基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討黃芪桂枝五物湯治療產(chǎn)后身痛的作用機(jī)制

陳夢(mèng)雪，高波，邊安政，邵馨樂(lè)，王文東

淄博市婦幼保健院，山東 淄博 255000

產(chǎn)后身痛，又稱“產(chǎn)后關(guān)節(jié)痛”“產(chǎn)后風(fēng)”“產(chǎn)后痹”“產(chǎn)后風(fēng)濕”等，是指產(chǎn)婦在產(chǎn)后出現(xiàn)肢體或關(guān)節(jié)沉重、疼痛、酸脹、屈伸不利等癥狀[1-2]。該病臨床癥狀復(fù)雜多變，除常見(jiàn)的四肢關(guān)節(jié)肌肉不適癥狀外，還可合并有心煩失眠、自汗盜汗、畏寒乏力等癥狀，相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)及影像學(xué)檢查結(jié)果多未見(jiàn)異常[3]，因癥狀表現(xiàn)缺乏特異性而常常被臨床忽視。該病癥狀較輕的患者經(jīng)適當(dāng)調(diào)養(yǎng)多預(yù)后良好，但少數(shù)癥狀較重的患者可因治療不及時(shí)導(dǎo)致經(jīng)久不愈，給患者生理及心理造成巨大傷害[4]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，本病起病可能與雌激素水平急劇變化、骨質(zhì)疏松、自身免疫性因素、骶髂關(guān)節(jié)紊亂、產(chǎn)后恥骨分離等多種因素有關(guān)[5]。目前，也有西醫(yī)學(xué)者認(rèn)為本病多為產(chǎn)后抑郁導(dǎo)致的功能性風(fēng)濕病，采用抗焦慮抑郁藥物治療[6]。

黃芪桂枝五物湯出自《金匱要略》，具有益氣溫經(jīng)、活血通痹、止痛的功效。臨床研究證實(shí)，本方加減治療產(chǎn)后身痛具有很好的療效[7-8]。產(chǎn)后身痛因生產(chǎn)過(guò)程中真元大損，氣血空虛，發(fā)病多以氣血虧虛為本，《素問(wèn)·調(diào)經(jīng)論》載：“氣血不和，百病乃變化而生?！眹?guó)醫(yī)大師周仲瑛教授認(rèn)為，氣虛虧虛為發(fā)病基礎(chǔ)，在此基礎(chǔ)上的營(yíng)衛(wèi)不和為發(fā)病的關(guān)鍵，故臨床上多用黃芪桂枝五物湯加減以補(bǔ)益氣血、調(diào)和營(yíng)衛(wèi)。黃芪桂枝五物湯治療產(chǎn)后身痛的相關(guān)機(jī)制并不明確，因其藥物成分較多、靶點(diǎn)作用過(guò)程復(fù)雜，具體基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究的開展存在困難。故本研究希望能通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法分析黃芪桂枝五物湯治療產(chǎn)后身痛的作用靶點(diǎn)和通路，將其多成分、多靶點(diǎn)的復(fù)雜藥理學(xué)作用機(jī)制通過(guò)直觀的圖像及數(shù)值體現(xiàn)出來(lái)，為后續(xù)相關(guān)研究的開展提供參考。

1 資料與方法

1.1 黃芪桂枝五物湯活性成分收集和活性成分靶點(diǎn)篩選在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)[9](http：//tcmspw.com/tcmsp.php)以“黃芪”“桂枝”“白芍”“生姜”“大棗”為關(guān)鍵詞檢索化合物的有效成分和基本信息，篩選滿足口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，藥物相似性(drug likeness，DL)≥0.18[10]的化合物成分及其相關(guān)靶點(diǎn)。將相關(guān)靶點(diǎn)帶入U(xiǎn)ni-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)[11](https：//www.uniprot.org)篩選人源靶點(diǎn)以及標(biāo)準(zhǔn)化靶點(diǎn)信息，將每種成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)信息通過(guò)EXCEL軟件以表格形式保存。

