尿道致病性大腸桿菌臨床分離株種系分型、毒力基因型及生物被膜表型分析

楊 進(jìn), 高清清, 顧 曉, 孫東瑞, 林 月, 李翠蓉

(1.揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 泌尿外科, 江蘇 揚(yáng)州, 225001; 2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚(yáng)州, 225009;3.揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)科, 江蘇 揚(yáng)州, 225001; 4.揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 超聲科, 江蘇 揚(yáng)州, 225001)

尿道致病性大腸桿菌(UPEC)是尿路感染最主要的致病菌，能夠造成80%～90%的社區(qū)感染和30%～50%的醫(yī)源性感染[1-2]。UPEC感染機(jī)制復(fù)雜，能夠利用一系列毒力因子發(fā)揮致病性，常見的毒力因子有黏附素、鐵攝取系統(tǒng)、細(xì)胞毒素以及毒力島等。UPEC借助這些毒力因子黏附并定植于宿主細(xì)胞，在尿道及其他腸道外環(huán)境中存活繁殖，分泌細(xì)胞毒素?fù)p傷宿主細(xì)胞，導(dǎo)致尿道感染等多種腸道外感染[3-5]。此外, UPEC生物被膜形成能力在感染過程中也發(fā)揮著重要作用[6]。生物被膜是細(xì)菌黏附于介質(zhì)表面，分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂質(zhì)蛋白等成分，包裹菌體形成的大量細(xì)菌聚集膜樣物[7]。生物被膜是細(xì)菌為適應(yīng)宿主內(nèi)環(huán)境而采取的一種生存策略，能夠阻斷機(jī)體分泌的抗菌肽、抗生素以及免疫細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的殺傷作用。生物被膜中也存在著一些抗生素滅活酶如β-內(nèi)酰胺酶，從而增強(qiáng)了細(xì)菌的耐藥性。了解UPEC臨床分離株的生物被膜形成能力以及毒力基因分布情況，對(duì)于明確菌株致病力進(jìn)而采取有效防控措施具有重要意義。本研究檢測(cè)UPEC臨床分離株的種系分型、毒力基因分布及生物被膜形成能力，并分析三者間的關(guān)聯(lián)性，旨在為UPEC分子流行病學(xué)特點(diǎn)、致病機(jī)制的研究以及臨床防控措施的制訂提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

采集2019年10月—2020年11月?lián)P州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院收治的臨床尿路感染患者的尿樣進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，對(duì)菌落計(jì)數(shù)>105CFU/mL的樣品再進(jìn)行挑選，挑取疑似大腸桿菌的粉紅色菌落進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，經(jīng)微生物及蛋白快速鑒定質(zhì)譜儀(MALDI Biotyper)鑒定出UPEC分離株。

1.2 試劑與耗材

聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)預(yù)混液(2×Taq PCR Master Mix-Vazyme), 100 bp DNA標(biāo)記物(100 bp DNA Marker-TakaRa), 西班牙瓊脂糖(Biowest); 乙二胺四乙酸(EDTA)、結(jié)晶紫、麥康凱培養(yǎng)基、胰酶大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基、聚苯乙烯96孔板，購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 PCR引物

參考ZHAO L X等[8]研究設(shè)計(jì)，分別設(shè)計(jì)大腸桿菌種系分型和毒力基因檢測(cè)引物(由上海生工生物工程有限公司合成)，見表1。

表1 PCR擴(kuò)增基因引物信息

1.4 種系分型檢測(cè)

利用多重PCR方法檢測(cè)UPEC分離株的chuA、yjaA基因以及DNA片段TspE4.C2, 根據(jù)三者的檢測(cè)結(jié)果判定分離株的種系分型[9]。種系分型標(biāo)準(zhǔn):chuA(+)、yjaA(+)和TspE4.C2(+/-)菌株屬于B2型;chuA(+)、yjaA(-)和TspE4.C2(+/-)屬于D型;chuA(-)、yjaA(+/-)和TspE4.C2(+)屬于B1型;chuA(-)、yjaA(+/-)和TspE4.C2(-)屬于A型。

1.5 毒力基因檢測(cè)

利用PCR對(duì)UPEC分離株的9個(gè)毒力基因進(jìn)行檢測(cè)，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系: 2×Taq Mix PCR 反應(yīng)液12.5 μL, 0.2 mmol/L上下游引物各1 μL, 菌液模板2 μL, 最后補(bǔ)加滅菌超純水至25 μL終體積，混勻后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件: 94 ℃預(yù)變性4 min; 94 ℃ 1 min, 55 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min, 25個(gè)循環(huán); 72 ℃ 10 min。各取10 μL PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中90 V電壓下電泳1 h, 于紫外光下觀察結(jié)果。

1.6 生物被膜檢測(cè)

