電致孔技術(shù)促進(jìn)瑞格列奈水凝膠經(jīng)皮吸收

馬麗蘭，徐娜，吳桐，李海鷹，楊文智

(1.河北省第六人民醫(yī)院 河北大學(xué)精神衛(wèi)生研究院，藥劑科，河北 保定 071000;2. 河北大學(xué) 藥學(xué)院，河北 保定 071002)

瑞格列奈(repaglinide)是一種通過(guò)刺激胰腺釋放胰島素，專門(mén)控制Ⅱ型糖尿病患者的葡萄糖波動(dòng)的口服降糖藥物．相比其他磺酰脲類降糖藥物，具有起效快、副作用少、用藥劑量少等優(yōu)點(diǎn)，市售多以片劑為主[1-2]．>但瑞格列奈屬于BCS Ⅱ分類系統(tǒng)，口服生物利用度有限.其水溶性差(34 μg/mL)極大限制了藥物的吸收，也限制了藥物新劑型的開(kāi)發(fā)[3-4].透皮給藥可避免肝首過(guò)效應(yīng)，減少藥物對(duì)胃腸道的副作用，能長(zhǎng)時(shí)間維持恒定的血藥濃度，減少給藥次數(shù).但皮膚是化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體的天然屏障，其阻礙了藥物的經(jīng)皮滲透，使藥物的治療效果下降[5-7].因此設(shè)計(jì)有效的透皮制劑需克服皮膚阻礙．電致孔技術(shù)可增加藥物的透皮速率和累積滲透量，其原理是利用瞬間脈沖電場(chǎng)的作用力改變皮膚中脂質(zhì)雙分子層的排列順序，從而形成新的通道，促使藥物分子順利透過(guò)[8-9]．近幾年來(lái)，電致孔技術(shù)在透皮給藥實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用廣泛，也取得了良好的透皮效果[10-12].本文基于課題組采用助溶劑精氨酸極大改善瑞格列奈溶解度的基礎(chǔ)上[13]，制備了瑞格列奈水凝膠，考察電致孔條件下藥物凝膠的兔體內(nèi)釋放情況，建立體內(nèi)外藥物釋放相關(guān)性模型，綜合判斷制備瑞格列奈降糖水凝膠劑的可行性．

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器與試劑

Franz立式雙室擴(kuò)散儀(中科院上海有機(jī)所)；LC3000型高效液相色譜儀(北京創(chuàng)新通恒科技有限公司)；AN2651型分析天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)；DLZ-G電腦中頻治療儀(廊坊市豪邁醫(yī)療器械有限公司)．

瑞格列奈(湖北康寶泰精細(xì)化工有限公司)；卡波姆、精氨酸、尼泊金乙酯、EDTA-2Na、三乙醇胺、月桂氮酮、油酸等(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，其余試劑均為分析純．

新西蘭兔雌雄各半，合格證號(hào)：1805011，(2.5 ± 0.1)kg，購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心．

1.2 制備瑞格列奈水凝膠劑

稱取瑞格列奈-精氨酸復(fù)合物適量，溶于100 mL的蒸餾水中，得5 mg/mL的藥物溶液，并對(duì)瑞格列奈-精氨酸復(fù)合物進(jìn)行XRD表征．按順序依次加入氮酮(體積分?jǐn)?shù)1%)、油酸(體積分?jǐn)?shù)1%)、尼泊金乙酯(3 g/L)、EDTA-2Na(0.1 g/L)、甘油(體積分?jǐn)?shù)10%)和卡波姆(10 g/L)，磁力攪拌，使各組分充分混均、溶脹后，用三乙醇胺(13.5 g/L)調(diào)pH值至中性，繼續(xù)攪拌過(guò)夜，即得．

1.3 體外滲透實(shí)驗(yàn)

采用紫外分光光度法考察瑞格列奈水凝膠的體外滲透性能.將瑞格列奈干燥至恒重，精密稱定，加入甲醇配成100 μg/mL的儲(chǔ)備液．分別精密量取一定量的儲(chǔ)備液，稀釋成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定．以吸光度A對(duì)藥物質(zhì)量濃度ρ(μg/mL)作圖，得到瑞格列奈標(biāo)準(zhǔn)曲線.取一定質(zhì)量濃度的瑞格列奈對(duì)照品溶液，同日內(nèi)測(cè)定5次，連續(xù)測(cè)定5 d，考察日內(nèi)、日間精密度．在制備的凝膠劑中分別添加高(10 μg/mL)、中(5 μg/mL)、低(1 μg/mL)3種質(zhì)量濃度的瑞格列奈標(biāo)準(zhǔn)液各5份，處理后分析測(cè)定，計(jì)算回收率．