1.2 產(chǎn)后身痛相關(guān)靶點(diǎn)篩選以“postpartum pain”“girdle pain”“l(fā)ow back pain”“pelvic girdle pain”“l(fā)umbopelvic pain”“postpartum chronic pain”“sacroiliac joint pain”等為關(guān)鍵詞在OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)[12](https：//omim.org)檢索及合并去重后獲得產(chǎn)后身痛相關(guān)疾病靶點(diǎn)。

1.3 構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)”和“疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖分別建立單位藥活性成分與活性成分作用靶點(diǎn)、疾病與疾病靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系，并分別將其導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建相應(yīng)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，利用該軟件中的“Network Analyzer”工具對(duì)該網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析。

1.4 蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與拓?fù)鋵W(xué)分析利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)[13](https：//string-db.org)分別檢索活性成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)基本數(shù)據(jù)及其關(guān)系，設(shè)置置信度>0.7[14]，物種為“智人(homo sapiens)”得到PPI關(guān)系數(shù)據(jù)結(jié)果，將結(jié)果借助Cytoscape 3.7.1軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)，運(yùn)用該軟件中的“Network Analyzer”工具對(duì)該網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)合并及關(guān)鍵靶點(diǎn)基因篩選運(yùn)用Cytoscape 3.7.1軟件中Merge功能，將黃芪桂枝五物湯活性成分靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)與相關(guān)疾病靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)合并取交集獲得藥物作用潛在靶點(diǎn)[15]。

1.6 基因本體功能(gene ontology，GO)與京都基因與基因百科全書通路(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析運(yùn)用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//david.ncifcrf.gov)，物種設(shè)置為“智人(homo sapiens)”，進(jìn)行GO生物學(xué)過(guò)程富集分析和KEGG代謝通路富集分析，獲取生物學(xué)過(guò)程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、細(xì)胞組分(cellular component，CC)[16]和通路分析的數(shù)據(jù)，以圖表形式輸出。

1.7 活性成分與靶點(diǎn)分子對(duì)接在RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)[17](https：//www.rcsb.org)與Uni-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索關(guān)鍵靶點(diǎn)并下載結(jié)構(gòu)文件，在pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)[18](https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)中下載關(guān)鍵化合物的結(jié)構(gòu)文件。將結(jié)構(gòu)文件導(dǎo)入PyMol 2.4.0和Auto Dock Tools軟件進(jìn)行處理后進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)構(gòu)由PyMol 2.4.0軟件進(jìn)行可視化處理，了解靶點(diǎn)蛋白質(zhì)與活性成分的結(jié)合方式。

2 結(jié)果

2.1 黃芪桂枝五物湯活性成分篩選通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置OB≥30%，DL≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出63個(gè)有效成分，相關(guān)信息見(jiàn)表1，由于化合物數(shù)量過(guò)多，表中僅展示OB值前15位的活性成分信息。

表1 黃芪桂枝五物湯主要活性成分

2.2 黃芪桂枝五物湯“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖的構(gòu)建黃芪桂枝五物湯的活性成分在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)共1 099個(gè)，去重后得到靶點(diǎn)229個(gè)。將藥物、活性成分和預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖1。圖1中三角形節(jié)點(diǎn)代表藥物，橢圓形節(jié)點(diǎn)代表藥物成分，橢圓形節(jié)點(diǎn)顏色表示不用藥物來(lái)源，矩形節(jié)點(diǎn)代表成分相關(guān)靶點(diǎn)，線代表疾病與作用靶點(diǎn)之間的聯(lián)系。根據(jù)Degree值大小篩選出槲皮素(quercetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、山奈酚(kaempferol)等為藥物作用的關(guān)鍵化合物。

