jié)果見表5。由表5和圖5可知，絲綿木種子油脂中的不皂化物主要以甾醇為主，包含有谷甾醇、豆甾醇和羊毛甾醇酯，總含量達2.259%，是一種富含甾醇的油脂，此外還含有數(shù)量可觀的角鯊烯。

圖5 絲綿木油脂中不皂化物的GC-MS分析圖譜

表5 絲綿木種子油脂不皂化物組成

3 結(jié)論

本研究中，絲綿木種子油脂的超臨界CO2提取工藝的最佳參數(shù)為：壓力40MPa，溫度30℃，萃取時間2h，此工藝適用于小批量樣品的提取。蔡艷[13]和汪昌國[14]報道的植物油脂的大規(guī)模提取壓力為25MPa甚至更低，在大規(guī)模提取時，要在提取得率和能耗之間進行權(quán)衡。從本研究的GC-MS分析結(jié)果可知，絲綿木種子油脂的脂肪酸組成主要為：棕櫚酸12.545%、亞油酸25.215%、油酸59.83%、硬脂酸2.41%，其中不飽和脂肪酸以油酸和亞油酸為主，達85.045%，屬于高單不飽和脂肪酸油類（high mono-unsaturated fatty acid，MUFA）。MUFA有明顯的降低膽固醇作用，其降低血清總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇方面的能力與多不飽和脂肪酸（PUFA)相同[15-16]。劉根生等人[17]報道，MUFA能夠正向調(diào)節(jié)血脂代謝，降低低密度脂蛋白膽固醇(LDL)的氧化敏感性，保護血管內(nèi)皮和降低血液高凝狀態(tài)。另外，含高單不飽和脂肪酸的特殊類型腸內(nèi)營養(yǎng)制劑能夠降低Ⅱ型糖尿病患者的血糖水平，尤其對餐后血糖水平的降低更加明顯，在臨床上比標準配方的營養(yǎng)制劑更適合于糖尿病患者的營養(yǎng)需求[18]。因此，絲綿木種子中的MUFA具有開發(fā)前景。

本研究中，絲綿木種子油脂中的不皂化物以甾醇為主，包含有谷甾醇、豆甾醇和羊毛甾醇酯，總含量達2.259%，是一種富含甾醇的油脂，此外，還含有數(shù)量可觀的角鯊烯。絲綿木種子油脂中含有較高水平的植物甾醇，尤其是谷甾醇含量高于普通植物油脂的平均含量。研究證明，植物甾醇和植物固烷醇對降低血液膽固醇水平有一定的效果[19-20]。此外，植物甾醇還有抗炎、退熱、美容、抗癌、促進動物生長等生理功效。植物甾醇在減肥和抗氧化兩方面有重要作用[21]。絲綿木在我國的種植范圍廣，果實產(chǎn)量高，綜合開發(fā)并利用絲綿木種子的油脂資源，在生物柴油、醫(yī)藥健康產(chǎn)品和飼料添加劑等方面將具有廣闊的前景。