pH/鹽雙敏性聚醚基咪唑類離子液體凝膠的制備、性質及藥物控釋機制研究

趙亞梅, 劉星悅, 霍夢丹, 李澤城, 楊靖

(1.西安工程大學 環(huán)境與化學工程學院, 陜西 西安 710600;2.陜西延長石油(集團)有限責任公司研究院, 陜西 西安 710061;3.西安工程大學 城市規(guī)劃與工程學院, 陜西 西安 710600)

載體在藥物釋放過程中具有重要作用。藥物輸送受人體不同組織器官的pH、溫度、離子強度等微環(huán)境的影響較大[1]，將藥物包覆在特定功能載體后再釋放，有助于控制藥物的釋放速度、調節(jié)藥物在體內的分布以及實現(xiàn)靶向定位給藥等，減少輸送過程中由于提前或滯后釋放對藥物療效的影響。腸道疾病是影響人體健康的因素之一。治療藥物需經(jīng)過口腔、食道、胃等多個不同的組織器官，才能到達腸道疾病部位，由于部分吸收導致血藥濃度降低，影響治療效果。通過載體包覆藥物有助于維持較高的血藥濃度，然而人體腸道微環(huán)境呈弱堿性，腸液中含有大量離子[2-3]，在腸道微環(huán)境下進行可控釋放，pH、鹽雙敏性功能載體的選擇是關鍵。

刺激響應性凝膠是一類受到pH、光、溫度、鹽等外界環(huán)境刺激后發(fā)生溶脹-收縮轉變的智能材料[4-5]，可以作為控釋藥物載體。其中，pH/鹽敏感性凝膠能依據(jù)體內各個器官環(huán)境存在酸堿性、離子強度的差異，使藥物在特定時間和部位進行釋放，從而實現(xiàn)靶向定位精準給藥[6-7]，但對制備可控性、生物相容性、刺激響應敏感度等有較高要求。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)烷基咪唑類聚離子液體凝膠載體PCnvimBr(n=2,4,6)，具有pH/鹽雙敏感性，在pH=7.4弱堿性和一定鹽濃度的條件下釋放藥物具有一定選擇性，對腸道抗菌類藥物在腸道環(huán)境中釋放藥物具有應用價值。但是存在控釋速率、藥物累積釋放量相對較低等問題[8]。與其他功能基團相比，分子結構中引入醚基有助于增強刺激響應性，影響凝膠與藥物分子間的相互作用及藥物選擇性遷移[9-11]，同時，還可以提高生物降解能力并降低毒性[12]，在作為藥物載體方面具有潛力。

鑒于以上分析，本文在咪唑陽離子中引入醚基功能基團，通過乙烯基咪唑類離子液體型單體的自聚反應，設計合成pH/鹽雙敏性的聚醚基咪唑類離子液體凝膠P[CnOC2vim]Cl(n=1,2,3)，探討離子液體型單體的側鏈微增長對凝膠溶脹性能、生物相容性、pH和鹽刺激響應等行為的影響，在此基礎上，研究pH/鹽雙敏性P[CnOC2vim]Cl(n=1,2,3)凝膠對腸道抗菌類中西藥物的控釋行為及釋藥機制。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

N-乙烯基咪唑：98%，阿拉丁生化科技股份有限公司；2-氯乙基甲基醚：98%，阿拉丁生化科技股份有限公司；2-氯乙基乙醚：>98.0%，阿拉丁生化科技股份有限公司；2-氯乙基丙醚：>97.0%，阿拉丁生化科技股份有限公司；偶氮二異丁腈(AIBN)：97%，阿拉丁生化科技股份有限公司；N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺(MBA)：CP，阿拉丁生化科技股份有限公司；環(huán)丙沙星(CIP)：>98.0%，阿拉丁生化科技股份有限公司；黃連素(Ber)：98.0%，阿拉丁生化科技股份有限公司；MTT溶液：AR，Sigma公司；L929細胞：西京醫(yī)院皮膚科。

