新型鵝細(xì)小病毒病研究進(jìn)展

劉明生，甘輝群，吳 雙，傅宏慶，鐘美娟

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

新型鵝細(xì)小病毒病是由新型鵝細(xì)小病毒（novel goos e parvovirus，NGPV）引起的一種病毒性傳染病，又稱短喙侏儒綜合征（short beak and dwarfism syndrome，SBDS），主要感染櫻桃谷北京鴨、番鴨、半番鴨等。新型鵝細(xì)小病毒病臨床可表現(xiàn)為短喙、舌頭外伸、腿骨易折斷、生長(zhǎng)發(fā)育受阻、死亡等，其病原除NGPV外，還包括新型番鴨細(xì)小病毒（novel muscovy duck parvovirus，NMDPV）、鴨圓環(huán)病毒（duck circovirus，DCV）等。

1971 年，法國(guó)率先報(bào)道了新型鵝細(xì)小病毒病，之后在我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)以及波蘭、匈牙利相繼出現(xiàn)相關(guān)報(bào)道[1-2]。2015年，我國(guó)福建、江蘇、山東等地區(qū)的一些商品肉鴨群中出現(xiàn)鴨喙變短、長(zhǎng)舌、生長(zhǎng)遲緩等癥狀的“鴨大舌病”，經(jīng)病原分離鑒定證實(shí)該病為新型鵝細(xì)小病毒病[3-4]。本文綜述新型鵝細(xì)小病毒的病原學(xué)特征、分子生物學(xué)特征、臨床診斷特征和檢測(cè)技術(shù)等方面的相關(guān)研究，以期為新型鵝細(xì)小病毒病的綜合防控提供技術(shù)支撐。

1 病原學(xué)特征

NGPV 屬細(xì)小病毒科（Parvoviridae）、細(xì)小病毒亞科（Parvovirinae）、依賴病毒屬（Dependovirus），為二十面體對(duì)稱的球形或六角形、無(wú)囊膜、單鏈DNA 病毒，直徑為20～25 nm[5-6]。與其他病毒相比，該病毒體積相對(duì)較小，結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單。NGPV 一般無(wú)法在PK-15、DF-1、BHK-21 等常用的細(xì)胞系上生長(zhǎng)增殖，但可采用鴨胚、鵝胚[7-8]或其原代成纖維細(xì)胞分離。病毒初期對(duì)鴨胚致死率低，一般需要盲傳幾代后才可導(dǎo)致鴨胚出現(xiàn)死亡；死亡時(shí)間多發(fā)生于接種病毒后96～120 h，表現(xiàn)為胚體頭頸部、胸腹部、腿部和翅下出血，病毒滴度（ELD50）可達(dá)10-5.5～10-4.2/0.2 mL[9-10]。賈婧宇等[8]從分離得到3 株NGPV，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3 種NGPV 均能夠在鵝胚中穩(wěn)定傳代，但致死鵝胚的時(shí)間明顯長(zhǎng)于經(jīng)典型鵝細(xì)小病毒（GPV）。

2 分子生物學(xué)特征

2.1 基因組結(jié)構(gòu)

NGPV的基因組序列約為5.1 kbp[5,7,10-11]。鄭肖強(qiáng)[12]分離得到的NGPV SDLC01 株基因組全長(zhǎng)5 006 bp，基因組兩側(cè)為末端重復(fù)序列（inverted terminal repeat，ITR），長(zhǎng)度約為444 個(gè)核苷酸（nucleotide，nt）。ITR 區(qū)含有大量核苷酸為4～10 bp的短小重復(fù)序列，利于病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄以及克隆載體拯救?；蚪M中間部分含左、右兩個(gè)開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF），ORF中間由18個(gè)堿基隔開(kāi)；其中，左側(cè)ORF 能夠編碼NS1 和NS2 非結(jié)構(gòu)蛋白，右側(cè)ORF則可編碼VP1、VP2和VP3等3種結(jié)構(gòu)蛋白。

