活性肽灌胃對(duì)阿爾茨海默病大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及海馬組織Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性影響

楊新柱，趙效國(guó)，馬依拉·買(mǎi)買(mǎi)提，呂逸霏，李莉

1 新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，烏魯木齊 830054；2 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床營(yíng)養(yǎng)科

阿爾茨海默?。ˋD）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)性疾病，在老年人群中高發(fā)，是老年癡呆最常見(jiàn)的類(lèi)型之一［1］。AD 主要表現(xiàn)為漸進(jìn)性記憶與理解功能障礙，神經(jīng)精神方面表現(xiàn)為性格發(fā)展及語(yǔ)言功能障礙，嚴(yán)重影響患者的職業(yè)、社交與生活能力［2］。AD 的病因、發(fā)病機(jī)制尚不明了，其特征性病理表現(xiàn)為β淀粉樣蛋白（Aβ）異常沉積形成的老年斑、tau 蛋白過(guò)度磷酸化導(dǎo)致的中樞神經(jīng)細(xì)胞纖維纏結(jié)（NFTs）及神經(jīng)元大量丟失等，目前尚無(wú)有效的治療藥物［3-5］?；钚噪氖峭ㄟ^(guò)脂質(zhì)體包裏技術(shù)特殊處理的特種乳清蛋白，其獲取需首先通過(guò)蛋白水解獲得各分子量多肽的集合，然后采用分子膜過(guò)濾將上述多肽混合物依照目標(biāo)分子量進(jìn)行篩選，最終得到目標(biāo)分子量的大分子多肽。活性肽在體內(nèi)高效利用，可調(diào)節(jié)和提高體內(nèi)生長(zhǎng)激素水平，促進(jìn)全身蛋白質(zhì)合成，調(diào)節(jié)和平衡人體內(nèi)的各項(xiàng)激素水平，其作為內(nèi)源性干細(xì)胞激活劑可全面修復(fù)、恢復(fù)受損細(xì)胞及衰老細(xì)胞功能，從而提高和改善人體器官的各項(xiàng)機(jī)能。2019年9月—2022年1月，本研究觀察了活性肽對(duì)AD大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用，并探討其可能的機(jī)制，為AD 的藥物預(yù)防及治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性SD 大鼠72 只，12～16周齡，體質(zhì)量（250±50）g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心供應(yīng)，質(zhì)量合格編碼［SCXK（新）2019-0002］；大鼠在SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)飼養(yǎng)，保持足夠的通風(fēng)和照明條件，每籠飼養(yǎng)3～4 只，自由進(jìn)食和飲水。主要藥物及試劑：活性肽（乳清蛋白粉復(fù)合粉）購(gòu)自上海十多生物科技有限公司，D-半乳糖（DGal）、鹽酸多奈哌齊購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；β-連環(huán)蛋白（β-catenin）抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）抗體、GAPDH 抗體均購(gòu)自北京博奧森海洋生物科學(xué)技術(shù)公司；動(dòng)物組織總RNA 提取試劑盒、第一鏈合成試劑盒、熒光定量試劑盒均購(gòu)自北京天根生化研究股份公司，BCA 蛋白含量測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。主要儀器：Morris 水迷宮視頻圖像監(jiān)控分析控制系統(tǒng)購(gòu)自成都泰盟科技有限公司，QutantStudio6實(shí)時(shí)熒光PCR 儀、Nanddrop000/000C 分光光度計(jì)均購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.2 動(dòng)物分組與處理方法 72 只SD 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分成空白組、模型組、多奈哌齊組、活性肽低劑量組、活性肽中劑量組、活性肽高劑量組，每組12 只。除空白組外，其余各組腹腔注入D-gal 150 mg/kg、1 次/天，以建立AD 模型，空白組腹腔注入等量生理鹽水，連續(xù)注入60 d。多奈哌齊組、活性肽低劑量組、活性肽中劑量組、活性肽高劑量組建模的同時(shí)分別灌胃給予多奈哌齊0.9 mg/（kg·d）及活性肽420、630、840 mg/（kg·d），1次/天，連續(xù)60 d。

1.3 學(xué)習(xí)記憶能力觀察 采用Morris 水迷宮測(cè)試。各組分組處理60 d，開(kāi)展Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)共歷時(shí)6 d，分為定位航行實(shí)驗(yàn)及空間探索實(shí)驗(yàn)。①定位航行實(shí)驗(yàn)：將各組大鼠從固定的象限中央面向池壁放入水中，記錄其120 s 內(nèi)找到平臺(tái)的時(shí)間，即為逃逸潛伏期；超過(guò)120 s 而未找到者，引導(dǎo)其爬上平臺(tái)并停留10 s，訓(xùn)練進(jìn)行5 d，2 次/天。②空間探索實(shí)驗(yàn)：各組大鼠第6 天撤去平臺(tái)，記錄其120 s 內(nèi)進(jìn)入有效區(qū)域（1.5倍原平臺(tái)所在區(qū)域）的次數(shù)。