ARX-400核磁共振儀(瑞士Brucker公司)；R-205旋轉蒸發(fā)儀(上海申順生物科技有限公司)；SH2-88A恒溫振蕩器(江蘇正基儀器有限公司)；UV2450紫外-可見分光光度計(日本島津)；Nicolet 5700型傅立葉變換紅外光譜儀(美國Thermmo Electron公司)；FlexSEM1000掃描電鏡(日本日立公司)；XRD-MiniFlex600X-射線衍射儀(日本理學公司)；Powerdry LL3000型真空冷凍干燥機(基因有限公司)；Multiskan FC酶標儀(賽默飛世爾上海儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 P[CnOC2vim]Cl(n=1,2,3)凝膠的制備

首先，稱取15 g N-乙烯基咪唑于三口燒瓶中，氮氣保護條件下，加入不同醚基鏈長的氯化物(分別加入15 g 2-氯乙基甲基醚、17.19 g 2-氯乙基乙醚、19.33 g 2-氯乙基丙醚)和0.1 g對苯二酚阻聚劑，70℃回流攪拌24 h，用20 mL乙酸和50 mL乙酸乙酯溶解沉淀，然后60℃下真空干燥12 h得3種[CnOC2vim]Cl(n=1,2,3) 單體。其次，稱取一定量[CnOC2vim]Cl(n=1,2,3)單體，分別加入N,N-亞甲基雙丙烯酰胺、2.5 mL甲醇、2.5 mL乙醇和偶氮二異丁腈，通氮氣20 min后密封體系，70℃下恒溫油浴反應4 h，形成凝膠后切成小塊，在30 mL超純水中浸泡 3 d，每4 h更換超純水以去除未反應的小分子，然后冷凍干燥3～5 d至恒重后儲存在真空干燥箱中待用。[C1OC2vim]Cl的1H NMR歸屬δ(CDCl3)：10.59(s,1H),8.62(q,1H),8.18(d,1H),7.82(s,1H),7.60(s,1H),6.43(d,1H),3.80(q,1H),3.50(q,1H),3.41(s,3H)。[C2OC2vim]Cl的1H NMR歸屬δ(CDCl3)：10.62(s,1H),8.65(q,1H),8.14(d,1H),7.85(s,1H),7.57(s,1H),6.55(d,1H),3.77(q,1H),3.61(q,1H),1.22(t,3H)。[C3OC2vim]Cl的1H NMR歸屬δ(CDCl3)：10.71(s,1H),8.59(q,1H),8.17(d,1H),7.80(s,1H),7.51(s,1H),6.40(d,1H),3.59(q,1H),3.52(q,1H),3.21(t,3H),1.32(m,2H),0.98(t,3H)。其合成方法如圖1所示。

圖1 P[CnOC2vim]Cl(n=1,2,3)凝膠的合成方法

1.2.2 P[CnOC2vim]Cl(n=1,2,3)凝膠性能測試方法

1) 溶脹性能：25℃下，將干凝膠分別浸泡在超純水、不同pH值的緩沖溶液及不同濃度的NaCl模擬溶液中，一定時間后取出，用濾紙除去吸附在水凝膠表面的水分，稱重，計算溶脹率RS。溶脹率的計算公式為：RS=(mt-md)/md×100%，式中mt表示t時刻時溶脹的凝膠質量，md表示干凝膠質量。

2) 生物相容性：在接種好的對數(shù)生長期L929細胞培養(yǎng)板中，按200 μL/孔加入50%濃度的凝膠的浸提液(實驗前凝膠用無菌PBS清洗3遍)，浸泡時間分別為1,3,6,24 h。接下來，在37℃、5%的CO2下培養(yǎng)細胞，測試組吸光度記為ODt，陽性對照組吸光度為ODn，陰性對照組吸光度為ODp，并計算細胞存活率和溶血率，評價凝膠的細胞毒性。