非結(jié)構(gòu)蛋白NS1，又稱為Rep1 蛋白，是在NGPV 病毒粒子復(fù)制早期時(shí)產(chǎn)生的一種具有調(diào)節(jié)作用的磷酸化蛋白，參與病毒的DNA 復(fù)制、誘導(dǎo)細(xì)胞的病理變化以及基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控等[13]；含有ATP酶活性結(jié)合點(diǎn)、4個(gè)保守的解旋酶活性堿基，具有與ATP 結(jié)合或與DNA 定向結(jié)合并切割等多種生物學(xué)功能[14]。

非結(jié)構(gòu)蛋白NS2，又稱為Rep2蛋白。NGPV分離株的NS2基因核苷酸與GPV分離株同源性很高，對(duì)細(xì)小病毒的毒力無(wú)太大影響[12]。但NS2 蛋白能夠增強(qiáng)NS1 蛋白的細(xì)胞毒性作用，與病毒DNA的合成、增殖以及蛋白質(zhì)的有效合成有關(guān)[15]。Cotmore 等[16]發(fā)現(xiàn)，缺失NS2基因的病毒在合成病毒衣殼蛋白時(shí)影響病毒的組裝。

結(jié)構(gòu)蛋白是病毒衣殼的組成成分，包括VP1、VP2、VP3，長(zhǎng)度分別為2 199、1 764 和1 605 bp[12]。結(jié)構(gòu)蛋白具有各自的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，但具有共同的轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。其中，VP1結(jié)構(gòu)蛋白影響病毒的感染過(guò)程；VP2結(jié)構(gòu)蛋白參與病毒顆粒的細(xì)胞核輸出，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體；VP3含有細(xì)小病毒主要的抗原決定簇，構(gòu)成鵝細(xì)小病毒的保護(hù)性抗原，是細(xì)小病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白[17]，參與病毒感染宿主細(xì)胞環(huán)節(jié)。

曹旭陽(yáng)[14]采用PCR擴(kuò)增NGPV的VP3基因，連接至原核表達(dá)載體pCold-TF，轉(zhuǎn)化入E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞，高效表達(dá)重組蛋白VP3，采用Western blot和間接免疫熒光進(jìn)行鑒定，表明重組蛋白VP3可與新型鵝細(xì)小病毒的特異單抗發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。

2.2 核苷酸序列

2015 年，NGPV 引起SBDS 發(fā)病。不同NGPV 的分離株間全基因序列相似性為99.2%～99.7%，與經(jīng)典的鵝細(xì)小病毒（GPV）核苷酸同源性達(dá)92%以上，與番鴨細(xì)小病毒（MDPV）核苷酸同源性普遍低于90%[8,11,18-20]。賈婧宇等[8]分離得到的3 株NGPV 基因組的同源性為98.9%～99.7%，與經(jīng)典GPV強(qiáng)毒株的同源性為95.2%～96.1%。

李琦等[10]對(duì)分離的新型番鴨細(xì)小病毒DS15株進(jìn)行全基因序列分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，新型番鴨細(xì)小病毒DS15 株與NGPV SDLC01 株同源性為99.8%，與其他GPV 同源性達(dá)92.6%～97.2%，與番鴨MDPV 同源性為81.2%～85.4%。葛志琪[11]對(duì)分離的NGPV 四川株SC16株進(jìn)行基因組核苷酸同源性分析，結(jié)果顯示，NGPV 四川株SC16 株與SDLC01及QH15 株的同源性均高達(dá)99%。吳蓓[18]分離的NGPV DZ-01株的全基因組序列與其他NGPV相比，其同源性達(dá)99.3%～100.0%，其中，DZ-01 與QH15 株、SDLC01 株同源性分別為99.7%和100.0%；與MDPV 相比，同源性最高僅為85.0%。