圖1 黃芪桂枝五物湯“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

2.3 黃芪桂枝五物湯“疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖的構(gòu)建在OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索去重后共得到376個(gè)與產(chǎn)后身痛疾病相關(guān)的靶點(diǎn)。將疾病和預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，構(gòu)建“疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖2。圖2中菱形節(jié)點(diǎn)代表與產(chǎn)后身痛相關(guān)的疾病，矩形節(jié)點(diǎn)代表與疾病相關(guān)的作用靶點(diǎn)，線代表疾病與作用靶點(diǎn)之間的聯(lián)系。

圖2 黃芪桂枝五物湯“疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和拓?fù)鋵W(xué)分析

2.4.1 活性成分作用靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)將229個(gè)化合物靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中，將置信度設(shè)為0.7，蛋白相互關(guān)聯(lián)度為20，得到PPI關(guān)系文本和關(guān)系表格，將其導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件并繪制PPI網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖3。網(wǎng)絡(luò)中共246個(gè)靶點(diǎn)基因相互作用，1 613 條線表示各靶點(diǎn)蛋白間相互作用關(guān)系。以節(jié)點(diǎn)大小及顏色反映靶點(diǎn)的Degree值大小，線的粗細(xì)表示combine score值的大小。

圖3 活性成分作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4.2 疾病靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)操作方法同上，得到疾病靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖4。網(wǎng)絡(luò)中共136個(gè)靶點(diǎn)基因相互作用，237條線表示各靶點(diǎn)蛋白間相互作用關(guān)系。以節(jié)點(diǎn)大小及顏色反映靶點(diǎn)的Degree值大小，線的粗細(xì)表示combine score值的大小。

圖4 疾病靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)合并及關(guān)鍵靶點(diǎn)基因篩選運(yùn)用Cytoscape 3.7.1軟件中Merge功能，將黃芪桂枝五物湯活性成分靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)與相關(guān)疾病靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)合并取交集得到10個(gè)潛在靶點(diǎn)蛋白，分別為組織型纖溶酶原激活劑、干擾素調(diào)節(jié)因子1(interferon regulatory factor 1，IRF1)、纖溶酶原激活劑抑制劑1、氧化低密度脂蛋白受體1(oxidized low density lipoprotein receptor 1，OLR1)、載脂蛋白B-100(Apolipoprotein B-100，APOB)、中性粒細(xì)胞胞質(zhì)溶膠因子1(neutrophil cytosol factor 1，NCF1)、核轉(zhuǎn)錄因子κB抑制劑alpha (nuclear factor-kappa B inhibitor alpha，NFKBIA)、血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1，HMOX1)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1(signal transducer and activator of transcription 1，STAT1)、轉(zhuǎn)錄因子p65(簡(jiǎn)稱RELA)。其中，Degree值較大的靶點(diǎn)為STAT1、RELA、IRF1、NFKBIA。

2.6 GO和KEGG富集分析結(jié)果

2.6.1 GO功能富集分析利用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO功能富集分析，對(duì)合并網(wǎng)絡(luò)后的10個(gè)靶點(diǎn)蛋白在基因功能中的作用進(jìn)行研究，以P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共得到BP 23個(gè)、MF 5個(gè)、CC 5個(gè)。其中，黃芪桂枝五物湯治療產(chǎn)后身痛的生物過(guò)程中位于前列的有RNA聚合酶II啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控(positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter)、核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域(nucleotide-binding oligomerization domain containing 2 signaling pathway)、凋亡過(guò)程(apoptotic process)、白細(xì)胞介素-12生物合成過(guò)程的正向調(diào)節(jié)(positive regulation of interleukin-12 biosynthetic process)、對(duì)病毒的防御反應(yīng)(defense response to virus)；分子功能主要有蛋白結(jié)合(protein binding)、轉(zhuǎn)錄因子活性RNA聚合酶II核心啟動(dòng)子序列特異性(transcription factor activity，RNA polymerase II core promoter sequence-specific)、酶結(jié)合(enzyme binding)、RNA聚合酶II核心啟動(dòng)子近端區(qū)域序列特異性DNA結(jié)合(RNA polymerase II core promoter proximal region sequence-specific DNA binding)、NF-κB結(jié)合(NF-kappaB binding)；細(xì)胞成分主要有細(xì)胞液(cytosol)、I-κB/NF-κB復(fù)合物(I-kappaB/NF-kappaB complex)、核染色體(nuclear chromatin)、細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)、細(xì)胞外間隙(extracellular space)。具體結(jié)果見(jiàn)圖5、表2。由于篩選所得生物學(xué)過(guò)程條目較多，故根據(jù)P值排序，故僅選取P值最顯著的前5個(gè)條目以圖表形式表現(xiàn)。