1.2.3 凝膠體外藥物釋放實驗

將P[CnOC2vim]Cl(n=1,2,3)凝膠分別置于15 mL 的0.003 mg/mL腸道抗菌類藥物CIP、Ber溶液中，25℃下浸泡24 h后，冷凍干燥得載藥凝膠。稱取一定量載藥凝膠分別于不同pH和鹽模擬溶液中，置于恒溫搖床(37℃,100 r/min)，定時取樣3 mL，并補充3 mL新鮮緩沖溶液。用紫外-可見光分光光度計測定取得樣品的吸光度，計算出藥物濃度，以藥物累積釋放量對時間作圖[13]。

2 結果與討論

2.1 P[CnOC2vim]Cl(n=1,2,3)凝膠的制備

制備條件對凝膠的結構與性能具有一定的調控作用，其中，交聯(lián)劑和引發(fā)劑用量是重要的影響因素。在離子液體型單體用量、溶劑種類、反應溫度一定的條件下，分別改變交聯(lián)劑MBA、引發(fā)劑AIBN用量，P[CnOC2vim]Cl(n=1,2,3)凝膠性能會發(fā)生改變，MBA、AIBN用量對P[CnOC2vim]Cl(n=1,2,3)凝膠溶脹性影響如圖2所示。

圖2 MBA和AIBN用量對P[CnOC2vim]Cl(n=1,2,3)凝膠溶脹性影響

研究表明，P[COC2vim]Cl、P[C2OC2vim]Cl和P[C3OC2vim]Cl凝膠制備的最佳交聯(lián)劑MBA用量分別為離子液體單體質量的2%,4%和3%，最佳引發(fā)劑AIBN用量分別為離子液體單體質量的4%,4%和3%。當MBA用量較少時，隨著MBA用量增加，逐漸形成多孔網(wǎng)狀結構，溶脹率升高。當MBA用量過多時，形成凝膠的交聯(lián)密度增加，多孔網(wǎng)狀結構過于緊密，溶脹率降低。當AIBN用量過少時，引發(fā)產(chǎn)生的活性位點太少，醚基咪唑類離子液體型單體很難凝膠化，形成的多孔網(wǎng)狀結構不完整，導致溶脹率很低。隨著AIBN用量的增加，引發(fā)產(chǎn)生的活性位點增多，形成完整的多孔網(wǎng)狀結構，溶脹能力提高。然而，隨著AIBN用量的持續(xù)升高，離子液體型單體發(fā)生聚合反應的程度加大，溶脹率下降。

2.2 P[CnOC2vim]Cl(n=1,2,3)凝膠的紅外光譜分析

對3種[CnOC2vim]Cl(n=1,2,3)單體及其P[CnOC2vim]Cl(n=1,2,3)凝膠進行了FTIR光譜表征。從圖3a)看出，1 232 cm-1處為醚鍵碳氧單鍵C-O的伸縮振動峰，1 650 cm-1處為碳碳雙鍵C=C彎曲振吸收峰，3 083 cm-1處出現(xiàn)咪唑環(huán)上=C-H的伸縮振動峰，1 558 cm-1處為咪唑環(huán)上碳氮雙鍵C=N的伸縮振動，920 cm-1處為乙烯基的碳氫單鍵C-H變形振動峰。在圖3b)中，1 715 cm-1處出現(xiàn)N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺上的C=O特征吸收峰，1 515 cm-1處是咪唑環(huán)C=N伸縮振動，1 095 cm-1處是醚基側鏈C-O伸縮振動。與離子液體型單體的FTIR圖3a)相比，圖3b)中1 650 cm-1處未出現(xiàn)碳碳雙鍵C=C彎曲振動吸收峰，說明[CnOC2vim]Cl(n=1,2,3)單體發(fā)生了聚合，形成了P[CnOC2vim]Cl(n=1,2,3)凝膠。