殷冬冬等[19]分離鑒定了1 株NGPV AH-D15 株，對(duì)其VP3基因進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AH-D15株核苷酸同源性與經(jīng)典GPV相比，同源性達(dá)93.3%～96.5%，親緣關(guān)系較近；與MDPV 同源性為81.6%～81.7%，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。寧康[20]通過(guò)對(duì)11份NGPV 陽(yáng)性樣品基因序列分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)于443 bp的VP1和495 bp的VP3區(qū)，其所測(cè)毒株間的核苷酸序列同源性均達(dá)100%，與經(jīng)典GPV 毒株核苷酸同源性分別為95%～99%和96%～99%。

2.3 NGPV關(guān)鍵突變位點(diǎn)分析

賈婧宇等[8]基于3 株NGPV 與已發(fā)表的NGPV 毒株和經(jīng)典GPV 強(qiáng)毒株的編碼蛋白比對(duì)分析顯示，與國(guó)內(nèi)經(jīng)典GPV強(qiáng)毒株相比，NGPV毒株結(jié)構(gòu)蛋白VP1共產(chǎn)生了16個(gè)氨基酸點(diǎn)突變，其中9個(gè)氨基酸位點(diǎn)與歐洲的B株相同；非結(jié)構(gòu)蛋白R(shí)ep1 則產(chǎn)生了12 個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變，上述特征性氨基酸位點(diǎn)可能與GPV 從感染鵝轉(zhuǎn)向感染新宿主櫻桃谷鴨相適應(yīng)。寧康[20]研究表明，北京鴨源GPV的非編碼區(qū)存在堿基突變和插入或缺失，但對(duì)結(jié)構(gòu)形成無(wú)影響；NS蛋白編碼區(qū)含9個(gè)共性氨基酸突變，可能與GPV對(duì)北京鴨的致病性有關(guān)；VP1蛋白含5個(gè)共性氨基酸突變，但這些突變均遠(yuǎn)離可能的受體吸附位點(diǎn)，不影響病毒與受體的結(jié)合。

3 臨床診斷特征

3.1 流行病學(xué)

NGPV 的易感動(dòng)物主要包括3 周齡以內(nèi)的櫻桃谷鴨、北京鴨、半番鴨、高郵鴨、臺(tái)灣白鴨與金定鴨等肉鴨，發(fā)病率為10%～30%，部分品種可高達(dá)50%；自然感染病死率一般低于5%，人工感染病死率則可達(dá)25%。NGPV能夠通過(guò)接觸傳播和垂直傳播，病毒廣泛存在于鴨心、肝、脾、肺、腎等器官。

傅宏慶等[6]證實(shí)，NPGV可感染高郵鴨、金定鴨與蘇郵1 號(hào)鴨，發(fā)病率100%，死亡率10%～25%。吳蓓[18]研究表明，可從感染NGPV 的患鴨的心、肝、脾、肺、腎、胸腺、胰腺、膽汁、法氏囊等9個(gè)臟器中檢出病毒，病毒核酸檢出率最低為肺臟（15.0%），最高為心臟（82.5%），平均檢出率為45.0%；鴨群的陽(yáng)性檢出率為62.5%～100.0%，平均檢出率達(dá)82.5%。寧康[20]采集了來(lái)自不同地區(qū)8 個(gè)孵化場(chǎng)的1 日齡北京鴨樣品40份，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)GPV陽(yáng)性樣品為35份，陽(yáng)性率達(dá)87.5%，結(jié)果表明，NGPV病毒可經(jīng)卵垂直傳播。

3.2 臨床癥狀

櫻桃谷鴨、北京鴨等商品肉鴨感染NGPV 后，患鴨表現(xiàn)鴨喙短縮、舌頭外伸、脛骨變脆、跛行癱瘓、生長(zhǎng)遲緩、體重減輕、腹瀉拉稀及腿翅易斷等。NGPV可造成患鴨采食困難，料重比增加，降低養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益[3]。NGPV發(fā)病率與日齡存在一定關(guān)系，發(fā)病鴨群日齡越小，發(fā)病率越高。

