犢牛肺源致病性大腸桿菌的分離鑒定及毒力基因檢測(cè)

伍麥爾·麥海提，阿吾提·買海提，夏克熱木·阿布力孜，俞 進(jìn)

（1. 塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；2. 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木動(dòng)物疫病診斷與防控工程實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300；3. 阿克蘇地區(qū)動(dòng)物疫病控制診斷中心，新疆阿克蘇 843000）

肺源致病性大腸桿菌屬腸外致病性大腸桿菌 （Extraintestinal pathogenicEscherichia coli，ExPEC）。ExPEC是一類重要的人獸共患病原體，可憑借特有的毒力因子定植于人和動(dòng)物腸道外器官和組織，進(jìn)而引發(fā)疾病，對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)和公共衛(wèi)生安全造成極大威脅。

2000 年，Russo 等[1]提出將ExPEC 作為所有能夠引起腸外疾病的非共生大腸桿菌分離株的統(tǒng)稱，并報(bào)道了大腸桿菌導(dǎo)致的奶牛乳房炎、子宮內(nèi)膜炎和犢牛腹瀉、尿路感染以及新生兒腦膜炎等疾病，但均與肺部感染無關(guān)。近年來，肺源大腸桿菌引發(fā)的動(dòng)物疾病時(shí)常發(fā)生，如蔡瑤等[2]、王朋[3]分別于患有呼吸系統(tǒng)疾病的豬及林麝的內(nèi)臟器官中分離得到所對(duì)應(yīng)的肺源性大腸桿菌；顧曉曉[4]在患有類似疾病的犢牛內(nèi)臟內(nèi)同樣分離出牛的肺源性大腸桿菌。ExPEC間存在基因差異性，包括許多毒力基因編碼的毒力因子[5]，如黏附類（P、S、I 型菌毛和Curli 菌毛）、侵襲類、毒素類（溶血素、空泡毒素）、攝鐵因子類、血清抗性及其他毒力因子。本研究從發(fā)生呼吸道感染的犢牛病料組織中分離鑒定得到的ExPEC，并進(jìn)行毒力基因檢測(cè)，為該地區(qū)牛場(chǎng)呼吸道疾病的診斷與防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2021年8月～11月采集自阿克蘇地區(qū)某規(guī)?；?chǎng)因呼吸系統(tǒng)疾病死亡新生牛犢的肺臟、淋巴結(jié)、脾臟、心臟、肝臟等器官組織38 份，-80 ℃保存。昆明系小鼠，體重（28±2）g，購自塔里木大學(xué)實(shí)驗(yàn)站。

1.2 試劑與儀器

主要試劑：麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基，均購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；微量生化反應(yīng)管，購自杭州天和微生物制劑有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒，購自天根生化科技有限公司；核酸染液gold view，購自上海浩然生物技術(shù)有限公司；DL-2000 DNA Marker，購自TaKaRa 公司；2×master PCR Mix，購自廣州東盛生物科技有限公司。

主要儀器：超凈工作臺(tái)（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）、冷凍混合球磨儀（弗爾德儀器設(shè)備有限公司）、GHP-9080 恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、ECLIPSE Ci-L顯微鏡（尼康中國）、漩渦混合器（其林貝爾儀器制造有限公司）、恒溫?fù)u床（上海智誠分析儀器制造有限公司）、Eppendorf 5415-離心機(jī)（艾本德國際貿(mào)易有限公司）、恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）、PCR儀（Bio-Rad產(chǎn)品有限公司）、電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）、DYY-7C 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京市六一儀器廠）、伯樂GelDoc Go凝膠成像儀（Bio-Rad產(chǎn)品有限公司）、微波爐、高壓鍋。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)菌培養(yǎng)與分離

按常規(guī)無菌操作，病料剪成1 m3，加1 mL生理鹽水研磨。將研磨的組織上清液接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱12～14 h，觀察菌落形態(tài)。

1.3.2 染色鏡檢

接種環(huán)挑取純化后的單菌落，于載玻片上均勻涂開，經(jīng)火焰固定，按照革蘭染色和瑞特氏染色步驟涂片處理，油鏡下觀察。

1.3.3 生化試驗(yàn)

無菌挑取單菌落，吸取2～5 μL單菌落的增菌液，注入鑒定生化管。注入菌落或菌液與生化培養(yǎng)基結(jié)合，將生化管開放一側(cè)封住，生化管倒置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，部分生化試驗(yàn)需培養(yǎng)24～48 h（如葡萄糖磷酸鹽蛋白胨生化管）；V-P 等部分試驗(yàn)需要在生化管加入大腸桿菌并孵育一段時(shí)間后加入部分試劑，產(chǎn)生鑒定反應(yīng)，培養(yǎng)完成觀察其生化試驗(yàn)結(jié)果。

1.3.4 分離株16Sr RNA擴(kuò)增

細(xì)菌DNA 提取方法按照說明書操作，提取的DNA于-20 ℃保存。16Sr RNA 通用引物序列參考王堯[6]的引物序列。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增體系為：DNA模板1 μL；上游引物和下游引物1 μL；EasyTaq Super Mix 12.5 μL，加入ddH2O 補(bǔ)至25 μL。

