甘草提取液對(duì)心肌缺血小鼠氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)作用研究

楊 雁，宋艷萍，楊 彤，馬 龍，王澤龍，李良同，何 穎

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院中藥學(xué)院，吉林 吉林 132109）

心血管疾病特別是缺血性心臟病，已成為影響社會(huì)所 有經(jīng)濟(jì)群體的世界性健康問題。急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是缺血性心臟病的常見表現(xiàn)，是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡和殘疾的主要原因。心肌缺血時(shí)，血氧供需失衡，即可發(fā)生AMI，導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死[1]。心肌缺血期間會(huì)產(chǎn)生大量活性氧（ROS），導(dǎo)致心肌功能障礙和壞死。因此，具有抗氧化或自由基清除活性的治療干預(yù)可應(yīng)用于對(duì)抗缺血性心臟病中的氧化應(yīng)激[2]。近年來，越來越多的研究表明，中草藥具有一定的抗氧化作用，人們對(duì)中草藥的接受度越來越高[3]。甘草的主要成分為甘草素、三萜皂苷、異黃酮、香豆素和黃酮等。甘草素主要存在于甘草的根中，具有多種藥理及生化特性，如抗氧化、抗癌、抗炎、保肝等[4-7]。本試驗(yàn)建立心肌缺血模型，研究甘草提取液對(duì)心肌的保護(hù)作用，為甘草提取液對(duì)心肌缺血小鼠氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)作用的相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

50 只SPF 級(jí)KM 小鼠，雌、雄各半，（20±2）g，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司提供。試驗(yàn)期間小鼠常規(guī)飼養(yǎng)，室溫18～25 ℃，自由飲水。

1.1.2 試劑與儀器

主要試劑：甘草飲片（河北全泰藥業(yè)有限公司，批號(hào)：2103001）；75%乙醇、0.9%氯化鈉溶液、鹽酸腎上腺素注射液（上海全宇生物科技動(dòng)物藥業(yè)有限公司）；1%TTC（北京雷根技術(shù)生物有限公司）；肌酸肌酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

主要儀器：L-600臺(tái)式低速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；3K15 Sigma 高速離心機(jī)、Tecan Infinite 200 Pro 多功能酶標(biāo)儀（特肯有限公司）；SB-5200DT 超聲波清洗機(jī)（寧波新藝超聲設(shè)備有限公司）；752 紫外可見分光光度計(jì)（上海奧普勒儀器有限公司）；BS-1E恒溫振蕩培養(yǎng)箱（良友儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

50只小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、對(duì)照組以及高、中、低劑量組（劑量分別為220、150、80 mg/kg），每組10 只小鼠。連續(xù)灌胃給藥21 d，空白對(duì)照組及對(duì)照組小鼠給予等劑量生理鹽水；第19～21 d給藥30 min后，對(duì)照組及高、中、低劑量組小鼠腹腔注射6 mg/kg 異丙腎上腺素，構(gòu)建急性心肌缺血模型（空白對(duì)照組小鼠腹腔注射等量生理鹽水）。

1.2.2 甘草提取液的制備

取0.50 g 過60 目篩的甘草粉末，加入50 mL 70%乙醇，60 ℃超聲提取30 min，過濾，3 500 r/min 離心10 min，蒸發(fā)回收大部分溶劑，于50 mL容量瓶定容。

1.2.3 TTC法測(cè)定小鼠心肌梗死面積

小鼠心肌梗死，冷PBS 沖洗干凈心臟。心臟急速冷凍，切成數(shù)片厚度為1～2 mm 的小薄片，加入1% TTC 染液，37 ℃水浴避光反應(yīng)15～30 min。反應(yīng)完成可見非梗死區(qū)域呈磚紅色，梗死區(qū)域呈灰白色。固定焦距拍照，采用平面面積求積法計(jì)算梗死面積，以壞死面積與占總面積的百分比衡量心肌梗死程度。

1.2.4 比色法測(cè)定血清CK及LDH活性

CK活性：造模結(jié)束每組小鼠眼球取血，按試劑盒要求操作，45 ℃水浴15 min，雙蒸水調(diào)零，660 nm 處1 cm 光徑比色，測(cè)各管的吸光度值。

LDH 活性：造模結(jié)束每組小鼠眼球取血，肝素抗凝取血漿，按照試劑盒要求操作，室溫放置3 min，440 nm 處1 cm光徑比色，雙蒸水調(diào)零，測(cè)定各管吸光度值。

1.2.5 分光光度法測(cè)定SOD活性及MDA含量

SOD 活性測(cè)定：稱取200 mg 組織，以重量∶體積=1∶9比例加入1.8 mL 生理鹽水，冰上切碎組織并制備勻漿，3 000 r/min 離心10 min，取上清液，按照試劑盒說明檢測(cè)SOD活性。

MDA含量測(cè)定：稱取100 mg組織，預(yù)冷生理鹽水制備10%的心肌組織勻漿，離心取上清，按照試劑盒說明檢測(cè)MDA含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘草提取液對(duì)小鼠心肌梗死面積的影響（見圖1、圖2）

如圖1、圖2 可知，對(duì)照組小鼠的心肌梗死最嚴(yán)重，與空白對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，各劑量組小鼠心肌梗死面積均縮小，且以高劑量甘草提取液降低小鼠心肌梗死的效果最好（P＜0.05）。

2.2 甘草提取液對(duì)小鼠CK及LDH活性的影響（見表1）

由表1可知，與空白對(duì)照組相比，對(duì)照組小鼠血清CK和LDH活性均顯著增加（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，甘草提取液高、中、低劑量組小鼠血清CK 活性均顯著降低（P＜0.05），高、中劑量組中LDH活性顯著降低（P＜0.05）。

