邯鄲地區(qū)規(guī)?；鰻倥ｋ[孢子蟲感染情況調(diào)查

龐維鵬，施宇博，錢常歡，孔 博，李亞琪，方素芳，崔 平

（河北北方學(xué)院動物科技學(xué)院，河北 張家口 075000）

隱孢子蟲病是一種由隱孢子蟲引起的人畜共患原蟲病[1]。目前，已有37個隱孢子蟲的有效種得到鑒定。牛可感染4個有效種：牛隱孢子蟲、瑞氏隱孢子蟲、微小隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲[2-4]。安氏隱孢子蟲于胃內(nèi)寄生，其余3種隱孢子蟲則寄生于腸道[5]，上述隱孢子蟲均可引起腸和胃黏膜損傷，降低胃腸道吸收功能，進(jìn)而導(dǎo)致腹瀉。隱孢子蟲被認(rèn)為是全球水媒和食源性腹瀉疾病暴發(fā)的常見原因[6-7]。因此，隱孢子蟲的防治尤為重要。國內(nèi)關(guān)于隱孢子蟲流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，同一奶牛場內(nèi)斷奶前犢牛感染率高于其他年齡段奶牛[8-9]。犢牛感染隱孢子蟲的主要表現(xiàn)為精神沉郁、厭食和腹瀉，嚴(yán)重可導(dǎo)致死亡；糞便呈灰白色或黃褐色，含有大量纖維素、血液和黏液，后期呈透明水樣糞便[10]。

為全面準(zhǔn)確地調(diào)查邯鄲市地區(qū)奶牛隱孢子蟲感染的種類和流行病學(xué)情況，本試驗(yàn)以邯鄲5 個縣（區(qū)）養(yǎng)殖場的犢牛為研究對象，通過分析邯鄲不同地區(qū)和不同月齡犢牛感染隱孢子蟲的感染情況，評價隱孢子蟲對邯鄲地區(qū)犢牛的影響，為控制隱孢子蟲病的傳播情況提供參考，對邯鄲市地區(qū)畜禽的健康具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2020 年1 月至5 月，從邯鄲5 個縣（區(qū)）的養(yǎng)殖場隨機(jī)采集犢牛的新鮮糞便400份（成安縣、魏縣、臨漳縣以及邯山區(qū)、肥鄉(xiāng)區(qū)各80 份）。其中0～3 月齡犢牛糞便樣品數(shù)量為240 份，4～6 月齡犢牛糞便樣品數(shù)量160 份，每份樣品10～50 g，密封編號，4 ℃保存。

1.2 儀器與試劑

主要儀器：LXJ-IIZ自動脫蓋離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、XSP-00 光學(xué)顯微鏡（寧波湛京光學(xué)儀器有限公司）、電子秤（上海赫爾普國際貿(mào)易有限公司）、玻璃棒、離心管、60 目銅篩和120 目銅篩、酒精燈、自制鐵絲環(huán)、載玻片、蓋玻片、密封袋、馬克筆、一次性塑料滴管等。

主要試劑：飽和蔗糖溶液（1 000 g 蔗糖∶640 mL 蒸餾水）、石炭酸品紅染色液、3%鹽酸酒精、2%孔雀綠染液、2.5%重鉻酸鉀溶液（2.5 g重鉻酸鉀∶1 L蒸餾水）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 隱孢子蟲的收集

采用飽和蔗糖溶液漂浮法，每份被檢糞便樣品取10～50 g，按1∶6 比例加入自來水，攪拌均勻，經(jīng)60 目和120目銅篩兩遍過濾，3 600 r/min離心5 min，棄去上清液，將沉淀物加入飽和蔗糖溶液（1∶1），攪拌均勻后3 600 r/min離心5 min，卵囊漂浮于上層。吸取表層液于離心管，加入適量的自來水，3 600 r/min 離心5 min，沉淀物即為隱孢子蟲，保存于2.5%重鉻酸鉀溶液。