1.4 海馬組織病理觀察 采用HE 染色。各組分組處理60 d，隨機(jī)選取4 只大鼠，1%戊巴比妥鈉0.45 mL/100 g腹腔注射麻醉，待大鼠昏迷后置于解剖盤(pán)，暴露其心臟，將灌流針在左心室插入并固定；切開(kāi)右心耳，緩慢灌注提前冰凍（4 ℃）的無(wú)菌生理鹽水150 mL，至大鼠鼻尖蒼白，肝、肺臟顏色從紅轉(zhuǎn)白，右心耳流出澄清液體后，再灌注4%多聚甲醛200 mL；待大鼠四肢抽搐痙攣，斷頭取腦，并于冰臺(tái)上剝離大腦雙側(cè)海馬，4%多聚甲醛固定，制片備用。依次進(jìn)行梯度乙醇脫水、組織透明、浸蠟、包埋后，將海馬組織冠狀切成4μm 厚度的石蠟切片。切片經(jīng)烘烤數(shù)小時(shí)后，脫蠟液脫蠟、透明、脫水處理后，在無(wú)菌水浸洗后，蘇木素染色1 min，1%鹽酸乙醇分化，再次充分沖洗；1%伊紅染色1 min，梯度脫水、脫蠟液透明、中性樹(shù)膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察各組海馬組織病理改變。

1.5 海馬組織β-catenin 陽(yáng)性表達(dá)情況觀察 采用免疫組化法。取各組海馬組織冠狀切片，復(fù)水后將切片用3%過(guò)氧化氫溶液室溫浸泡10 min，蒸餾水水洗3 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）充分洗片3 次，每次5 min；置枸櫞酸鹽緩沖液中，微波修復(fù)（92～98 ℃）12 min；室溫冷卻至常溫，PBS 沖洗3 次；抗原修復(fù)后，置于5%BSA中封閉30 min；去除封閉液，滴加稀釋后的多克隆兔抗β-catenin（1∶500），4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。次日使用PBS 沖洗3 次，在切片組織表面滴加稀釋后的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，37 ℃恒溫箱孵育30 min；PBS 沖洗3 次，向組織表面均勻滴加DAB 顯色液顯色60 s，直至在顯微鏡下觀察到組織出現(xiàn)棕黃色，自來(lái)水終止；蘇木素復(fù)染1 min，鹽酸分化，梯度乙醇脫水，中性樹(shù)膠封片。顯微鏡下觀察各組海馬組織β-catenin蛋白定位及數(shù)量等。

1.6 海馬組織GSK-3β、β-catenin mRNA 表達(dá)檢測(cè)采用Real-time PCR法。取各組分組處理60 d的剩余大鼠，心臟灌注后取出大腦，分離海馬組織，置于液氮中速凍并轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存。稱(chēng)取海馬組織20 mg，加入裂解液、研磨珠，在自動(dòng)研磨儀研磨數(shù)次后，提取海馬總mRNA。檢測(cè)各樣本mRNA 純度，在260、280 nm 處測(cè)定吸光度A260/A280為1.9～2.0 時(shí)，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，GSK-3β、β-catenin及內(nèi)參GAPDH的引物序列由上海生工生物工程股份公司設(shè)計(jì)合成，引物序列見(jiàn)表1。PCR 擴(kuò)增條件：95 ℃、15 min，循環(huán)1 次；95 ℃、10 s，60 ℃、32 s，循環(huán)40 次；65～95 ℃繪制溶解曲線。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 GSK-3β、β-catenin及內(nèi)參GAPDH的引物序列

1.7 海馬組織GSK-3β、β-catenin蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting 法。將1.6 中凍存的各組大鼠海馬組織取出，剪成200～500 mg的組織，加入250～500μL RIPA 裂解液及蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，于研磨儀充分勻漿。4 ℃條件下14 000 r/min 離心10 min，取上清液。BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣本濃度，加入RIPA使各樣本濃度歸一化。采用聚丙烯酰胺凝膠（SDSPAGE）制膠、電泳，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h。將PVDF 膜浸泡在稀釋后的β-catenin（1∶5 000）、GSK-3β（1∶1 000）的一抗中，4 ℃搖床孵育過(guò)夜；次日將洗滌后的PVDF 膜浸泡在二抗（1∶5 000）中，室溫孵育1 h。洗膜后將PVDF 膜浸泡在ECL 化學(xué)發(fā)光劑中，取出后凝膠成像儀曝光顯色。用Image J軟件分析條帶灰度值，以GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)方法，呈正態(tài)分布以±s表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠逃避潛伏期及進(jìn)入有效區(qū)域的次數(shù)比較 與空白組比較，模型組大鼠逃逸潛伏期明顯延長(zhǎng)，進(jìn)入有效區(qū)域的次數(shù)明顯減少（P均＜0.05）。與模型組比較，多奈哌齊組、活性肽高劑量組大鼠逃逸潛伏期均縮短、進(jìn)入有效區(qū)域的次數(shù)明顯增多（P均＜0.05），而活性肽低、中劑量組變化不明顯（P均＞0.05）。多奈哌齊組和活性肽高劑量組大鼠逃逸潛伏期、進(jìn)入有效區(qū)域的次數(shù)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠逃避潛伏期及進(jìn)入有效區(qū)域的次數(shù)比較（±s）

