種公牛包皮沖洗對(duì)精液中細(xì)菌數(shù)量影響的研究

鄧福金，周國(guó)權(quán)，李博平，杜學(xué)海

（遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧 沈陽(yáng) 110032）

精液中細(xì)菌數(shù)量是衡量牛冷凍精液質(zhì)量的一項(xiàng)重要指標(biāo)。我國(guó)牛冷凍精液國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，每劑量精液中細(xì)菌數(shù)不得超過(guò)800 個(gè)[1]。為達(dá)這一標(biāo)準(zhǔn)，必須嚴(yán)格把握采精環(huán)節(jié)。精液中產(chǎn)生細(xì)菌的主要原因?yàn)楣Ｉ称鞴偌膊?，也與采精、凍精生產(chǎn)過(guò)程有關(guān)。公牛包皮內(nèi)含大量腸球菌、葡萄球菌、大腸桿菌等，是公牛精液中細(xì)菌的主要來(lái)源[2]。精液中細(xì)菌數(shù)過(guò)多，不僅可造成精子活力降低、生存時(shí)間縮短，并且極易造成胚胎早期死亡，甚至引發(fā)母牛繁殖障礙[3]。采精時(shí)對(duì)公牛陰莖包皮的清洗至關(guān)重要[4]，若采精前沖洗包皮，可在一定程度上防止細(xì)菌污染[5]。但也有研究顯示，采精前不必為每頭公牛沖洗包皮，清洗不當(dāng)更可能傳播疾病[6]。因此，本研究在冬春兩季開(kāi)展采精前沖洗包皮對(duì)精液內(nèi)細(xì)菌數(shù)量變化影響的對(duì)比試驗(yàn)，以期為種公牛站精液生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

采精公牛來(lái)自遼寧省牧經(jīng)種牛繁育中心有限公司。

1.2 試劑與儀器

儀器：BCX-200包皮沖洗裝置，購(gòu)自日本富士平工業(yè)株式會(huì)社；IS4 型細(xì)管灌封噴碼一體機(jī)、ACCUCELL 精液密度測(cè)定儀、TMS-160MHS細(xì)管精液冷凍儀，均購(gòu)自法國(guó)IMV公司；DHP-9162恒溫培養(yǎng)箱，購(gòu)自北京永光明醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1D 超凈化工作臺(tái)，購(gòu)自蘇州凈化儀器廠；DZKW-D-5-6 恒溫水浴箱，購(gòu)自北京永光明醫(yī)療器械廠；YP-B2002 天平，購(gòu)自江蘇省常州萬(wàn)得天平儀器廠；LDZX-30KBS 電熱壓力蒸氣滅菌器，購(gòu)自上海申安醫(yī)療器械廠；細(xì)管剪，購(gòu)自法國(guó)IMV 公司。0.25 mL 細(xì)管、細(xì)管專用推針（自制）、平皿（直徑90 mm）、酒精燈、記號(hào)筆等。

試劑：Bioxcell 稀釋液（法國(guó)IMV 公司）、02-75營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（北京奧博星生物科技有限責(zé)任公司）、75%酒精。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)時(shí)間

選擇冬季（2020 年12 月—2021 年2 月）、春季（2021 年4月—6月）進(jìn)行。試驗(yàn)期共6個(gè)月。

1.3.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

14 頭種公牛，分對(duì)照組和試驗(yàn)組，每組選擇7 頭采精公牛。冬春兩季各開(kāi)展1次試驗(yàn)，每次試驗(yàn)每頭公牛重復(fù)檢測(cè)3 次，即每月進(jìn)行1 次檢測(cè)。對(duì)照組公牛采精前采用包皮沖洗機(jī)，約38 ℃溫水沖洗包皮及陰毛周圍污物，停留20 min，水滴淋干后進(jìn)行采精；試驗(yàn)組公牛采精前不沖洗包皮，牽入采精場(chǎng)直接采精。

1.3.3 凍精生產(chǎn)

凍精按照DB21/T 3006—2018 進(jìn)行[7]。精液采集后分別對(duì)其活力、密度、采精量進(jìn)行檢查；根據(jù)精液的活力、密度、每劑量有效精子數(shù)稀釋精液，常溫下灌裝，封口，4～5 ℃低溫柜中降溫、平衡3～4 h，低溫柜中碼簾上架，全自動(dòng)冷凍儀中冷凍。冷凍完成后，每頭牛抽取2支細(xì)管凍精進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.4 細(xì)菌檢測(cè)