參考JAVED S等[9]和夏樂[10]的結(jié)晶紫染色生物被膜檢測(cè)方法，挑取各菌株單菌落至LB液體培養(yǎng)基過夜振蕩培養(yǎng)，次日取100 μL母液加至10 mL LB液體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速220 轉(zhuǎn)/min, 37 ℃溫度下振搖培養(yǎng)至600 nm波長(zhǎng)處光密度(OD)值約為0.2。于96孔培養(yǎng)板中每孔加入200 μL菌液，每株菌株重復(fù)3個(gè)樣，放入37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h后，小心棄去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗掉浮游菌，自然風(fēng)干，加入0.1%結(jié)晶紫染液室溫染色30 min, PBS清洗自然風(fēng)干后加入95%酒精200 μL脫色10 min, 脫色液用酶標(biāo)儀測(cè)定595 nm處OD值?？字屑尤?00 μL培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。

生物被膜形成能力判定標(biāo)準(zhǔn): 將陰性對(duì)照平均OD值加上其3倍的標(biāo)準(zhǔn)差定義為臨界值ODc。以臨界值ODc為基準(zhǔn)，菌株生物被膜可以分成無(wú)形成能力(-)(OD值≤ODc)、弱形成能力(+)(OD值>ODc～2 ODc)、中等形成能力()(OD值>2 ODc～4 ODc)和強(qiáng)形成能力()(OD值>4 ODc)。

2 結(jié) 果

2.1 UPEC的分離鑒定結(jié)果

采集182例有泌尿系統(tǒng)感染癥狀患者的尿樣，取10 μL無(wú)菌涂布于麥康凱培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng), 24 h后進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示, 61例患者尿樣的細(xì)菌計(jì)數(shù)≥105CFU/mL, 說明存在尿路細(xì)菌感染。挑取麥康凱培養(yǎng)基上疑似大腸桿菌的粉紅色菌落進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，經(jīng)鑒定共獲得42株UPEC分離株。

2.2 種系分型檢測(cè)結(jié)果

按照大腸桿菌種系分型鑒定方法，利用PCR檢測(cè)chuA、yiaA和TspE4.C2在UPEC分離株中的分布情況，根據(jù)3種基因的分布組合確定菌株的種系分型。結(jié)果顯示, UPEC分離株種系分型以B2型為主(占40.5%), 其次為D型(占31.0%), 而B1型和A型分別占16.7%和11.9%, 見表2。

表2 42株UPEC分離株種系分型檢測(cè)結(jié)果[n(%)]

2.3 毒力基因檢測(cè)結(jié)果

42株UPEC分離株的9種毒力基因檢測(cè)結(jié)果顯示, 92.9%的分離株攜帶Ⅰ型菌毛編碼基因fimH基因，分別有90.5%、66.7%和76.2%的分離株攜帶tonB、ireA和fyuA基因; 在受檢的3種毒素相關(guān)基因中，編碼細(xì)胞壞死因子的cnf-1基因檢出率最高(52.4%), 溶血素基因hlyD和空泡化毒素基因vat的檢出率分別為21.4%和28.6%; 其余毒力基因ompR和phoU的檢出率均低于30.0%。對(duì)42株UPEC分離株的毒力基因攜帶數(shù)量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn), 9株菌株攜帶6種以上毒力基因(其中4株菌株同時(shí)攜帶8種毒力基因), 5株菌株攜帶毒力基因數(shù)量少于3種，其余28株菌株攜帶的毒力基因數(shù)量為3～6種，表明所分離的UPEC菌株攜帶毒力基因數(shù)量普遍較多，提示臨床分離株的致病性較強(qiáng)，見表3。

表3 42株UPEC分離株中毒力基因檢出結(jié)果

2.4 生物被膜檢測(cè)結(jié)果

通過結(jié)晶紫染色法對(duì)UPEC生物被膜形成能力進(jìn)行定量分析，測(cè)定OD595 nm值反映菌株生物被膜形成能力。結(jié)果顯示，所有受檢菌株均能生成生物被膜，其中生物被膜具有強(qiáng)形成能力()的菌株有16株(占38.1%), 生物被膜具有中等形成能力()的菌株有15株(占35.7%), 生物被膜具有弱形成能力(+)的菌株有11株(占26.2%)。

2.5 生物被膜形成能力與種系分型之間的關(guān)系

進(jìn)一步分析UPEC分離株生物被膜形成能力與其種系分型之間的關(guān)聯(lián)發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)B2型和D型菌株都具有強(qiáng)或中等生物被膜形成能力，而B1型和A型菌株主要表現(xiàn)為弱生物被膜形成能力，表明UPEC菌株的生物被膜形成能力與其種系分型存在一定關(guān)聯(lián)，見表4。