表2 各組大鼠逃避潛伏期及進(jìn)入有效區(qū)域的次數(shù)比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與多奈哌齊組比較，△P＜0.05；與活性肽低、中劑量組比較，▲P＜0.05。

組別空白組模型組多奈哌齊組活性肽低劑量組活性肽中劑量組活性肽高劑量組n 12 12 12 12 12 12逃逸潛伏期（s）26.94±2.49 39.31±3.70*28.94±3.34#32.75±3.61 31.81±2.90 24.33±1.90#▲進(jìn)入有效區(qū)域次數(shù)（次）8.50±2.62 5.88±2.48*10.88±3.00#7.00±2.39△7.50±2.88△8.63±2.56#▲

2.2 各組大鼠海馬組織病理變化比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬區(qū)錐體細(xì)胞排列紊亂，較多神經(jīng)細(xì)胞體積縮小，出現(xiàn)細(xì)胞核固縮，并且神經(jīng)元數(shù)量明顯下降，錐體細(xì)胞也出現(xiàn)較多損傷。與模型組比較，多奈哌齊組和活性肽低、中、高劑量組神經(jīng)元數(shù)量明顯增多、形態(tài)較完整，其中活性肽高劑量組與多奈哌齊組海馬區(qū)錐體細(xì)胞大多數(shù)形態(tài)較正常、細(xì)胞排列較為整密、核仁結(jié)構(gòu)清晰、著色均勻。見(jiàn)OSID碼圖1。

2.3 各組大鼠海馬組織β-catenin陽(yáng)性表達(dá)比較 各組大鼠海馬組織β-catenin蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，陽(yáng)性細(xì)胞呈黃褐色。與對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬組織β-catenin蛋白陽(yáng)性細(xì)胞著色淺，而且陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較少，細(xì)胞較分散。與模型組比較，多奈哌齊組和活性肽低、中、高劑量組大鼠海馬組織β-catenin蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量均增多，染色較深。見(jiàn)OSID碼圖2。

2.4 各組大鼠海馬組織GSK-3β、β-catenin mRNA表達(dá)比較 與空白組比較，模型組大鼠海馬組織GSK-3β mRNA 表達(dá)升高、β-catenin mRNA 表達(dá)降低（P均＜0.05）；與模型組比較，多奈哌齊組和活性肽低、中、高劑量組大鼠海馬組織GSK-3β mRNA 表達(dá)均降低，β-catenin mRNA 表達(dá)均升高（P均＜0.05）。多奈哌齊組和活性肽高劑量組大鼠海馬組織GSK-3β、β-catenin mRNA 表達(dá)比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠海馬組織GSK-3β、β-catenin mRNA表達(dá)比較（±s）

表3 各組大鼠海馬組織GSK-3β、β-catenin mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與多奈哌齊組比較，△P＜0.05；與活性肽低、中劑量組比較，▲P＜0.05。

組別空白組模型組多奈哌齊組活性肽低劑量組活性肽中劑量組活性肽高劑量組n 4 4 4 4 4 4 GSK-3β mRNA 1.01±0.18 1.81±0.68*0.79±0.34#1.41±0.10 1.16±0.46#0.85±0.37#β-catenin mRNA 1.00±0.11 0.38±0.22*1.87±0.52#1.20±0.52＃△1.56±0.15#1.61±0.16#

2.5 各組大鼠海馬組織GSK-3β、β-catenin蛋白表達(dá)比較 與空白組比較，模型組大鼠海馬組織GSK-3β蛋白表達(dá)升高、β-catenin蛋白表達(dá)降低（P均＜0.05）；與模型組比較，多奈哌齊組和活性肽低、中、高劑量組大鼠海馬組織GSK-3β蛋白表達(dá)均降低，β-catenin蛋白表達(dá)均升高（P均＜0.05）。多奈哌齊組和活性肽高劑量組大鼠海馬組織GSK-3β、β-catenin 蛋白表達(dá)比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05）。見(jiàn)表4、圖1。