PCR產(chǎn)物經(jīng)目的條帶切膠回收，送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與NCBI/BLAST 工具進(jìn)行序列比對(duì)，確定具體菌屬。細(xì)菌通用引物序列見表1。

表1 引物序列設(shè)計(jì)Tab.1 Primer sequence design

1.3.5 動(dòng)物試驗(yàn)

雌、雄各半的28 只小鼠，隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組。試驗(yàn)組每只腹腔注射0.2 mL 濃度1.71×109CFU/mL 的菌液，對(duì)照組注射相同劑量的生理鹽水，觀察小鼠的精神、腹瀉、飲食和死亡情況。

1.3.6 毒力基因PCR擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)與合成

引物序列參照文獻(xiàn)[7-10]設(shè)計(jì)，PCR 檢測(cè)ExPEC 的8 個(gè)毒力基因，包括ompC、eae、ST、LT、Stx1、hlyF、fyuA、fimC。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列及其目的條帶大小見表2。

所有毒力基因PCR擴(kuò)增體系為；上游引物和下游引物各0.5 μL，ddH2O 為10.5 μL，Mix 酶12.5 μL，DNA 模板1 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃5 min，94 ℃50 s，72 ℃ 60 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。退火溫度見表2。

表2 ExPEC毒力因子引物序列Tab.2 ExPEC virulence factor primer sequences

PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.3.7 小鼠器官病理組織學(xué)觀察剖檢觀察試驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠的病理變化，小鼠死后迅速取出所需組織，避免因擠壓細(xì)胞使其受到損傷，按常規(guī)方法制作石蠟切片，HE染色，顯微鏡觀察病變。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果（見圖1）

圖1 分離菌株菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of isolated strains

由圖1可知，該菌在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上形成粉紅色、邊緣整齊、表面光滑濕潤(rùn)的菌落；在伊紅美藍(lán)瓊脂上產(chǎn)生黑色帶金屬光澤的菌落。

該菌對(duì)培養(yǎng)基的營養(yǎng)要求很低，普通培養(yǎng)基上，37 ℃條件下24 h內(nèi)生長(zhǎng)情況良好。判斷該菌為兼性厭氧菌。

2.2 染色鏡檢結(jié)果（見表2）

由表2 可知，顯微鏡下分離菌株為革蘭陰性菌，呈粗短，無芽孢，兩端鈍圓的中等大小桿菌。瑞特氏染色可見微莢膜和兩端深染的菌體。

圖2 分離菌株染色鏡檢結(jié)果Fig.2 Microscopic examination results of staining for isolated strains

2.3 生化鑒定結(jié)果（見表3）

表3 生化鑒定結(jié)果Tab.3 Biochemical identification results

由表3可知，分離菌硫化氫、枸櫞酸鹽、VP等試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，反應(yīng)過程無變色；棉籽糖、山梨醇、側(cè)金盞花醇和木糖等試驗(yàn)中均由藍(lán)紫色變成黃色，結(jié)果為陽性；在蛋白胨水培養(yǎng)基中呈紅色，結(jié)果為陽性。參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，分離菌株與ExPEC的生化反應(yīng)特點(diǎn)基本一致。

2.4 小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果（見圖3）

圖3 小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Pathogenicity test results in mice

試驗(yàn)組小鼠接種攜帶不同毒力基因腸外致病性大腸桿菌后，先后表現(xiàn)不同程度的精神沉郁、昏睡、蜷縮、呼吸急促、無腹瀉、眼睛分泌物較多和無法站立等臨床癥狀，12～36 h內(nèi)小鼠全部死亡。對(duì)照組小鼠在觀察期內(nèi)正常飲食，未出現(xiàn)明顯臨床癥狀及死亡情況。

對(duì)照組小鼠肺為粉紅色，質(zhì)輕柔軟，富有彈性，表面平滑，試驗(yàn)組小鼠剖檢病變是肺充血、出血、淤血、手摸不彈性；對(duì)照組小鼠肝臟呈暗紅色，試驗(yàn)組小鼠肝臟腫大發(fā)黑，胸腔積液渾濁，小腸和其他器官無明顯病理變化。試驗(yàn)組剖檢小鼠的肺臟、肝臟等組織處，均能夠分離得到形態(tài)一致的菌落，對(duì)其進(jìn)行革蘭染色和瑞特氏染色鏡檢，生化鑒定比對(duì)結(jié)果顯示，分離出的感染菌在外部形態(tài)、生理生化特性和初始分離得到的感染菌為同一種菌。

2.5 分離株16S rRNA分子生物學(xué)鑒定結(jié)果（見圖4）

圖4 分離株16S rRNA分子生物學(xué)鑒定結(jié)果Fig.4 Molecular biological identification results of 16S rRNA isolates

由圖4可知，疑似ExPEC的臨床分離菌株P(guān)CR擴(kuò)增目的條帶均為1 500 bp左右，與此次引物擴(kuò)增目的條帶相符。將與目的條帶相符的部分PCR 產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)；結(jié)果顯示，分離株與大腸桿菌相似度高于99%，符合判定標(biāo)準(zhǔn)。