陳浩等[3]將分離鑒定的NGPV SDLC01 株感染1 日齡雛鴨，結(jié)果表明，GPV SDLC01 毒株可引起患鴨上下喙萎縮、舌頭外伸、體溫升高、排白色或黃白色稀便，部分患鴨出現(xiàn)運(yùn)步困難、跛行或癱瘓等癥狀；發(fā)病率5%～20%，嚴(yán)重者高達(dá)40%，但患鴨病死率較低；患病鴨日齡多為13～40 d，體重減輕20%～30%，嚴(yán)重者可減輕50%。劉榮昌等[5]測(cè)量患病的3個(gè)半番鴨群與同場(chǎng)的外觀正常鴨的體重、喙長(zhǎng)、喙寬，結(jié)果顯示，與正常鴨相比，發(fā)病鴨體重減輕49%，喙長(zhǎng)縮短32%，喙寬縮短22%。

李琦等[10]使用鴨胚傳代尿囊液接種雛鴨，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雛鴨表現(xiàn)喙變短、舌頭外伸的臨床癥狀。袁萬(wàn)哲等[21]以口服和肌肉注射的方法，將分離鑒定的SD1株病毒的第5代尿囊液分別接種于10日齡的北京4系與櫻桃谷肉鴨，結(jié)果表明，感染組鴨群出現(xiàn)體重減輕、脛骨較脆等癥狀，部分櫻桃谷肉鴨表現(xiàn)喙萎縮、舌頭外伸等癥狀，并能夠從感染組鴨群的心、肝、脾、肺、腎、胸腺、舌中檢出鴨細(xì)小病毒。張錦玥[22]采用肌肉注射的方法，將分離鑒定的NGPV SD15株接種于40只1日齡櫻桃谷鴨，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，感染6 w后，感染組鴨的體重減輕18.5%，喙長(zhǎng)縮短10.7%。

3.3 病理變化

患病鴨通常表現(xiàn)為上下喙短縮，舌頭僵硬而不靈活，可向外伸出1～3 cm?；鉴喒趋腊l(fā)育異常，全身骨質(zhì)疏松、骨質(zhì)脆弱，容易斷裂；胸腺萎縮,出現(xiàn)散在的針尖狀出血；心肌出現(xiàn)少量出血點(diǎn)，肝臟輕微出血，患鴨胸腺髓質(zhì)的胸腺小體出血，胸腺皮質(zhì)出血少見(jiàn)，心肌顆粒變性，骨骼肌出血，肌纖維斷裂，發(fā)凝固性壞死，肝細(xì)胞呈水泡變性[5]。

陳浩等[3]光學(xué)顯微鏡下觀察了短喙長(zhǎng)舌綜合征患鴨的舌、胸腺、腎臟等器官的組織病理學(xué)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，患鴨舌間質(zhì)性炎癥，結(jié)締組織基質(zhì)疏松、水腫，胸腺水腫，胸腺髓質(zhì)淋巴細(xì)胞與網(wǎng)狀細(xì)胞散在性壞死，存在大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，組織間質(zhì)出血，腎小管上皮細(xì)胞崩解凋亡，管腔狹小、水腫，間質(zhì)出血，并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。張錦玥[22]通過(guò)HE 染色觀察組織病理學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)感染組鴨的肝細(xì)胞輕度水腫、空泡變性，脾臟髓質(zhì)區(qū)脾小體明顯減少，淋巴細(xì)胞明顯減少。張欣欣[23]研究發(fā)現(xiàn)，鴨感染鴨源新型鵝細(xì)小病毒可造成腸絨毛嚴(yán)重受損、肝細(xì)胞變形壞死，腎小管呈空泡化。

4 檢測(cè)技術(shù)

新型鵝細(xì)小病毒的檢測(cè)方法為核酸探針檢測(cè)方法、半套式PCR、套式PCR、熒光定量PCR、實(shí)時(shí)等溫環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增方法、間接ELISA方法等。

