基于網(wǎng)絡藥理學研究金鈴子散治療乳腺癌作用機制

張麗宏，王 茜，王麗娟，王業(yè)秋，安麗鳳*，楊 柳，薛 慧，黃敬文

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學 佳木斯學院，黑龍江 佳木斯 154002； 2.黑龍江省眼科醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150007)

乳腺癌是一種嚴重威脅女性健康，發(fā)生在乳腺上皮組織中的惡性腫瘤[1]。據(jù)流行病學顯示，女性一生中患乳腺癌的概率為12.3%，近年來中國乳腺癌疾病患病率呈現(xiàn)上升趨勢[2]。目前乳腺癌的治療以西醫(yī)治療為主，只在術前防治和術后恢復階段通過中醫(yī)進行個體化治療，以提高患者的生活質量。乳腺癌的中醫(yī)名稱為“乳巖”，中醫(yī)認為該病多因情志因素致病，且與肝臟密切相關。肝郁氣滯是乳腺疾病的共有病因，其中肝郁化火為乳腺癌術前常見證型之一[3-4]，故其治療重在疏肝行氣。

金鈴子散中兩味主藥皆入肝經(jīng)，川楝子長于疏肝瀉火；延胡索活血行氣止痛，善行血中氣滯、氣中血滯，從而專治一身上下之疼痛。臨床上常用該方治療肝氣久郁化火所致的乳腺癌術前疼痛，效果較好。已有研究證實金鈴子散的活性成分川楝素、延胡乙素、小檗堿等有抗癌作用，不過其治療乳腺癌的作用機理尚未明確[5]。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學，應用各種數(shù)據(jù)庫對藥物-成分-靶點網(wǎng)絡進行可視化和富集分析，探究金鈴子散治療乳腺癌的作用機制，為后期動物實驗和臨床研究提供參考依據(jù)，以發(fā)揮金鈴子散改善乳腺癌患者生存質量及防治乳腺癌的作用。

1 材料與方法

1.1 金鈴子散有效成分及作用靶點收集

從TCMSP(https：//tcmspw.com/tcmsp.php)平臺檢索出川楝子、延胡索的化學成分，按照口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18的要求，并結合相關文獻選出有效成分，同時應用TCMSP收集各活性成分作用的靶標蛋白[6-7]。運用Uniprot(http：//www.uniprot.org)數(shù)據(jù)庫及Perl(https：//www.perl.org/ger.html/)語言腳本將收集的靶點進行基因注釋，得到活性成分ID、活性成分名稱及靶基因名稱等數(shù)據(jù)。

1.2 乳腺癌相關靶點收集

通過GeneCards(https：//www.genecards.org/)在線數(shù)據(jù)庫搜索乳腺癌的關鍵詞“Breast Cancer”，得到乳腺癌的靶點。

1.3 構建中藥-活性成分-疾病靶點可視化網(wǎng)絡

將金鈴子散活性成分作用靶點去重后，應用Venny2.1(http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/ v-enny/index.html)網(wǎng)絡分析工具，將金鈴子散與乳腺癌靶點上傳取交集。其交集結果是金鈴子散治療乳腺癌的潛在靶點，可進一步明確并預測兩者間的相互作用。使用Cytoscape3.7.0(http：//cytoscapeweb.cytoscape.org/)軟件，構建出“中藥-化合物-疾病靶點”網(wǎng)絡。最后運用Cytoscape插件CytoNCA分析潛在靶點的度中心性(DC)，得到核心靶點。

1.4 構建蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡

在功能蛋白聯(lián)系網(wǎng)絡STRING(https：//string-db.org/)數(shù)據(jù)庫中，利用“1.3”項中篩選出的共同靶蛋白得到蛋白質相互作用網(wǎng)絡模型。