1.3.2 改良抗酸染色法及蟲種鑒定

因隱孢子蟲卵囊較小，若直接涂片，卵囊檢出率極低，故采用改良抗酸染色法進(jìn)行卵囊染色。蘸取上層液移于載玻片上，加石炭酸復(fù)紅染液2～3滴進(jìn)行首次染色，緩慢加熱約5 min，水洗；以3%鹽酸酒精脫色1～3 min，水洗；2%孔雀綠復(fù)染液染色約1 min，蒸餾水洗滌后以吸水紙吸干，1 000倍油鏡下觀察卵囊。測量100個卵囊的長寬徑值，結(jié)合形態(tài)特征鑒定蟲種。

2 結(jié)果與分析

2.1 邯鄲地區(qū)不同地點(diǎn)犢牛隱孢子蟲的感染率（見表1）

由表1 可知，邯鄲地區(qū)不同地點(diǎn)犢牛隱孢子蟲病的平均感染率為5.75%（23/400）。由于縣（區(qū)）牛場環(huán)境和地理位置存在一定差別，犢牛隱孢子蟲病感染率有所不同；其中邯山區(qū)隱孢子蟲病感染率最低，為1.25%（1/80）；成安縣和肥鄉(xiāng)區(qū)隱孢子蟲病感染率稍高，成安縣感染率為7.50%（6/80），肥鄉(xiāng)區(qū)感染率為10.00%（8/80）。

表1 邯鄲地區(qū)不同地點(diǎn)犢牛隱孢子蟲的感染率Tab.1 Cryptospridium infection rate of calves in different regions of Handan

2.2 邯鄲地區(qū)不同月齡犢牛隱孢子蟲的感染情況（見表2）

由表2 可知，不同月齡犢牛隱孢子蟲的感染率具有差異，其中0～3 月齡犢牛隱孢子蟲感染率較高，為6.67%（16/240）；4～6 月齡犢牛隱孢子蟲感染率較低，為4.38%（7/160）。

表2 不同月齡犢牛隱孢子蟲的感染率Tab.2 Cryptospridium infection rate of calves in different months

2.3 犢牛隱孢子蟲的形態(tài)鑒定（見圖1）

由圖1 可知，經(jīng)飽和蔗糖溶液漂浮的卵囊均呈淡玫瑰紅色，卵囊外圍環(huán)繞淡綠色的光圈，卵囊形狀為圓形或卵圓形，卵囊壁較薄，無微孔和極粒，光滑無色。經(jīng)改良抗酸染色后卵囊呈深玫瑰紅色，殘體背景為綠色，非特異性顆粒為藍(lán)黑色，大部分卵囊內(nèi)子孢子為結(jié)構(gòu)模糊的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，卵囊平均大小5.0 μm×4.5 μm。本調(diào)查結(jié)果與文獻(xiàn)報道的感染月齡及形態(tài)大小相似，可初步鑒定為調(diào)查采集樣本中檢出蟲種微小隱孢子蟲。

圖1 犢牛糞便中的微小隱孢子蟲Fig.1 Cryptosporidium parvum in calf feces

3 討論

隱孢子蟲是一種主要寄生于哺乳動物胃腸道上皮細(xì)胞刷狀緣的寄生原蟲，具有廣泛的宿主范圍，可感染包括人在內(nèi)的240多種動物，可通過水源、食物、空氣等多種途徑傳播。隱孢子蟲主要引起幼齡動物的消化道和呼吸道疾病，可降低其生產(chǎn)性能，嚴(yán)重可導(dǎo)致死亡。隱孢子蟲病是重要的人畜共患寄生蟲病之一，是僅次于輪狀病毒的第二大腹瀉病原[11]，已被列為世界最常見的6 種腹瀉疾病之一，并被世界衛(wèi)生組織和美國疾病預(yù)防控制中心列入新發(fā)傳染病。2003年，該病也被我國列為重點(diǎn)防范的兩個重要新發(fā)寄生蟲病之一。