2.3 甘草提取液對(duì)小鼠SOD 活性及MDA 含量的影響（見表2）

由表2可知，與空白對(duì)照組相比，對(duì)照組小鼠心肌組織中SOD 活性顯著降低（P＜0.05），MDA 含量顯著升高（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，甘草提取液高、中、低劑量組小鼠心肌組織中SOD 活性顯著升高（P＜0.05），MDA 含量顯 著降低（P＜0.05）。

圖1 甘草提取液對(duì)小鼠心肌梗死面積的影響Fig.1 Effect of Glycyrrhiza uralensis Fisch.extract on the area of myocardial infarction in mice

圖2 甘草提取液對(duì)小鼠心肌梗死面積的影響Fig.2 Effect of Glycyrrhiza uralensis Fisch.extract on the area of myocardial infarction in mice

表1 甘草提取液對(duì)小鼠CK及LDH活性的影響Tab.1 Effect of Glycyrrhiza uralensis Fisch.extract on the activity of CK and LDH in mice

表2 甘草提取液對(duì)小鼠SOD活性及MDA含量的影響Tab.2 Effect of Glycyrrhiza uralensis Fisch.extract on SOD activity and MDA content in mice

3 討論

心肌細(xì)胞與其他組織和肌肉不同，糖原儲(chǔ)備非常有限，導(dǎo)致心肌代謝幾乎完全是有氧代謝。因此，心肌耗氧量（MVO2）和心肌氧輸送間的平衡對(duì)促進(jìn)心室功能和避免心肌缺血是必要的[8]。氧化應(yīng)激反應(yīng)常出現(xiàn)于各種心肌疾病過程，可通過自由基的水平判斷心肌受損的程度。發(fā)生心肌缺血時(shí)，活性氧簇（ROS）升高，激活了氧化應(yīng)激，進(jìn)而引起心肌損傷[9]。

心臟中自由基清除酶，如SOD、CAT 和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）是細(xì)胞抵御氧化應(yīng)激的第一道防線，可消除超氧化物和羥基自由基。內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)和ROS 產(chǎn)生之間的平衡決定了缺血性損傷的嚴(yán)重程度。削弱抗氧化防御機(jī)制，異丙腎上腺素（ISP）更易導(dǎo)致心肌受到脂質(zhì)過氧化影響。脂質(zhì)過氧化是一種心肌膜的氧化變性，心肌膜內(nèi)的多不飽和脂肪酸可能是ROS和過氧自由基的主要靶點(diǎn)，可引發(fā)脂質(zhì)過氧化的連鎖反應(yīng)[10-11]。

本研究中，MDA含量增加可證明ISP給藥會(huì)誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化。MDA 含量的增加是由于抗氧化防御受損。因此，自由基并未被有效中和，并導(dǎo)致心肌膜損傷。在本試驗(yàn)中，甘草提取液的預(yù)處理降低了MDA含量，原因是心肌抗氧化劑的活性增加或者ROS 的抑制。心肌細(xì)胞損傷的標(biāo)志物包括CK-MB 同工酶和LDH，其中CK-MB 同工酶活性因其心臟組織的特異性、敏感性和催化活性成為診斷標(biāo)志物之一。心肌損傷時(shí)，心肌膜脂過氧化導(dǎo)致細(xì)胞和亞細(xì)胞成分的分解和多孔通透性增加，心肌細(xì)胞釋放出來心肌損傷標(biāo)志酶。此外，心肌損傷標(biāo)志酶CK-MB和LDH的消耗也證明了ISP誘導(dǎo)的心肌缺血發(fā)生。

中草藥和藥用植物具有潛在的益處，是抗氧化劑的重要來源，人們對(duì)草藥、藥用植物和膳食產(chǎn)生濃厚的興趣。植物可產(chǎn)生大量化學(xué)物質(zhì)，被認(rèn)為是藥用生物活性化合物和開發(fā)藥物的先導(dǎo)化合物的儲(chǔ)存庫。有研究表明，藥用植物提取物和植物化學(xué)物質(zhì)可作為植物治療劑，并預(yù)防缺血性心臟病，可篩選具有抗氧化活性的中草藥，進(jìn)一步驗(yàn)證其提取物保護(hù)心臟的潛力[12]。

甘草作為膳食和藥物被食用已有4 000 多年的歷史，在食品、糖果、口香糖、牙膏、飲料和煙草中用作甜味劑和調(diào)味劑。甘草具有多種治療特性，如降血糖、降膽固醇、抗?jié)儭⒖寡?、腎臟保護(hù)和抗動(dòng)脈粥樣硬化等，是傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中處方最多的草藥之一[13-14]。目前，甘草中的主要活性成分包括甘草酸、甘草甜素和異黃酮和異甘草素等[15-16]。本研究表明，甘草提取物的抗氧化和清除自由基的活性可對(duì)抗氧化應(yīng)激。此外，甘草在動(dòng)物研究中已被證明是無毒的，在人體治療劑量下更安全。本研究中，丙二醛（MDA）含量增加可以證明，ISP給藥能夠誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化。MDA的增加是因抗氧化防御受損，故自由基未被有效中和，并導(dǎo)致心肌膜損傷。

4 結(jié)論

甘草提取液可通過降低心肌缺血小鼠CK 和LDH 的活性，減少M(fèi)DA的含量，提高SOD活性，減輕氧化應(yīng)激損傷以及心肌缺血造成的損傷。