表4 各組大鼠海馬組織GSK-3β、β-catenin蛋白表達(dá)比較（±s）

表4 各組大鼠海馬組織GSK-3β、β-catenin蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與多奈哌齊組比較，△P＜0.05。

組別空白組模型組多奈哌齊組活性肽低劑量組活性肽中劑量組活性肽高劑量組n 4 4 4 4 4 4 GSK-3β 0.72±0.50 1.07±0.11*0.70±0.16#0.71±0.18#0.62±0.09#0.72±0.16#β-catenin 0.79±0.76 0.53±0.38*0.99±0.15#0.75±0.17△1.09±0.17#1.00±0.75#

圖1 各組大鼠海馬組織β-catenin、GSK-3β蛋白表達(dá)條帶圖（Western blotting法）

3 討論

AD 病因復(fù)雜多樣，其發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，目前沒(méi)有有效的治療手段［6］。在世界老齡化日益加重的趨勢(shì)下，AD 發(fā)病率逐年上升，已成為一個(gè)不容忽視的公共健康問(wèn)題［7］。研究表明，D-gal 能導(dǎo)致動(dòng)物亞急性衰老，在細(xì)胞內(nèi)大量堆積可引起細(xì)胞代謝功能紊亂，以致體內(nèi)活性氧增多，從而損害生物膜及其他高分子功能和結(jié)構(gòu)，并導(dǎo)致機(jī)體多器官、多系統(tǒng)功能衰退［8］。此外，AD 患者腦組織中出現(xiàn)明顯的過(guò)氧化反應(yīng)，D-gal可通過(guò)產(chǎn)生過(guò)量活性氧和氧自由基引起氧化應(yīng)激損傷和抗氧化機(jī)制失衡，加快腦組織退化過(guò)程［9-11］。本研究通過(guò)腹腔注射D-gal 建立AD模型，結(jié)果顯示與空白組比較，模型組大鼠海馬區(qū)錐體細(xì)胞排列紊亂，較多神經(jīng)細(xì)胞體積縮小，出現(xiàn)細(xì)胞核固縮，并且神經(jīng)元數(shù)量明顯下降，錐體細(xì)胞也出現(xiàn)較多損傷，且逃逸潛伏期升高、進(jìn)入有效區(qū)域的次數(shù)降低，提示AD 模型建立成功。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，多奈哌齊組及活性肽低、中、高劑量組大鼠逃逸潛伏期均降低，進(jìn)入有效區(qū)域的次數(shù)均升高，以多奈哌齊組、活性肽高劑量組變化更明顯；提示活性肽有助于提高AD 大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，且高劑量活性肽效果更好，與多奈哌齊效果相當(dāng)。

Wnt/β-catenin 信號(hào)通路與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)發(fā)育有著密切關(guān)系，在成年海馬神經(jīng)發(fā)生中對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的增殖、分化具有關(guān)鍵作用，Wnt信號(hào)通路的持續(xù)激活可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的增殖、分化［12］。GSK-3β 和β-catenin 是Wnt信號(hào)通路中的重要蛋白，一般正常細(xì)胞質(zhì)中游離β-catenin 水平極低，不能產(chǎn)生Wnt 信號(hào)；當(dāng)信號(hào)通路的某些成分發(fā)生質(zhì)或量的變化時(shí)，Wnt 信號(hào)通路被激活，Wnt 信號(hào)與細(xì)胞表面受體結(jié)合，使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)GSK-3β 復(fù)合體受到抑制，阻止β-catenin 磷酸化過(guò)程，進(jìn)而使β-catenin 進(jìn)一步聚集，從而轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，激活轉(zhuǎn)錄并調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)［13-15］。近期研究也證明，當(dāng)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路被抑制時(shí)，會(huì)導(dǎo)致GSK-3β 表達(dá)升高和β-catenin表達(dá)水平降低，進(jìn)而引起Aβ 異常沉積和tau 蛋白過(guò)度磷酸化，最后導(dǎo)致AD 的發(fā)生［16-17］。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬組織GSK-3β mRNA 和蛋白表達(dá)高于空白組，β-catenin mRNA 和蛋白表達(dá)低于空白組，說(shuō)明AD 大鼠海馬中Wnt/β-catenin 信號(hào)通路被抑制；而多奈哌齊組和活性肽低、中、高劑量組大鼠海馬組織GSK-3β mRNA 和蛋白表達(dá)均低于模型組，β-catenin mRNA 和蛋白表達(dá)均高于模型組，且多奈哌齊組和活性肽高劑量組比較并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；說(shuō)明活性肽可以激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，高劑量活性肽對(duì)于AD 大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及Wnt/βcatenin信號(hào)通路激活作用與多奈哌齊效果相當(dāng)。

綜上所述，活性肽對(duì)AD 大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用，且劑量越高效果越好，其機(jī)制可能與激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路有關(guān)，為AD 的早期預(yù)防和治療奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。