FaGST基因改良菊苣新種質(zhì)創(chuàng)制

陳 錫， 陳 瑩， 劉曉霞， 劉重陽， 吳 溪， 姚文琴， 趙德剛，， 王小利

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院/貴州省草業(yè)研究所, 貴陽 550006;2.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實驗室/喀斯特山區(qū)植物資源利用與育種國家地方聯(lián)合工程研究中心, 貴陽 550025)

菊苣(Cichoriumintybus)是菊科(Asteraceae)菊苣屬(Cichorium)多年生草本植物，主要分布于歐洲和地中海地區(qū)，北非、中亞和北美也有分布[1]。菊苣是一種具有很大開發(fā)潛力的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)青鮮飼用牧草，含有豐富的礦物質(zhì)，飼口性好，營養(yǎng)價值高，易消化，還有產(chǎn)量高和刈割后再生能力強(qiáng)等優(yōu)勢，許多國家已廣泛栽培利用[2-3]。因此，培育適應(yīng)性和抗性強(qiáng)的菊苣新品種對生產(chǎn)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)牧草具有重要實踐意義。

谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶是一類超家族蛋白，具有多種功能，通過選擇性ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將谷胱甘肽的代謝物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)入液泡，在細(xì)胞解毒過程中發(fā)揮重要的作用[4]。谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶廣泛分布于植物、動物、酵母和細(xì)菌中，植物中谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶被90多個基因編碼，經(jīng)脅迫誘導(dǎo)大多數(shù)基因的表達(dá)水平具有顯著差異性，它們均在酶促活性氧清除機(jī)制方面發(fā)揮著重要作用[5]。Wang等[6]在香蕉(Musaacuminata)根中分離獲得2個組成型表達(dá)的MaGSTU2和MaGSTU3基因。采用15%PEG-6000處理香蕉根部，2個基因表達(dá)量呈顯著性上調(diào)，表明MaGSTU2和MaGSTU3基因均響應(yīng)干旱脅迫。Yang等[7]在擬南芥中將剛毛怪柳(Tamarixhispida)ThGSTZ1基因過量表達(dá)，獲得轉(zhuǎn)ThGSTZ1基因擬南芥GST活性顯著增強(qiáng)。Chronopoulou等[8]將農(nóng)藥噴灑在菜豆(Phaseolusvulgaris)幼苗葉片上，從葉片中分離得到3個基因，分別是PvGSTU1、PvGSTU2和PvGSTF1，轉(zhuǎn)基因株系中GST活性為野生型的2.7～2.9倍，表明PvGSTs在植物解毒機(jī)制中具有積極作用。何學(xué)高等[9]研究表明，漆樹TvGST7基因表達(dá)增加了大腸桿菌對非生物脅迫的抗性，推測TvGST7基因?qū)η宄巧锩{迫產(chǎn)生的氧化損傷發(fā)揮著重要作用。因此，研究GST抵御植物非生物脅迫的作用，對培育植物抗性新品種具有重要意義。

本研究利用前期從高羊茅葉片中克隆獲得的FaGST基因，通過BamHI和PstI雙酶切將FaGST基因片段連接在真核表達(dá)載體pCAMBIA 1300-35 S上，成功構(gòu)建pCAMBIA 1300-35 S-FaGST過表達(dá)載體，遺傳轉(zhuǎn)化牧草菊苣，定向改良菊苣獲得新種質(zhì)。為下一步深入了解FaGST基因功能和分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為培育植物抗逆新種質(zhì)的育種研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗材料為黔引普那菊苣，由貴州省草業(yè)研究所2006年育成及保存。

菌株和質(zhì)粒:大腸桿菌(Escherichiacoli)DH 5 α、根癌農(nóng)桿菌GV 3101(Agrobacterium tumefaciens)、pCAMBIA 1300-35 S載體由武漢轉(zhuǎn)導(dǎo)生物實驗室提供。

試劑和酶:植物DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；卡那霉素(Kan)、潮霉素(Hyp)、氨芐青霉素(Amp)、DNA Marker 2000、BamHI限制性內(nèi)切酶、SalI限制性內(nèi)切酶購自寶生物工程(上海)有限公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2 X SYBR Green qPCR Master Mix均購自安諾倫(北京)生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1植物pCAMBIA 1300-35 S-FaGST過表達(dá)載體構(gòu)建