表4 UPEC不同種系分型菌株的生物被膜形成分布情況

2.6 生物被膜形成與毒力基因型之間的關(guān)系

UPEC強(qiáng)生物被膜形成能力菌株所攜帶的毒力基因數(shù)量大多在5種以上，而弱生物被膜形成能力菌株所攜帶的毒力基因數(shù)量一般低于4種。強(qiáng)生物被膜形成能力菌株中fimH、tonB和ireA基因的檢出率高于弱生物被膜形成能力菌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 提示這些毒力基因在生物被膜形成過程中發(fā)揮著重要作用，見圖1。

圖1 不同生物被膜形成能力菌株中毒力基因分布情況

3 討 論

UPEC引起的尿道感染是臨床最常見的細(xì)菌性疾病之一，嚴(yán)重威脅患者健康。不同基因型、血清型以及毒力型的UPEC菌株分布廣泛，造成復(fù)雜的臨床病型，增加了防治難度。UPEC的致病作用很大程度上依賴于其攜帶的毒力因子，如黏附素、攝鐵系統(tǒng)、外毒素和生物被膜等。這些毒力因子協(xié)助UPEC定植黏附、入侵宿主細(xì)胞，抵抗壓力應(yīng)激、免疫逃逸，造成組織細(xì)胞損傷，從而引發(fā)尿道感染[11]。及時(shí)有效的治療對(duì)于控制尿道感染至關(guān)重要，但前提是充分了解UPEC臨床菌株的生物學(xué)特征，如基因型、毒力基因分布和生物被膜形成能力等。

種系分型是腸道外大腸桿菌分子流行病學(xué)的重要特征，根據(jù)TspE4.C2、yjaA、chuA這3個(gè)基因的不同組合，可以將大腸桿菌分為A型、B1型、B2型和D型這4個(gè)種系分型。chuA編碼外膜血紅素受體，參與血紅素轉(zhuǎn)運(yùn);yjaA編碼基因負(fù)責(zé)細(xì)胞對(duì)過氧化氫和酸應(yīng)激反應(yīng);TspE4.C2編碼脂肪酶酯酶。EWERS C等[12]和張德寶[13]分析不同來(lái)源的UPEC菌株種系分型發(fā)現(xiàn), 61.5%和21.5%的菌株分別屬于B2和D型。RODRIGUEZ-SIEK K E等[14]分離的200株UPEC中, 130株為B2型, 37株為D型。本研究42株UPEC分離株中, B2和D型分離株分別為17株和13株，合計(jì)占分離株總數(shù)的71.4%, 與國(guó)外報(bào)道[12, 14]結(jié)論一致，表明不同地區(qū)、不同來(lái)源的UPEC分離株的種系分型均以B2型和D型為主。

本研究檢測(cè)了9種與UPEC致病性密切相關(guān)的毒力基因，這些毒力基因?qū)PEC在泌尿道的定植和感染中起著重要作用。檢測(cè)結(jié)果顯示，幾乎所有UPEC分離株(90%以上)都攜帶黏附素基因fimH和攝鐵相關(guān)基因tonB, 提示黏附定植和鐵攝取在UPEC抵御尿液沖刷以及適應(yīng)尿液貧鐵內(nèi)環(huán)境至關(guān)重要; 其他毒力基因如鐵載體ireA(66.7%)、耶爾森毒力島基因fyuA(76.2%)和毒素相關(guān)基因cnf-1(52.4%)的檢出率也相對(duì)較高，表明UPEC臨床分離株毒力基因分布較廣，具有較強(qiáng)的致病性。

UPEC的生物被膜形成能力與其引發(fā)的尿道感染密切相關(guān)。UPEC形成生物被膜后可黏附于泌尿道上皮細(xì)胞或?qū)蚬鼙?，在分泌的多糖基質(zhì)、蛋白的保護(hù)下，抵御抗菌藥物和免疫細(xì)胞的殺傷作用。本研究中所有受檢菌株均能生成生物被膜，但形成能力強(qiáng)弱有所差異，其中大多數(shù)強(qiáng)生物被膜形成能力菌株屬于B2型。強(qiáng)生物被膜形成能力菌株所攜帶的毒力基因數(shù)量多于弱生物被膜形成能力菌株，且fimH、tonB和ireA基因的檢出率顯著高于弱生物被膜形成能力菌株，提示這些毒力基因在生物被膜形成過程中發(fā)揮著重要作用。菌株的強(qiáng)生物被膜形成能力可能與其攜帶強(qiáng)毒力島以及表達(dá)更多的毒力基因有關(guān)，如黏附素、表面親水性蛋白、鐵攝取復(fù)合物以及外毒素。另外, B2型菌株也是造成持續(xù)性尿路感染最常見的毒力克隆群，這可能與其具有較強(qiáng)的生物被膜形成能力有關(guān)。

綜上所述, UPEC臨床分離株生物被膜形成能力與其種系分型和毒力基因分布具有一定關(guān)聯(lián)性，這可以為更好地理解生物被膜形成和開發(fā)針對(duì)性治療方法提供參考。