采用Franz立式擴(kuò)散池進(jìn)行體外釋放實(shí)驗(yàn)，將小鼠的離體皮膚置于擴(kuò)散池和接收池之間，用夾子固定好，角質(zhì)層一側(cè)皮膚面向上，真皮層與接收液接觸，有效接觸面積為2.69 cm2，接收池的容積為13 mL，保證裝置的密閉性良好，避免產(chǎn)生氣泡.選擇的接收液為pH=7.4的磷酸鹽緩沖液，攪拌條件為300 r/min、水浴溫度為(32±0.5)℃.將制備好的瑞格列奈水凝膠涂敷于皮膚的角質(zhì)層一側(cè)，取樣時(shí)間點(diǎn)(0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24、36、48 h)取出全部的接收液，并及時(shí)補(bǔ)充同溫同體積的接收液.將取得的接收液樣品3 000 r/min離心10 min后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品吸收度，計(jì)算含量．按下式計(jì)算藥物的單位面積累積釋放量(Q)和經(jīng)皮吸收百分率(W).

式中ρn是第n次取樣時(shí)樣品中藥物質(zhì)量濃度，V是接收池的總體積，A是有效透過(guò)面積，M是凝膠中藥物總量．

以單位面積藥物的累積滲透量(Q)對(duì)時(shí)間(t)進(jìn)行線性回歸分析，分別用零級(jí)、一級(jí)和Higuchi方程擬合，探究最佳釋放模型．

1.4 兔體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

采用HPLC法考察瑞格列奈的動(dòng)物體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)，色譜柱：Hypersil BDS C18色譜柱(46 mm×250 mm，5 μm)，柱前接ODS C18保護(hù)柱；流動(dòng)相：CH3OH-(0.02 mol/L)NH4H2PO4(體積比70∶30，pH=2.5)；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：λ=282 nm；流速：1 mL/min；柱溫：常溫；進(jìn)樣量：20 μL．

樣品制備：家兔耳緣靜脈取血約0.5 mL至含肝素的EP管中，12 000 r/min離心10 min后，精密量取上清液200 μL血漿，加入0.5 mL三氯甲烷-甲醇(體積比4∶1)溶液，渦旋振蕩5 min后離心10 min(12 000 r/min)，取有機(jī)層經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾，常溫下氮?dú)獯蹈?，加入甲醇溶?00 μL復(fù)溶，3 000 r/min離心5 min，取上清液進(jìn)行HPLC分析，每個(gè)樣品平行進(jìn)樣3次．

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及精密度、回收率考察：精密稱定瑞格列奈，用甲醇配成1 mg/mL的瑞格列奈儲(chǔ)備液，稀釋后配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取20 μL加入到180 μL空白血漿中，依上法處理血漿樣品后，進(jìn)行色譜分析，以峰面積對(duì)質(zhì)量濃度(μg/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線．取一定質(zhì)量濃度的瑞格列奈血漿樣品，處理后在相同條件下每隔3 h進(jìn)樣分析，連續(xù)測(cè)定5 d，考察方法的日間和日內(nèi)精密度．在含藥物的血漿中加入瑞格列奈標(biāo)準(zhǔn)溶液，配成低、中、高質(zhì)量濃度(1、10和40 μg/mL)的樣品各5份，處理后進(jìn)行HPLC分析，計(jì)算高、中、低3種質(zhì)量濃度的回收率．

兔體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究：將12只健康的新西蘭兔隨機(jī)分為正常組和電致孔組，每組雌雄各半，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食．除去兔背部正中至兩側(cè)5 cm×5 cm區(qū)域體毛，正常組于一側(cè)均勻涂敷瑞格列奈水凝膠，給藥劑量為10 mg/kg．電致孔組用無(wú)水乙醇潤(rùn)濕兔背部皮膚后，將導(dǎo)電電極分別接在DLZ-G型電腦中頻治療儀的正負(fù)電極上，然后貼于家兔背部電致孔處理20 min，涂抹與正常組等量水凝膠．分別于0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24、36和48 h兔耳緣靜脈取血0.5 mL，置于含肝素的EP管中．經(jīng)處理后在選定的色譜條件下進(jìn)樣分析，采用DAS 2.0軟件計(jì)算藥物的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)及藥-時(shí)曲線下面積(AUC)．同時(shí)，采取自制RPG-Arg水凝膠各個(gè)時(shí)間點(diǎn)下的累積釋放量(Q)與體內(nèi)累積AUC之間的相關(guān)性來(lái)評(píng)價(jià)自制載藥水凝膠的體內(nèi)外相關(guān)性．