圖3 單體及聚離子液體的紅外光譜圖

2.3 P[CnOC2vim]Cl(n=1,2,3)凝膠的溶脹性能

溶脹時間、PH和鹽等因素對P[CnOC2vim]Cl(n=1,2,3)凝膠溶脹性能影響見圖4。圖4a)為P[CnOC2vim]Cl(n=1,2,3)凝膠在25℃下在超純水中溶脹率隨時間的變化曲線。凝膠溶脹率隨時間延長逐漸升高，在前1 h內凝膠溶脹率迅速增長，而1 h后溶脹變得緩慢，溶脹一定時間后均達到平衡狀態(tài)。這是因為，溶脹初期，凝膠內部多孔網(wǎng)絡結構中可以容納水的空間大，隨著溶脹時間的延長，溶脹逐漸接近平衡，可以容納水的空間變小，溶脹率增長變得緩慢。P[COC2vim]Cl凝膠的最大溶脹率為4 514.29%，分別為P[C2OC2vim]Cl凝膠的1.52倍、P[C3OC2vim]Cl凝膠的1.93倍。由圖4b)可知，P[CnOC2vim]Cl(n=1,2,3)凝膠具有良好的pH刺激響應性，其溶脹率隨pH值升高呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。在酸性條件下，醚鍵容易被質子化而發(fā)生斷裂，凝膠的內部結構收縮，溶脹能力低，但隨著pH值升高，烷氧側鏈柔性舒張，凝膠內部結構擴張，使其在酸性范圍內的溶脹能力增強。值得注意的是，當pH值為7.4時，3種凝膠的平衡溶脹率均達到最大值，在該條件下表現(xiàn)出強的pH刺激響應性。圖4c)為P[CnOC2vim]Cl(n=1,2,3)凝膠在不同鹽濃度模擬液下的刺激響應曲線。隨著NaCl模擬鹽溶液濃度的升高，醚鍵斷鏈脫水，而且凝膠內部結構與鹽模擬液介質間的滲透壓差增大，導致凝膠內部結構收縮，凝膠的平衡溶脹率均呈現(xiàn)出降低的趨勢，具有一定的鹽刺激響應性。

圖4 P[CnOC2vim]Cl(n=1,2,3)凝膠溶脹性能

2.4 P[CnOC2vim]Cl(n=1,2,3)凝膠的生物相容性

通過溶血實驗和細胞毒實驗，評價P[CnOC2vim]Cl(n=1,2,3)凝膠的生物相容性。P[COC2vim]Cl(凝膠)、P[C2OC2vim]Cl(凝膠)和P[C3OC2vim]Cl(凝膠)對紅細胞的溶血率分別為2.2%,2.8%和3.1%，溶血率均小于5%，表明凝膠無溶血作用。用凝膠浸提液培養(yǎng)對數(shù)生長期L929細胞24 h后，細胞存活率仍保持在90%以上。結果表明，P[CnOC2vim]Cl(n=1,2,3)凝膠具有良好的生物相容性。

2.5 P[CnOC2vim]Cl(n=1,2,3)凝膠的體外藥物控釋

人體內各個器官微環(huán)境的酸堿性、離子強度等存在較大差異，對藥物定位輸送、藥物療效具有重要影響。基于P[CnOC2vim]Cl(n=1,2,3)凝膠載體在pH為7.4(與腸道微環(huán)境接近)時的強pH刺激響應性，選擇西藥環(huán)丙沙星(CIP)、中藥黃連素(Ber)2種腸道抗菌類藥物作為模型,分別研究凝膠的體外釋放性能。圖5為不同pH、鹽模擬液中凝膠釋藥曲線。由圖5a)～5b)可知，凝膠藥物累積釋放率在12 h內迅速增大，且10 h釋藥率均低于60%，30 h后趨于穩(wěn)定。凝膠在pH=7.4模擬腸液中30 h內累積釋放率最大，均大于45%，在pH=6.8模擬液中的累積釋放率均在20%內，而在pH=1.2的模擬胃液中的累積釋放率最低，均小于4%。由圖5c)和5d)可知，在一定濃度的鹽模擬液中，隨著釋放時間的延長，凝膠的藥物累積釋放率逐漸增大并趨于穩(wěn)定，凝膠在1 h的釋藥均小于15%，30 h時釋放接近平衡。與0.03 mol/L NaCl溶液相比，當鹽濃度升高至0.15 mol/L時，藥物累積釋放率均有所降低，表明P[CnOC2vim]Cl(n=1,2,3)凝膠釋藥過程的緩釋效果較好，對介質的鹽濃度具有一定選擇性。