利用前期從高羊茅葉片中克隆獲得FaGST基因，分別用BamHI和PstI進(jìn)行雙酶切，將酶切的目的基因與重組質(zhì)粒pCAMBIA 1300-35 S進(jìn)行體外連接，通過熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)(DH 5 α)細(xì)胞中，置于含卡那霉素(Kan)+氨芐(Amp)的LB固體培養(yǎng)皿中培養(yǎng)16 h，挑取單菌落鑒定，經(jīng)測序分析獲得正確的pCAMBIA 1300-35 S-FaGST超表達(dá)載體，再用電激轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA 105，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2菊苣遺傳轉(zhuǎn)化

將大小均一的菊苣子葉置于人工培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)，利用活化的農(nóng)桿菌懸浮液浸染10 min，平鋪在1/2 MS添加[0.01 mg/L噻苯隆(TDZ)+1 mg/L生長素(IAA)+10 g/L蔗糖]的培養(yǎng)基中，置于光照培養(yǎng)箱[光照強(qiáng)度0.54～0.67 mmol/(m2·s)，光培養(yǎng)16 h/d，暗培養(yǎng)8 h/d，相對濕度為60%，溫度為(24±2)℃]共培養(yǎng)2 d，再用含有100 mg/mL頭孢霉素的無菌水清洗2～3次，然后轉(zhuǎn)移到MS含有2 mg/mL 6-芐氨基嘌呤(6-BA)+3 mg/L潮霉素(Hyp)+1 mg/mL IAA+10 g/L蔗糖的培養(yǎng)基上，等待長出愈傷。將愈傷移至添加1 mg/L 6-BA+1 mg/L IAA+3 mg/L Hyp+10 g/L蔗糖的MS培養(yǎng)基中，間隔7 d繼代一次，待綠芽長至3～6 cm，從愈傷組織上切下再生植株，移入添加含有1 mg/L萘乙酸(NAA)+3 mg/L Hyp+10 g/L蔗糖的MS培養(yǎng)基中15～20 d，待根系生長完整，煉苗4～5 d，移栽至營養(yǎng)土中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.3轉(zhuǎn)基因菊苣鑒定

利用試劑盒分別提取野生型和轉(zhuǎn)基因菊苣植株DNA，設(shè)計引物為Hyt-F，Hyt-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)總體系為20 μL，其中模板DNA 1 μL，Green Master Mix 10 μL，Hyt-F 1 μL，Hyt-R 1 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min，25 ℃ 5 min。利用0.9%瓊脂糖凝膠電泳拍照檢測。

表1 實驗所用引物序列Table 1 Primer sequences used in the study

圖1 pCAMBIA 1300-35 S載體結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Vector structure of pCAMBIA 1300-35 S

圖2 pCAMBIA 1300-35 S-FaGST載體結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Vector structure of pCAMBIA 1300-35 S-FaGST

1.2.4轉(zhuǎn)基因菊苣總RNA提取及cDNA合成

根據(jù)RNA試劑盒操作說明提取普那菊苣葉片總RNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳和核酸分析儀檢測質(zhì)量；按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明合成cDNA第一鏈。

1.2.5轉(zhuǎn)基因菊苣熒光定量分析

根據(jù)FaGST基因的序列，設(shè)計熒光定量特異引物：FaGST-F 2和FaGST-R 2。利用實時熒光定量PCR技術(shù)分析菊苣轉(zhuǎn)基因植株中FaGST基因的表達(dá)分析，操作步驟參照SYBR Premix ExTaqTM試劑盒說明書。以菊苣EF為內(nèi)參基因，引物序列EF-F，EF-R?？傮w系20 μL，其中SYBR Premix ExTaq(2×)10 μL、FaGST-F 3(10 μmol/L)0.5 μL、FaGST-R 3(10 μmol/L)0.5 μL、cDNA模板1 μL、雙蒸水8 μL。反應(yīng)液全程冰上配制，置于實時熒光定量PCR儀Applied BiosystemsTMQuantStudioTM3 & 5上進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)程序為:95 ℃ 2 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,40個循環(huán)。相對表達(dá)量的數(shù)據(jù)結(jié)果利用2-ΔΔct方法計算分析，利用Excel 2007軟件整理分析數(shù)據(jù)及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 FaGST表達(dá)載體構(gòu)建

利用實驗室前期從高羊茅中克隆獲得FaGST基因，通過BamHI和PstI雙酶切pCAMBIA 1300-35 S空載體，并回收目的片段，利用T 4連接酶連接，完成載體構(gòu)建，該載體含有植物體內(nèi)沒有的潮霉素特異基因。

注：A為無菌苗培養(yǎng);B為共培養(yǎng);C為繼代培養(yǎng);D為生根培養(yǎng)。圖3 遺傳轉(zhuǎn)化過程Fig.3 Genetic transformation process