超凈化工作臺(tái)內(nèi)點(diǎn)燃酒精燈，平皿標(biāo)記樣品編號(hào)。細(xì)管凍精37 ℃水浴解凍，酒精棉球擦拭整支細(xì)管，剪掉超聲波封口端，細(xì)管推針將整支細(xì)管的精液（0.18～0.20 mL）注入平皿；注入10～15 mL 保溫至46～50 ℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基至平皿，轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其與精液混合均勻，并做一空白對(duì)照。瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平板，（36±1）℃培養(yǎng)（48±2）h，平皿內(nèi)菌落數(shù)計(jì)數(shù)法參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB 4143—2008）。

式中：B為細(xì)菌數(shù)；n1為第一次試驗(yàn)樣品中細(xì)菌數(shù)；n2為第二次試驗(yàn)樣品中細(xì)菌數(shù)；n3為第三次試驗(yàn)樣品中細(xì)菌數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行初步處理，采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組內(nèi)差異采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間差異采用獨(dú)立樣本t 測(cè)驗(yàn)比較。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬季采集精液中細(xì)菌數(shù)量變化（見(jiàn)表1）

表1 冬季采集精液中細(xì)菌數(shù)量變化Tab.1 Changes in the number of bacteria in semen collected in winter 單位：個(gè)/支

由表1 可知，對(duì)照組細(xì)菌數(shù)量為1.7～10.3 個(gè)/支，組內(nèi)個(gè)體間細(xì)菌數(shù)量差異顯著；樣本2、6細(xì)菌數(shù)量顯著高于其他組（P＜0.05）。試驗(yàn)組細(xì)菌數(shù)量為2.0～12.7個(gè)/支，組內(nèi)個(gè)體間細(xì)菌數(shù)量差異顯著；樣本4的細(xì)菌數(shù)量顯著高于其他組（P＜0.05）。

試驗(yàn)結(jié)果表明，公牛沖洗包皮與否，組內(nèi)個(gè)體間細(xì)菌數(shù)量均存在較大差異。

2.2 春季采集精液中細(xì)菌數(shù)量變化（見(jiàn)表2）

表2 春季采集精液中細(xì)菌數(shù)量變化Tab.2 Changes in the number of bacteria in semen collected in spring 單位：個(gè)/支

由表2 可知，對(duì)照組細(xì)菌數(shù)量為0.3～3.3 個(gè)/支，組內(nèi)個(gè)體間細(xì)菌數(shù)量差異不顯著（P＞0.05）。試驗(yàn)組細(xì)菌數(shù)量為2.0～8.3 個(gè)/支，組內(nèi)個(gè)體間細(xì)菌數(shù)量差異顯著（P＜0.05）；樣本1、3細(xì)菌數(shù)量顯著低于其他組（P＜0.05）。

2.3 不同季節(jié)種公牛包皮沖洗與否對(duì)精液中細(xì)菌數(shù)量的

影響（見(jiàn)表3）

由表3可知，不同季節(jié)采精，對(duì)照組與試驗(yàn)組細(xì)菌數(shù)量均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。試驗(yàn)組平均細(xì)菌數(shù)量大于對(duì)照組，即不沖洗包皮采集精液中細(xì)菌數(shù)量多于沖洗包皮，但兩組的細(xì)菌數(shù)量均低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求。

表3 不同季節(jié)種公牛包皮沖洗與否對(duì)精液中細(xì)菌數(shù)量的影響Tab.3 Influence of washing foreskin of bulls in different seasons on the number of bacteria in semen 單位：個(gè)/支

3 討論

公牛包皮內(nèi)含大量細(xì)菌，采精時(shí)對(duì)公牛包皮沖洗與否可影響細(xì)菌的混入程度。本試驗(yàn)結(jié)果表明，種公牛采精前包皮沖洗與否對(duì)精液中細(xì)菌數(shù)量無(wú)顯著影響，與康年登等[8]、郝愛(ài)玲等[9]研究結(jié)果不一致。組內(nèi)個(gè)體間差異極顯著，但同一頭牛不同批次間差異不大，原因可能是不同的牛其包皮、陰筒、牛體衛(wèi)生等條件不同，而同一頭牛不同批次間在正常情況下其衛(wèi)生條件是相對(duì)穩(wěn)定的，此結(jié)果與陸漢希[10]研究結(jié)論一致。試驗(yàn)組與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異，說(shuō)明公牛包皮內(nèi)衛(wèi)生環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定，與包皮是否沖洗無(wú)顯著影響。公牛沖洗包皮與否，應(yīng)根據(jù)氣候環(huán)境、牛體衛(wèi)生、個(gè)體健康等情況考慮[11]。在氣候適宜的春、秋季節(jié)（夏季炎熱季節(jié)停采），公牛主要在室外活動(dòng)，在保證環(huán)境衛(wèi)生和牛體衛(wèi)生的情況下，不必沖洗所有公牛包皮；在氣候寒冷的冬季，公牛大部分時(shí)間在舍內(nèi)飼養(yǎng)，通風(fēng)條件差，空氣濕度大、有害氣多，牛體衛(wèi)生不便清潔，包皮和陰毛附著糞尿易滋生細(xì)菌，此時(shí)對(duì)公牛包皮的清洗至關(guān)重要。