圖5 P[CnOC2vim]Cl(n=1,2,3)凝膠的釋藥曲線

值得注意的是，P[CnOC2vim]Cl(n=1,2,3)凝膠對中藥Ber的累積釋放率略高于西藥CIP，這可能是由于CIP與凝膠之間的電荷相互作用弱，導致累積釋放率低。其中，短醚基側鏈P[COC2vim]Cl凝膠作為弱堿性的腸道抗菌藥物載體，其藥物累積釋放率更高，這與其溶脹行為及刺激響應性研究結果一致。

2.6 P[CnOC2vim]Cl(n=1,2,3)凝膠的釋藥機制

藥物釋放是一個非常復雜的過程[14]，凝膠的釋藥機制研究具有重要意義。通過對藥物累積釋放率與釋藥時間進行數(shù)據(jù)擬合，其中，零級動力學方程Q=a0+k0t、一級動力學方程ln(1-Q)=a1+k1t和Higuchi 方程Q=a2+k2t1/2，式中，Q為藥物在某一時刻的累積釋放率，t為釋放時間，k0,k1和k2分別為3個方程的藥物釋放速率常數(shù)，擬合結果分別見表1和表2。短醚基側鏈P[COC2vim]Cl凝膠中一級動力學方程里的R2最大，釋藥符合一級動力學。隨著醚基鏈微增長，釋藥機制發(fā)生變化。在釋藥過程中，處于凝膠載體表面的藥物先擴散，載體內部結構中大量的藥物再擴散溶解，之后載體表層會出現(xiàn)小部分溶蝕且伴有少量藥物溶出，滲透壓變小，釋藥過程趨于動態(tài)平衡，因此，P[CnOC2vim]Cl(n=2,3)凝膠載體符合Higuchi動力學方程。

表1 P[CnOC2vim]Cl(n=1,2,3)凝膠釋放CIP的動力學擬合結果

表2 P[CnOC2vim]Cl(n=1,2,3)凝膠釋放Ber的動力學擬合結果

3 結 論

1) 從分子設計角度出發(fā)，在N-乙烯基咪唑類陽離子中引入醚基官能團，設計合成了3種pH/鹽雙敏性、多孔網(wǎng)狀結構的聚醚基咪唑類離子液體凝膠P[CnOC2vim]Cl(n=1,2,3)，凝膠無溶血作用且細胞毒性低。

2) 與課題組前期制備的PC2vimBr烷基咪唑類聚離子液體凝膠的最優(yōu)溶脹率為1 422.3%相比[8]，短醚基鏈P[COC2vim]Cl凝膠的溶脹率提高了約2倍，pH、鹽刺激響應性相對更敏感。

3) P[CnOC2vim]Cl(n=1,2,3)凝膠對腸道殺菌類藥物環(huán)丙沙星和黃連素均具有緩控釋作用，在pH為7.4的模擬腸液中累積釋放率高，靶向給藥能力較為明顯。P[COC2vim]Cl凝膠在模擬胃腸液中釋藥規(guī)律符合一級動力學方程，而P[CnOC2vim]Cl(n=2,3)凝膠釋藥規(guī)律符合Higuchi動力學方程。