鄭肖強(qiáng)[12]建立了地高辛標(biāo)記核酸探針檢測(cè)方法，該法敏感性好，最低檢測(cè)量為25 pg，與其他常見(jiàn)鴨源病毒無(wú)雜交反應(yīng)，特異性強(qiáng)。高莎莎[24]建立了半套式PCR 檢測(cè)方法，對(duì)鵝細(xì)小檢測(cè)陽(yáng)性的病料進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證，結(jié)果表明，半套式PCR 檢測(cè)法的檢出率為73.3%～93.3%。Li 等[25]建立了雙重半巢式PCR檢測(cè)方法，可同時(shí)鑒別檢測(cè)經(jīng)典鵝細(xì)小病毒和新型鵝細(xì)小病毒。周潔文等[26]建立了檢測(cè)新型鴨細(xì)小病毒SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法，結(jié)果顯示，在5.17×101～5.17×107copies 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2為0.999、斜率為3.595，靈敏度可達(dá)5.17 copies。

曹旭陽(yáng)等[27]建立了TaqMan 熒光定量PCR 方法，結(jié)果表明，此方法檢測(cè)敏感性達(dá)37.2 copies/μL，與常規(guī)PCR 相比，靈敏度高100倍，具有良好的特異性，批內(nèi)和批間的檢測(cè)變異系數(shù)均不大于2.2%；對(duì)收集的50份病料進(jìn)行檢測(cè)，熒光定量PCR方法NGPV檢出率為78%，普通PCR方法為50%。Yang等[28]建立了實(shí)時(shí)等溫環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增方法，結(jié)果表明，該法靈敏度高，最低檢出量為100 copies，是普通PCR靈敏度的100倍。

王燕[29]建立了基于VP3 蛋白檢測(cè)新型GPV 抗體的間接ELISA方法，研究表明，該法有高靈敏度和特異性，待測(cè)血清10 240 倍稀釋后仍可檢出GPV 特異性抗體。劉銘等[30]建立了間接ELISA方法，其檢測(cè)臨界值為0.445，該方法具有較好的特異性、敏感性和重復(fù)性，臨床樣品的陽(yáng)性檢出率為93.3%。

5 防控技術(shù)

目前尚無(wú)針對(duì)SBDS 的商品疫苗，本病的防控主要依靠對(duì)1～7日齡雛鴨注射小鵝瘟卵黃抗體，但并不具有良好的預(yù)防、治療作用。

劉銘等[31]采用自制的新型鴨細(xì)小病毒（SD株）疫苗免疫蛋雞，采用水稀釋-硫酸銨二次沉淀法制備了大量純凈的卵黃抗體，效價(jià)達(dá)1∶10 000，為新型鴨細(xì)小病毒病的防治提供了新思路。有研究人員采用傳統(tǒng)鴨胚或鴨胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)病毒制備滅活疫苗，通過(guò)免疫種鴨的方式使雛鴨獲得母源抗體[32]。與抗體產(chǎn)品相比，該產(chǎn)品保護(hù)率高、母源抗體持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，僅免疫母鴨可節(jié)約勞動(dòng)力和成本，具有一定優(yōu)勢(shì)。但全病毒滅活疫苗開(kāi)發(fā)難度較大、成本高，更適宜的防治方式仍有待探索。

6 結(jié)論

新型鵝細(xì)小病毒病的臨床表現(xiàn)以短喙、舌頭外伸、腿骨易折斷、生長(zhǎng)發(fā)育受阻和死亡為特征，其病原為NGPV，與經(jīng)典的GPV核苷酸同源性達(dá)92%以上。目前尚無(wú)針對(duì)新型鵝細(xì)小病毒病的特效療法，對(duì)該病的防治仍迫切需要研制保護(hù)率高、成本低、生物安全風(fēng)險(xiǎn)小且副反應(yīng)少的生物制品。