圖5 預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的GO分析圖

表2 黃芪桂枝五物湯治療產(chǎn)后身痛的相關(guān)GO富集分析條目

2.6.2 KEGG通路富集分析將10個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG通路富集分析，以P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共得到13條通路，見(jiàn)表3、圖6。并繪制出主要通路圖，見(jiàn)圖7。圖7通路為破骨細(xì)胞分化，圖中的矩形節(jié)點(diǎn)代表某一基因(蛋白質(zhì))，白色節(jié)點(diǎn)代表通路蛋白，綠色代表黃芪桂枝五物湯的關(guān)鍵作用靶蛋白STAT1、RELA、NFKBIA、NCF1，實(shí)線箭頭代表激活，虛線箭頭代表間接關(guān)系，兩個(gè)箭頭中間帶圈的表示表達(dá)。

圖6 KEGG通路富集分析氣泡圖

圖7 KEGG通路-破骨細(xì)胞分化圖

表3 黃芪桂枝五物湯治療產(chǎn)后身痛的相關(guān)KEGG通路分析

2.7 關(guān)鍵靶點(diǎn)與靶蛋白的分子對(duì)接結(jié)果將黃芪桂枝五物湯藥物關(guān)鍵活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，判斷其進(jìn)入機(jī)體后能否與靶蛋白穩(wěn)定結(jié)合。對(duì)接結(jié)果見(jiàn)表4，關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)對(duì)接的親和力均小于-5.0 kj·mol-1[19]，結(jié)果表明，黃芪桂枝五物湯藥物關(guān)鍵靶點(diǎn)與靶蛋白有很好的結(jié)合性，研究的預(yù)測(cè)較為可靠。其中，山奈酚與RELA結(jié)合親和力最強(qiáng)，可視化分析結(jié)果見(jiàn)圖8。山奈酚化學(xué)結(jié)構(gòu)用綠色表示，其他是RELA靶蛋白結(jié)構(gòu)，TYR-285和UIS-252都是附近氨基酸殘基的名稱，由圖可見(jiàn)，山奈酚與活性位點(diǎn)附近的TYR-285和 UIS-252形成氫鍵結(jié)合到RELA。

表4 黃芪桂枝五物湯化合物與關(guān)鍵靶點(diǎn)對(duì)接信息表

圖8 山奈酚-RELA分子對(duì)接構(gòu)象圖

3 討論

本研究篩選出槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚等化合物可能為黃芪桂枝五物湯治療產(chǎn)后身痛的重要成分。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素具有顯著抑制小鼠手術(shù)引起的機(jī)械性痛覺(jué)異常[20]、減輕小鼠的氧化應(yīng)激以提高骨性能[21]、抑制Wnt/β-catenin通路以減輕大鼠的神經(jīng)病理性疼痛的功能[22]。β-谷甾醇具有與雌激素受體結(jié)合發(fā)揮雌激素或抗雌激素作用以調(diào)節(jié)骨代謝[23]、增加腦內(nèi)去甲腎上腺素及其代謝產(chǎn)物減緩小鼠抑郁癥狀[24]的功能。山奈酚可通過(guò)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等多種途徑發(fā)揮骨保護(hù)作用[25]。由這些藥物成分的作用機(jī)制可知，黃芪桂枝五物湯可改善患者身心癥狀。