Cui等[12]研究發(fā)現(xiàn)，寧夏某奶牛場大量犢牛發(fā)生腹瀉，病死率高達(dá)10%以上，其中2～3周齡犢牛的隱孢子蟲感染率高達(dá)83.3%。本研究對邯鄲地區(qū)犢牛隱孢子蟲的感染情況進(jìn)行了調(diào)查，從感染率和蟲種鑒定方面進(jìn)行分析，對邯鄲地區(qū)隱孢子蟲病防控工作具有重要意義。本試驗(yàn)調(diào)查的400份犢牛糞便樣品中，23份糞便樣品的隱孢子蟲檢驗(yàn)結(jié)果為陽性，陽性率為5.75%（23/400）。任冠靜等[13]對陜西斷奶后犢牛的一項(xiàng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，隱孢子蟲總感染率為16.8%（19/113），其調(diào)查結(jié)果與本調(diào)查結(jié)果差異較大，原因可能是地區(qū)與樣本數(shù)量存在差異。

本試驗(yàn)中，邯鄲地區(qū)的5個縣（區(qū)）調(diào)查結(jié)果均存在差異，表明不同地區(qū)犢牛隱孢子蟲的感染率不同，可能與地理位置和飼養(yǎng)管理及衛(wèi)生條件等存在密切聯(lián)系。調(diào)查中，0～3 月齡和4～6 月齡犢牛隱孢子蟲感染感染率差異明顯，0～3月齡感染率較高，陽性率為6.67%。Garber等[14]研究發(fā)現(xiàn)，1～3 周齡新生犢牛隱孢子蟲總體感染率較高，為48.0%。Fayer 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，犢牛隱孢子的感染率為20.5%。Wegayehu 等[16]研究指出，在不同的國家和地區(qū)，牛微小隱孢子蟲的流行情況與牛的品種、年齡和地理位置等有關(guān)。

早期針對隱孢子蟲的鑒別診斷主要通過顯微鏡觀察，寄生于牛的隱孢子蟲感染種類未能進(jìn)行準(zhǔn)確地鑒定；隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前檢測隱孢子蟲感染的方法包括病原形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)和免疫學(xué)等。病原形態(tài)學(xué)主要為染色法、漂浮法和沉淀法；分子生物學(xué)方法主要有普通PCR、巢式PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）、實(shí)時熒光定量PCR（real-time PCR）、PCR-限制性片段多態(tài)性分析（PCRRFLP）、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）等檢測技術(shù)，是所有檢測方法中最迅速、最敏感、最方便的檢測方法之一；免疫學(xué)方法主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、間接免疫熒光法、單克隆抗體技術(shù)以及流式細(xì)胞術(shù)等方法。我國最常用的檢測方法是漂浮法和PCR方法，通過分子生物學(xué)手段可以進(jìn)行隱孢子蟲蟲種鑒定、基因分型、溯源研究及人畜共患病風(fēng)險評估。牛作為隱孢子蟲的主要感染宿主，奶牛犢牛主要通過糞便以及糞便污染的飲水、飼料感染隱孢子蟲，犢牛住進(jìn)未經(jīng)過徹底清洗消毒的犢牛舍常導(dǎo)致新生犢牛大量發(fā)病。有研究顯示，過濾式軟體動物已被認(rèn)為是隱孢子蟲病的潛在來源，但迄今為止尚無公認(rèn)的暴發(fā)記錄[17]。隨著我國牛進(jìn)口數(shù)量急劇增加，牛隱孢子蟲病現(xiàn)在已經(jīng)成為當(dāng)前嚴(yán)重危害我國養(yǎng)殖業(yè)的傳染病之一，應(yīng)引起高度重視，降低隱孢子蟲病造成的經(jīng)濟(jì)損失。

4 結(jié)論

關(guān)于犢牛隱孢子蟲病報道較多，但尚未研制出具有顯著臨床療效的藥物或疫苗。本試驗(yàn)通過調(diào)查邯鄲地區(qū)犢牛隱孢子蟲的感染情況，為控制隱孢子蟲病的傳播提供參考，為邯鄲地區(qū)犢牛隱孢子蟲病的防控與治療提供了依據(jù)，對邯鄲地區(qū)畜禽的健康具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。