1.5 金鈴子散治療乳腺癌的GO和KEGG注釋

為了進一步探究金鈴子散治療乳腺癌過程中靶標蛋白的通路及生物過程，運用DAVID6.8(https：//david.ncifcrf.gov/)在線工具進行GO功能注釋。GO又稱基因本體數(shù)據(jù)庫，包括細胞組分(GO-CC)、分子功能(GO-MF)、生物學途徑(GO-BP)，從不同層面上描述了基因產(chǎn)物的位置、功能及參與的細胞生長、分化、信號轉導等過程。運用Bioconductor(http：//bioconductor.org/packages/releade.bioc/)和R×64 3.6.1(https：//www.r·project.org/)計算機語言軟件對潛在靶基因進行KEGG富集分析。KEGG是用來分析基因產(chǎn)物在細胞中代謝通路的數(shù)據(jù)庫，從富集結果通路圖中能預測金鈴子散治療乳腺癌的作用機制。

2 結果

2.1 金鈴子散活性成分的篩選

從TCMSP平臺中收集了110 個化學成分，其中川楝子33 個，延胡索77個?？诜兴幹委熂膊r藥物進入體內后要經(jīng)過ADME過程，其中OB和 DL兩個指標對確定中藥成分是否具有活性進而影響機體有重要參考價值。以OB≥30%、DL≥0.18 為篩選條件，共篩選活性成分川楝子9個，延胡索49個。其中川楝子的化合物川楝素OB值較低，但經(jīng)過文獻查詢川楝素是重要的活性成分，故納入研究[8]。去重后一共有58個成分符合條件，見表1。

表1 TCMCP中篩選的活性成分

2.2 乳腺癌靶點篩選

通過 GeenCards 數(shù)據(jù)庫(截至2021年5月1日)得到乳腺癌相關靶標14 310個，通過篩選設置 relevance score≥20，最終獲得 1 088個相關靶點。

2.3 藥物治療乳腺癌的潛在靶點

通過TCMSP收集到金鈴子散活性成分作用的非重復靶點共208個，應用 Venn 2.1軟件將上述靶點與乳腺癌對應的1 088個疾病靶點取交集，共得到107個共同靶點，見圖1。借助Cytoscape 3.7.0軟件構建出金鈴子散-活性成分-靶點-乳腺癌網(wǎng)絡圖，見圖2。圖中共有102個節(jié)點(Nodes)表示作用靶點，有1 267條邊(Edges)表示節(jié)點之間的關系。

圖1 金鈴子散有效成分靶點和乳腺癌相關靶點的韋恩圖

圖2 “金鈴子散-靶點-乳腺癌”可視化網(wǎng)絡

2.4 PPI網(wǎng)絡圖

通過網(wǎng)頁搜索STRING在線數(shù)據(jù)庫，上傳交集靶點，物種選擇Homo sapiens，置信度設置為>0.4，選擇所有渠道，最終獲得1個107個節(jié)點、1 951條邊的PPI網(wǎng)絡圖，見圖3。度中心性(DC)表示的節(jié)點中心性可以衡量一個節(jié)點在網(wǎng)絡中的重要程度。運用CytoNCA 插件分析，可得到拓撲學指標Degree 值，其中前10位分別是蛋白激酶 B(AKT1)、雌激素受體(ESR1)、血管內皮生長因子A(VEGFA)、CASP3、轉錄因子AP-1(JUN)、Myc原癌基因蛋白(MYC)、表皮生長因子受體(EGFR)、促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK1)、白細胞介素 6(IL-6)、G1/S特異性細胞周期蛋白-D1(CCND1)，見圖4，這些基因作為網(wǎng)絡調控核心基因在藥物治療疾病的過程中發(fā)揮重要作用。

注：圓形代表潛在靶基因，圓形中不規(guī)則結構代表蛋白結構，連線代表靶基因相互關系的不同證據(jù)。

圖4 金鈴子散治療乳腺癌的關鍵靶點

2.5 靶點GO分析

使用DAVID 6.8在線數(shù)據(jù)庫上傳交集靶點，進行GO功能注釋，GO條目顯示(FDR<0.05)，包括521個BP條目、49個CC條目、101個MF條目。表2、表3、表4是FDR由小到大排名前10的BP、MF和CC條目(Trem)。其中BP富集結果表明，靶點主要參與藥物應答、凋亡過程的負調控、RNA聚合酶II啟動子的轉錄正調控、DNA模板轉錄的正調控、血管生成的正調控、血管生成、老化、雌二醇應答等生物過程；在MF富集結果顯示靶點涉及酶結合、相同蛋白結合、蛋白結合、轉錄因子結合、蛋白質二聚體化活性、蛋白質異源二聚體化活性等分子功能；CC富集結果表明靶點的細胞功能主要作用于細胞外間隙、細胞溶質、核質、細胞核。