黃芪桂枝五物湯治療疾病所涉及的主要基因靶點(diǎn)包括STAT1、RELA、IRF1、NFKBIA等。IRF1同干擾素調(diào)節(jié)因子家族的成員一樣，其N端包含了5個(gè)色氨酸殘基的DNA結(jié)合域，可形成的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋基序并識(shí)別干擾素刺激響應(yīng)元件，C端的關(guān)聯(lián)域可與其他同源或異質(zhì)蛋白進(jìn)行相互作用[26]。同時(shí)作為JAK-STAT信號(hào)傳導(dǎo)中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，IRF1可以誘導(dǎo)STAT1磷酸化，進(jìn)而激活STAT1[27]。STAT是一類重要的胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子，STAT1通過(guò)JAK和MAPK激活使自身C端激活區(qū)保守殘基磷酸化，形成二聚體進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)靶基因[28]。研究發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞中STAT1水平可影響RUNX2核轉(zhuǎn)位從而起到調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的功能[29]。RELA是NF-κB家族重要的成員，除同源結(jié)構(gòu)域外，還具有特殊的反式激活結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域通過(guò)募集共轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和基礎(chǔ)調(diào)節(jié)因子到靶基因調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄。RELA翻譯后修飾具有精準(zhǔn)調(diào)控NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的功能[30]，NFKBIA通過(guò)與NF-kB的關(guān)聯(lián)分離和暴露保護(hù)來(lái)調(diào)節(jié)NF-κB的活性[31]，NF-κB是B細(xì)胞中提取的多功能核轉(zhuǎn)錄因子，可與染色體上κB序列特異性結(jié)合。NF-κB作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，可參與到關(guān)節(jié)炎癥和組織破壞[32]，同時(shí)NF-κB也作為重要的下游信號(hào)分子在抑郁癥發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮一定作用[33]。

富集分析顯示，黃芪桂枝五物湯治療疾病的主要通路包括破骨細(xì)胞分化、趨化因子信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等。由破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收和由成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成共同完成骨代謝過(guò)程[34]。其中，破骨細(xì)胞過(guò)度活化可能會(huì)導(dǎo)致骨骼代謝疾病[35]，預(yù)測(cè)此過(guò)程可能是黃芪桂枝五物湯治療產(chǎn)后身痛的關(guān)鍵通路。研究發(fā)現(xiàn)，趨化因子受雌激素調(diào)控可在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中扮演重要角色[36]。其中，促炎因子白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α等可作用于下丘腦，引起HPA軸活化，參與產(chǎn)后抑郁發(fā)病的過(guò)程[37]。而產(chǎn)后抑郁又與產(chǎn)后身痛的產(chǎn)生、發(fā)展存在密切聯(lián)系[38]，推測(cè)此過(guò)程可能是黃芪桂枝五物湯調(diào)理患者身心健康的重要組成部分。HIF-1是一種異源二聚體，其亞基HIF-1α，能調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)[39]。HIF-1α/Notch信號(hào)通路能夠調(diào)節(jié)椎間盤中的細(xì)胞增殖、凋亡和代謝，并與椎間盤退變有關(guān)[40]。分子對(duì)接顯示，關(guān)鍵化合物成分和篩選出的關(guān)鍵靶點(diǎn)的靶蛋白具有較好的親和力，初步驗(yàn)證了一部分研究結(jié)果。

綜上所述，黃芪桂枝五物湯中的槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚等化合物可能通過(guò)破骨細(xì)胞分化、趨化因子信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等通路，作用于STAT1、RELA、IRF1、NFKBIA等靶點(diǎn)治療產(chǎn)后身痛。但因網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的條件限制[41]及相關(guān)疾病靶點(diǎn)收集不全面等因素影響，本研究結(jié)果存在一些不足，未來(lái)需繼續(xù)對(duì)無(wú)法客觀量化的中藥成分進(jìn)入人體后的代謝轉(zhuǎn)換及其組織分布等進(jìn)行深入研究[42]，細(xì)化研究方法，結(jié)合基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究完善相關(guān)作用機(jī)制。