2.6 分離株毒力基因擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果（見圖5）

本試驗(yàn)所檢出的38 株大腸桿菌中26 株攜帶毒力基因。由圖5 可知，分離菌攜帶ompC（1 236 bp）、fyuA（774 bp）、hlyF（599 bp）、fimC（497 bp）等4種毒力基因，未檢出eae、LT、ST、Stx1等毒力基因。毒力基因的攜帶情況結(jié)果顯示，毒力基因hlyF的攜帶率最高，為46.15%；毒力基因fimC、fyuA和ompC攜帶率依次為38.46%、34.61%和11.53%，其余毒力基因攜帶率均為0。

圖5 分離株毒力基因擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Virulence gene amplification test results of isolat es

2.7 病理學(xué)觀察結(jié)果（見圖6）

圖6 病理組織切片結(jié)果Fig.6 Result of pathological tissue sections

由圖6可知，試驗(yàn)組小鼠肺臟肺泡壁界限不清，組織切片可見明顯的充血和淤血，肝臟可見出血和淤血，其他器官無變化；對(duì)照組小鼠肺臟和肝臟均未見明顯的病變。

3 討論

本研究中采用細(xì)菌形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定方法，根據(jù)致病性大腸桿菌的病原學(xué)特征對(duì)分離株進(jìn)行初步鑒定，為減少假陽性現(xiàn)象出現(xiàn)，使用選擇性培養(yǎng)基麥康凱、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基篩選ExPEC，并通過染色鏡檢鑒定分離菌為革蘭陰性菌。對(duì)分離菌進(jìn)行生化試驗(yàn)，結(jié)果顯示，分離菌大部分符合ExPEC 典型生化特征；通過16S rRNA PCR 擴(kuò)增，將所得的序列與NCBI 比對(duì)，結(jié)果顯示，分離株與NCBI中ExPEC 16S rRNA的同源性超過99%。因此，鑒定分離株為肺源致病性大腸桿菌。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，16S rRNA序列的同源性大于97%即可認(rèn)定為同一種[11]；結(jié)合本試驗(yàn)鑒定結(jié)果，可將該分離菌株鑒定為ExPEC。

本研究使用8種毒力基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，分離菌攜帶ompC、fyuA、hlyF、fimC等4種毒力基因，并擴(kuò)增出相應(yīng)大小的目的片段；未檢測(cè)出eae、LT、ST、stx1等毒力基因。毒力基因hlyF的攜帶率最高，為46.15%；fimC、fyuA和ompC的檢出率分別為38.46%、34.61%和11.53%。鄧顯佑[12]采用LT、ST毒力基因檢測(cè)貴州矮馬腹瀉，而本試驗(yàn)未檢測(cè)出LT、ST毒力基因。有研究顯示，毒力基因hlyF在動(dòng)物群體中分布廣泛，且在腸道外的大腸桿菌感染中較為常見[13]。也有研究發(fā)現(xiàn)，在腸道分離得到的大腸桿菌也攜帶此種毒力基因，但有關(guān)其致病性強(qiáng)度的報(bào)道較少[14]。顧曉曉[4]對(duì)新疆部分地區(qū)牛和綿羊的臟器病料中分離的132 株ExPEC 進(jìn)行25 種毒力基因的檢測(cè)，結(jié)果顯示，毒力基因ompC檢出率較高。而本試驗(yàn)ompC毒力基因檢出率為11.53%。有研究者認(rèn)為，從動(dòng)物腸道以外的臟器中分離到的大腸桿菌均可判定為ExPEC，也有人提出可根據(jù)大腸桿菌攜帶的特定毒力基因種類和數(shù)量初步確定是否為ExPEC[15]。馬增軍等[16]在豬源ExPEC中檢測(cè)出ler、iutA、irp2、fyuA、astA等5種基因，其中iutA和fyuA檢出率最高；結(jié)果表明，同時(shí)攜帶iutA、fyuA和ler基因的菌株更易引起動(dòng)物患病，對(duì)機(jī)體危害嚴(yán)重。本研究與上述報(bào)道的ExPEC 毒力基因攜帶率的毒力因子具有差異性，但同樣攜帶fyuA基因，此類毒力基因可能導(dǎo)致犢牛死亡。

4 結(jié)論

近年來，隨著我國養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，疆內(nèi)部分地區(qū)ExPEC引起動(dòng)物發(fā)病的報(bào)告越來越多，但南疆地區(qū)該菌株的研究和防控尚未引起養(yǎng)殖企業(yè)的足夠重視，所需數(shù)據(jù)及建議仍非常稀少，文獻(xiàn)資料嚴(yán)重缺乏。本試驗(yàn)通過對(duì)已確定為牛肺源致病性大腸桿菌的菌株進(jìn)行毒力基因檢測(cè)和小鼠致病性試驗(yàn)，進(jìn)一步明確該病原菌的致病性和流行病學(xué)規(guī)律，以期為該地區(qū)牛場(chǎng)呼吸道疾病的診斷與防治提供參考。