2 結(jié)果與討論

2.1 瑞格列奈-精氨酸(RPG-Arg)復(fù)合物XRD表征

圖1A為瑞格列奈、精氨酸、RPG-Arg復(fù)合物、瑞格列奈與精氨酸的物理混合物粉末衍射圖譜.

a.瑞格列奈;b.精氨酸;c.瑞格列奈與精氨酸的物理混合物(質(zhì)量比5∶4);d.RPG-Arg復(fù)合物(質(zhì)量比5∶4).圖1 XRD衍射圖譜(A)，在PBS 7.4緩沖液中RPG-ARG復(fù)合物和RPG藥物的釋放曲線(B)Fig.1 X-ray powder diffractions(A), drug release from RPG-ARG complex and RPG at PBS 7.4 solution(B)

瑞格列奈主要特征峰出現(xiàn)在7.6°、10.0°、13.7°、15.2°、16.6°、20.1°、22.6°、25.3°和30.8°等處[14]，精氨酸的特征結(jié)晶峰出現(xiàn)在10.9°、14.9°、16.9°、18.2°、19.2°、23.1°和27.3°等處[15]．其物理混合圖譜中，瑞格列奈和精氨酸的特征結(jié)晶峰依然存在，二者結(jié)晶態(tài)未變．與游離藥物相比，RPG-Arg復(fù)合物(質(zhì)量比5∶4)中無(wú)明顯結(jié)晶峰，說(shuō)明添加精氨酸助溶劑后，2種分子通過(guò)分子間氫鍵作用，形成了RPG-Arg復(fù)合物，導(dǎo)致瑞格列奈和精氨酸由原有結(jié)晶態(tài)變?yōu)闊o(wú)定形態(tài)，利于藥物的快速溶出，導(dǎo)致皮膚內(nèi)外的藥物高濃度差，可有效促進(jìn)藥物的經(jīng)皮滲透，即用RPG-Arg復(fù)合物可保證透皮給藥時(shí)皮膚滲透端的藥物高濃度．當(dāng)RPG-Arg復(fù)合物中藥物以無(wú)定形狀態(tài)存在會(huì)促進(jìn)復(fù)合物中藥物釋放，如圖1B，RPG原型藥物在PBS 7.4釋放液中釋放緩慢，5 h僅釋放38%，而同條件下，RPG-Arg復(fù)合物中藥物釋放可達(dá)88%.因此，RPG-Arg復(fù)合物可有效保證透皮給藥中RPG藥物在皮膚釋放端的高濃度，利于藥物透皮吸收.

2.2 RPG-Arg復(fù)合物凝膠體外滲透

圖2 瑞格列奈水凝膠中藥物的累積釋放曲線Fig.2 Repaglinide release profile of the hydrogel

藥物水凝膠處方成分進(jìn)行紫外掃描，水凝膠處方中基質(zhì)對(duì)藥物測(cè)定無(wú)干擾.測(cè)定瑞格列奈藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y= 0.00 947x- 0.001 67(r=0.999)，線性為0.1～10 μg/mL．日內(nèi)和日間的RSD值分別為3.47%和3.75%．在制備的凝膠劑中分別添加高、中、低質(zhì)量濃度的瑞格列奈標(biāo)準(zhǔn)液，測(cè)定后計(jì)算得到瑞格列奈的高、中、低平均回收率均高于98%(n=5)．結(jié)果表明，樣品檢測(cè)方法可靠、準(zhǔn)確，符合樣品分析方法要求．

計(jì)算藥物的單位面積累積滲透量(Q)和藥物透皮吸收百分率，向擴(kuò)散池中放入5 g水凝膠，含藥25 mg.以Q為縱坐標(biāo)，時(shí)間(t)為橫坐標(biāo)，得到瑞格列奈水凝膠中藥物體外累積釋放曲線．由圖2可知，藥物在12 h之內(nèi)釋放較緩慢，在12 ～ 48 h內(nèi)釋放加快，48 h藥物的累積釋放率達(dá)到了處方量的29%．此外，如表1所示，瑞格列奈水凝膠中藥物單位面積的累積釋放量與時(shí)間存在良好的線性關(guān)系(r2= 0.978)，水凝膠中藥物釋放接近零級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，遵循Fick’s擴(kuò)散機(jī)制．

表1 瑞格列奈水凝膠中藥物累積滲透量與時(shí)間的擬合方程

兔血樣中瑞格列奈標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1 695x+15 925(r=0.997；n=6)，線性為0.1～80 μg/mL，血清中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)瑞格列奈測(cè)定無(wú)干擾，藥物出峰時(shí)間在8.9 min．檢測(cè)方法日內(nèi)和日間精密度RSD值分別為2.66%和5.35%．高、中和低3種質(zhì)量濃度瑞格列奈加樣回收率分別為100.1%、97.7%、95.7%(n=5)，結(jié)果均符合生物樣品定量分析的要求．