圖4 轉(zhuǎn)基因菊苣PCR驗證Fig.4 PCR verification of transgenic chicory

2.2 FaGST遺傳轉(zhuǎn)化菊苣的獲得

將菊苣無菌苗葉片切成0.5 cm大小，利用農(nóng)桿菌侵染，將外植體轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)，葉片膨大形成綠色愈傷，經(jīng)3 mg/L潮霉素進(jìn)行篩選后進(jìn)行分化和生根，最后煉苗移栽。

2.3 菊苣轉(zhuǎn)基因植株鑒定

以獲得的菊苣葉片總DNA為模板，利用潮霉素hpt基因?qū)Λ@得9株轉(zhuǎn)基因菊苣進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果顯示，有9株轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)明亮條帶，而野生型植株無條帶，表明已經(jīng)成功將轉(zhuǎn)基因植株整合到菊苣基因組中。

2.4 轉(zhuǎn)基因菊苣表達(dá)量分析

以獲得的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)FaGST基因菊苣的表達(dá)量情況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因菊苣表達(dá)量均明顯上調(diào)，最大達(dá)2.89倍，說明該基因在菊苣中已過量表達(dá)，為后期菊苣的抗性研究奠定基礎(chǔ)。

3 討 論

植物谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶GST可催化谷胱甘肽與疏水、親電化合物質(zhì)的親核取代反應(yīng)。當(dāng)外界脅迫誘導(dǎo)GST時，它會作出精細(xì)調(diào)控響應(yīng)措施，提高植物適應(yīng)環(huán)境和忍耐脅迫的能力，繼而行使其解毒、抗逆及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能[10]。Takesawa等[11]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法使GST基因在水稻(Oryzasativa)中過量表達(dá)，發(fā)現(xiàn)低溫條件下可增加水稻種子的萌發(fā)率及生長量。George等[12]從大棗(Prosopisjuliflora)葉片中克隆出PjGSTU1基因，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將過表達(dá)載體遺傳轉(zhuǎn)化煙草(Nicotianatabacum)，增強(qiáng)了煙草抵抗干旱脅迫的能力。LoCicero等[13]從甜橙(Citrussinensis)中克隆獲得2個谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因，命名為CsGSTU1和CsGSTU2，將這2個基因在煙草中異源過表達(dá)，增加了煙草抵御鹽脅迫和干旱脅迫的能力。Chan等[14]將從大豆(Glycinemax)中克隆到的GmGSTL1基因在煙草及擬南芥(Arabidopsisthaliana)中異源過表達(dá)，增強(qiáng)了它們抵抗鹽脅迫的能力。Bjarnholt等[15]研究發(fā)現(xiàn)，GSTL能促進(jìn)代謝流之間正常進(jìn)行切換。

圖5 轉(zhuǎn)基因菊苣表達(dá)量分析Fig.5 Expression levels analysis of transgenic chicory

逆境導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧含量大幅度提高，致使細(xì)胞結(jié)構(gòu)和代謝物質(zhì)產(chǎn)生氧化，植物生長發(fā)育和代謝受到嚴(yán)重影響[16-17]。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、GST和過氧化物酶(POD)等會形成保護(hù)酶系統(tǒng)，將植物體內(nèi)多余的活性氧及其他有害的自由基進(jìn)行有效清除，分解對細(xì)胞有害的代謝物質(zhì)，達(dá)到減緩或免受傷害的目的，從而起到保護(hù)作用[18]。植物谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶在脅迫下可增強(qiáng)植株抵御環(huán)境壓力的能力，因此通過GST改良植物從而獲得抗逆新品種，對逆境條件下增強(qiáng)植物的品質(zhì)和抗性具有非常重要的意義。本研究構(gòu)建FaGST基因過表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化菊苣，使用潮霉素進(jìn)行篩選，成功獲得轉(zhuǎn)基因植株，通過實時熒光定量PCR技術(shù)檢測，轉(zhuǎn)基因菊苣中FaGST基因表達(dá)量明顯上調(diào)，表明該基因已經(jīng)成功整合到菊苣植株中，為下一步抗性功能研究奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

初步建立了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菊苣的轉(zhuǎn)基因體系，通過繼代后可以穩(wěn)定出苗。成功構(gòu)建過表達(dá)載體pCAMBIA 1300-35 S-FaGST，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化菊苣，獲得轉(zhuǎn)基因菊苣植株，為下一步研究菊苣的抗性奠定基礎(chǔ)。