2.6 靶點KEGG分析

使用Bioconductor和R計算機語言對交集靶點進行KEGG注釋。KEGG富集結果按P值(P<0.05)由小到大排序后取前25個條目作圖，如圖5所示。氣泡顏色越黑，代表基因統(tǒng)計學顯著性越高；氣泡越大，通路富集條數(shù)越多。主要涉及：①與腫瘤疾病類相關通路，包括乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌等；②與炎癥有關通路，包括IL-17信號通路、丙型肝炎、乙型肝炎等；③與感染相關疾病類通路，包括卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、人巨細胞病毒感染、弓形蟲病、恰加斯病等；④還有一些信號轉導通路，包括AGE-RAGE信號通路、PI3K-AKT信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑抵抗、TNF信號通路等，其中PI3K-AKT信號通路與乳腺癌的治療關系最密切。見圖5。

表2 藥物治療疾病參與的生物過程(BP)

表3 藥物治療疾病參與的分子功能(MF)

表4 藥物治療疾病參與的細胞組分(CC)

圖5 KEGG富集分析氣泡圖

3 討論

中醫(yī)藥作為乳腺癌術前防治以及術后恢復的一種輔助療法，根據(jù)辨證論治的原則實現(xiàn)個體化治療，通過調理人體陰陽平衡，扶助正氣以達到治療效果。金鈴子散首載于金代劉河間著《素問·病機氣宜保命集》，現(xiàn)代藥理學研究表明金鈴子散有抗炎和鎮(zhèn)痛等作用，對于癌癥的治療也有一定療效[9-11]。既往研究發(fā)現(xiàn)，川楝子中的主要代表成分川楝素(Toosendanin)可通過調節(jié)PKM2，發(fā)揮抑制乳腺癌糖酵解的作用，從而抑制細胞增殖，并且能夠阻滯人乳腺癌細胞的S期，誘發(fā)其早期凋亡[12-13]。延胡索乙素具有鎮(zhèn)痛作用，是延胡索的重要有效成分。研究發(fā)現(xiàn)延胡索乙素可以抑制腫瘤細胞內P-糖蛋白的過量表達，逆轉腫瘤的多藥耐藥[14]。槲皮素(Quercetin)為川楝子與延胡索的共有活性成分，通過對藥物-疾病的拓撲學分析發(fā)現(xiàn)，其自由度最大，為網(wǎng)絡核心成分。有研究表明槲皮素可以通過增加ERα表達來發(fā)揮雌激素樣作用，從而抑制乳腺癌細胞的增生[15]；還可通過抑制 EGFR/AKT 信號通路，促進乳腺癌細胞的凋亡、抑制 HIF-1生成、減少VEGF分泌、抑制腫瘤血管生成[16-17]。另一項研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可通過下調EGFR、AKT、mTOR蛋白相對表達，上調Capase9 mRNA和蛋白相對表達抑制人乳腺癌細胞生長，阻斷其細胞遷移、運動及侵襲[18-19]。不難發(fā)現(xiàn)，本研究中篩選出金鈴子散的有效活性成分對乳腺癌的治療都有研究證據(jù)。