表2 瑞格列奈載藥水凝膠正常組、電致孔組兔體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(n=3)

表2和圖3所示，正常組水凝膠涂敷兔皮膚后，被動(dòng)擴(kuò)散的藥物在6 h其ρmax達(dá)到15.7 μg/mL，24 h后藥物開(kāi)始緩慢釋放，直到48 h藥物質(zhì)量濃度維持在1.5 μg/mL，說(shuō)明凝膠可長(zhǎng)時(shí)間維持血藥濃度，達(dá)到緩釋的目的．對(duì)比被動(dòng)擴(kuò)散組，電致孔組縮短了藥物在皮膚內(nèi)的滯留時(shí)間，兔體內(nèi)血藥質(zhì)量濃度提前至4 h達(dá)峰且增大了藥物滲透量，ρmax為23.9 μg/mL，AUC0-48為647.7 μg·h/mL，是正常組滲透量的近2倍，皮膚經(jīng)過(guò)電致孔處理后，脂質(zhì)雙分子層的排列順序被打破，形成了親水性孔道，使原本滯留在皮膚內(nèi)的藥物順利通過(guò)．此外，高壓脈沖作用可能提高了膜的滲透性，使之協(xié)同促進(jìn)藥物滲透，進(jìn)而提高藥物的滲透量，使藥物持續(xù)滲透，提高藥物的體內(nèi)生物利用度．

體內(nèi)外相關(guān)性是通過(guò)藥物體外溶出特征來(lái)預(yù)測(cè)體內(nèi)反應(yīng)的一種相關(guān)關(guān)系的數(shù)學(xué)模型，針對(duì)難溶藥物來(lái)說(shuō)，建立體內(nèi)外相關(guān)性非常重要．由于體外溶出可反映藥物體內(nèi)吸收，即通過(guò)體外水凝膠藥物的釋放曲線來(lái)預(yù)測(cè)水凝膠中藥物的兔體內(nèi)吸收情況．體內(nèi)生物利用度(AUC)與藥物進(jìn)入體循環(huán)的量成正比.本實(shí)驗(yàn)各時(shí)間點(diǎn)瑞格列奈凝膠劑的兔體外單位面積藥物累積滲透量(x)和體內(nèi)藥物累積AUC(y)，見(jiàn)表3.以AUC為縱坐標(biāo)，滲透量Q為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，以相關(guān)系數(shù)r較大者建立水凝膠的體內(nèi)外相關(guān)模型，如圖4．通過(guò)線性回歸得到體內(nèi)外相關(guān)線性方程為y=1.960 7x-25.33，r=0.98(n=12)．結(jié)果顯示自制載藥水凝膠具備良好的體內(nèi)外相關(guān)性，說(shuō)明可以通過(guò)水凝膠體外釋放來(lái)預(yù)測(cè)水凝膠中藥物的透皮吸收．

表3 各時(shí)間點(diǎn)下瑞格列奈的體內(nèi)外累積釋放

圖3 兔正常組給藥與電致孔組透皮 給藥的血藥濃度-時(shí)間曲線Fig.3 Plasma drug concentration-time curve for passive diffusion and electroporation diffusion

圖4 瑞格列奈水凝膠中藥物體內(nèi)累積生物利用度(AUC) 與體外累積滲透量的線性回歸Fig.4 Linear regression plot of accumulated absorbed in vivo AUC versus accumulated released in vitro of repaglinide hydrogel

3 結(jié)論

本文考察電致孔技術(shù)對(duì)自制瑞格列奈水凝膠透皮吸收的影響.采用HPLC進(jìn)行樣品分析，以離體鼠皮為介質(zhì)，瑞格列奈水凝膠劑的體外透皮釋放接近零級(jí)方程．兔涂敷瑞格列奈水凝膠，在48 h內(nèi)可緩釋藥物．兔皮膚電致孔處理，涂敷等量藥物水凝膠，血藥濃度的達(dá)峰時(shí)間縮短2 h且體內(nèi)藥物生物利用度顯著增大．因此，電致孔處理皮膚后涂敷載藥水凝膠可有效促進(jìn)藥物的經(jīng)皮吸收．此外，瑞格列奈水凝膠劑體內(nèi)外釋放具有顯著相關(guān)性，通過(guò)水凝膠體外釋放可推測(cè)藥物水凝膠的體內(nèi)吸收．