自然交配時(shí)細(xì)菌可在公牛和母牛之間傳播，人工采集精液也不可能完全避免細(xì)菌污染。國(guó)家要求每頭牛每季度至少做一次凍精質(zhì)量檢測(cè)，細(xì)菌數(shù)是主要檢查項(xiàng)目之一。通過(guò)凍精質(zhì)量檢測(cè)報(bào)告，可動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)精液中細(xì)菌數(shù)變化情況；精液中細(xì)菌數(shù)量顯著增多、接近800個(gè)時(shí)，應(yīng)考慮沖洗公牛包皮。遼寧省牧經(jīng)種牛繁育中心日常檢測(cè)結(jié)果中，2/3 的樣品細(xì)菌數(shù)為0，可能與稀釋液中加入過(guò)多抗生素有關(guān)；極個(gè)別樣品中細(xì)菌數(shù)超過(guò)800 個(gè)/支，原因?yàn)椴删^(guò)程中公牛陰莖觸及不潔臺(tái)牛后軀，與公牛是否沖洗包皮無(wú)關(guān)。除非存在特別污染問(wèn)題，一般情況下不必對(duì)所有精液樣品作細(xì)菌培養(yǎng)，每隔4～6 個(gè)月隨機(jī)抽取20～30 個(gè)精液樣品作細(xì)菌檢查是適宜的做法，不僅保證精液質(zhì)量，還能夠發(fā)現(xiàn)公牛是否患病，改進(jìn)采精技術(shù)，改善衛(wèi)生條件。

公牛衛(wèi)生狀況好，精液污染的風(fēng)險(xiǎn)也隨之降低。因此，應(yīng)保持日常的環(huán)境與牛體衛(wèi)生。牛舍保持清潔干燥；堅(jiān)持每天刷拭牛體，夏季結(jié)合水刷，冬季干刷。定期修剪公牛陰毛，長(zhǎng)度以1.5～2.0 cm 為宜。若部分公牛包皮容易藏垢，則每次采精時(shí)必須沖洗干凈。采精前保持采精場(chǎng)所衛(wèi)生，地面灑水降塵，清潔公牛和臺(tái)牛體表的浮塵、污物，尤其對(duì)公牛下腹部、臺(tái)牛臀部進(jìn)行清洗，刷刨，達(dá)到全身被毛無(wú)污染、無(wú)灰土，保證牛群處于最佳采精的狀態(tài)。為需要沖洗包皮種公牛沖洗時(shí)，噴嘴不應(yīng)直接接觸陰毛和包皮，更不可將噴嘴伸入包皮內(nèi)，引起公牛包皮炎癥。無(wú)沖洗條件或清洗達(dá)不到要求的養(yǎng)殖場(chǎng)，則不提倡沖洗包皮；若沖洗不干凈反而會(huì)破壞包皮屏障功效，造成污染[12]。

4 結(jié)論

試驗(yàn)僅對(duì)公牛一個(gè)月內(nèi)不沖洗包皮采集的精液中細(xì)菌數(shù)變化進(jìn)行研究，但更長(zhǎng)時(shí)間的情況還需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。本次試驗(yàn)選擇14頭公牛，檢驗(yàn)樣本84頭份，精液中所含細(xì)菌數(shù)均遠(yuǎn)低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求的800 個(gè)/支。試驗(yàn)結(jié)果表明，在保證環(huán)境衛(wèi)生和牛體衛(wèi)生的條件下，種公牛采精前沖洗包皮與否對(duì)精液中細(xì)菌數(shù)無(wú)顯著影響。除非特殊需要，采精前不必為每頭公牛沖洗包皮，操作不當(dāng)可能增加傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)。