GO富集分析表明金鈴子散對分子功能的抗氧化、信號轉導及細胞因子活化、血管生成、細胞增殖凋亡、免疫等生物學過程有一定影響，這些生物學過程和分子功能在藥物治療疾病所涉及的核心靶點及其相關通路中都有體現(xiàn)。PPI網(wǎng)絡互作蛋白分析顯示AKT1、ESR1、VEGFA、CASP3、JUN為其核心靶點。在PI3K/AKT通路中，其上游成員ERα和HER-2在乳腺癌生成中具有重要作用，而雌激素可通過增加宿主血管生成和骨髓基質細胞的募集來刺激雌激素受體(ESR1)，促進乳腺癌細胞的生長[20]。EGFR與配體結合后，可以通過VEGF等細胞因子水平的上調增加腫瘤細胞的血供，提高血管通透性為腫瘤提供營養(yǎng)[21]。EGFR受體與相關受體(HER-2)結合后可激活MAPK參與腫瘤細胞的分化、增殖[22]。凋亡的異常減少是腫瘤發(fā)生的重要原因，CASP3則是細胞凋亡的可靠標志[23]。通過上述分析發(fā)現(xiàn)，這些疾病-藥物的核心靶點可以影響腫瘤細胞的生長、凋亡和血管的生成，說明金鈴子散可通過這些靶點發(fā)揮抗乳腺癌的作用。

此研究所得到的KEGG通路富集涉及腫瘤疾病的相關通路、炎癥相關通路和信號轉導通路等，這些通路中PI3K/AKT通路富集結果尤為顯著，并且該條信號通路在乳腺癌中有高頻率失調，失調可高達70%[24]。PI3K/AKT 信號通路參與了細胞增殖、分化、凋亡和糖酵解等多種功能。通路圖中顯示(圖6)，細胞受上游生長因子(GF)、RTK等刺激后，激活1A型PI3K，使得PIP2磷酸化為PIP3，PIP3 再激活諸多下游蛋白。該通路負反饋作用由PTEN(磷酸酶-張力蛋白抑癌基因)調節(jié)，通過降解PIP3以阻斷AKT及其下游效應分子的活化[25]。PIP3與下游效應分子 AKT的PH區(qū)結合募集激活AKT，活化后磷酸化其下游靶蛋白Bad、Caspase-9、IKK/NF-κB、eNOS、FOXOS、p21等，影響腫瘤細胞的增殖、凋亡及遷移作用。據(jù)報道游離的Bcl-2具有抗凋亡作用，通過AKT的活化使促凋亡蛋白Bad與抑凋亡蛋白Bcl-2 或Bcl-xl解聚，從而抑制細胞凋亡，使腫瘤細胞存活[26]。金鈴子散干預乳腺癌后，激活的AKT通過抑制caspase-9、Bcl-2 和Bcl-xl的磷酸化，從而促進細胞凋亡。通過抑制FOXO-1 的磷酸化來抑制G1/S特異性細胞周期蛋白-D1(CCND1)的表達，使細胞在G1/S期時停止分化，從而阻止了腫瘤細胞的繼續(xù)增殖，這些分析證實了MAEKAWA 等[27]的研究。PI3K 信號通路的異常激活還可進一步影響諸多下游通路，如IKK/NF-κB通路，此通路也是調控細胞生存、增殖和凋亡反應中的重要信號轉導通路。AKT激活抑制因子 I-κB 激酶(IKK)發(fā)生磷酸化，使得轉錄因子NF-κB 得以釋放發(fā)揮作用，阻礙抑凋亡蛋白Bcl-x的表達，最終促使細胞凋亡[28]。PI3K/AKT信號通路圖說明了金鈴子散通過一系列不同靶點途徑激活或者抑制乳腺癌發(fā)生機制中的相關靶基因，從而促進細胞凋亡，抑制血管生成及細胞增殖以發(fā)揮防治乳腺癌的作用。

應用網(wǎng)絡藥理學預測金鈴子散治療乳腺癌的關鍵靶點，這些靶點通過一系列通路發(fā)揮分子功能參與了多種生物的抑癌過程，其中PI3K/AKT信號轉導通路很可能是其干預的關鍵通路。但是純理論探討有其局限性，需結合動物實驗與臨床研究進一步驗證有效成分及靶標的作用機制，以期通過中醫(yī)辨證使用金鈴子散，為臨床提供一種治療乳腺癌術前和術后恢復的有效方法。

注：黑色方塊代表在整個調控網(wǎng)絡中相關的基因和酶，說明金鈴子散可能通過這些靶點在該條通路作用于乳腺癌。