逆境脅迫和植物生長調(diào)節(jié)劑對甘草種子萌發(fā)的影響

劉長樂，寇佩雯，許祎珂，張永生，高 靜，賀壯壯，李帥帥，黃文靜*

（1.陜西中醫(yī)藥大學/陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心/秦藥特色資源研究開發(fā)國家重點實驗室（培育）/陜西中藥產(chǎn)業(yè)技術研究院，陜西 咸陽 712083；2.陜西海天制藥有限公司，陜西 咸陽 712046；3.陜西中醫(yī)藥大學藥學院，陜西 咸陽 712046）

種子發(fā)芽是種子植株完成其生活史和繁殖下一代的重要生理過程和關鍵階段［1］，是植物適應環(huán)境變化以保持自身繁衍的重要特性［2］，對植物的定居、群落演替與動態(tài)起著決定作用［3］。因此深入研究種子發(fā)芽對探索植株的分布、進化、保護及合理利用具有重要意義。種子發(fā)芽受溫度、水分、鹽堿、pH 等多種環(huán)境因子影響，是一個復雜的生理過程［4-6］。大量研究證明，植物種子發(fā)芽在受到非生物脅迫（如干旱、低溫、鹽漬等）時可對種子抗逆酶、滲透調(diào)節(jié)物質、細胞膜的結構和功能等造成影響或傷害［7-8］，如溫度是影響種子的主要生態(tài)因子之一，通過影響種子內(nèi)部酶活性和物質代謝進程直接或間接影響種子發(fā)芽［9］。

植物種子發(fā)芽受外部環(huán)境和內(nèi)源激素的共同調(diào)節(jié)。近年來，外源植物激素在提高植物抗逆方面取得較多成果［10］。外源植物激素不僅能調(diào)節(jié)和控制作物生長發(fā)育，而且能調(diào)控植物體細胞基因的表達，協(xié)調(diào)植株的生長與外界條件的關系，對提高植株抗逆性和產(chǎn)量具有重要意義［11］。褪黑素（Melatonin，MT）作為一種新型植物生長調(diào)節(jié)劑，可有效緩解逆境脅迫對種子發(fā)芽造成的損傷，增強植株抵抗逆境脅迫的能力［12］。向警等用MT 處理鹽脅迫下的水稻種子發(fā)芽與幼苗生長，發(fā)現(xiàn)MT 能夠增強水稻幼苗抗氧化與滲透調(diào)節(jié)能力，提高幼苗的耐鹽性［13］。萘乙酸（Naphthalene acetic acid，NAA）是一種廣譜型外源植物激素，可促進植物細胞分裂，提高植物抗氧化酶，促進植物發(fā)芽［14］。吲哚乙酸（Indole acetic acid，IAA）是植株內(nèi)最豐富的內(nèi)源生長素，一定的濃度外源IAA 可促進種子發(fā)芽和幼苗的形成［15］。NAA 和IAA 浸種可以顯著提高種子活力指數(shù)，促進根莖的伸長，增加植株體內(nèi)丙二醛和可溶性糖含量等［16］。

甘草為豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch.）、脹果甘草（Glycyrrhiza inflataBat.）或光果甘草（Glycyrrhiza glabraL.）的干燥根和根莖，性甘、平，具有調(diào)和諸藥、清熱解毒、祛痰止咳等作用，用于緩解藥物毒性、烈性脾胃虛弱，倦怠乏力，心悸氣短等，素有“國老”之稱［17］。甘草采挖歷史悠久，但由于過度采挖、種群遷徙及退化和生態(tài)環(huán)境改變，野生甘草資源瀕臨枯竭，野生撫育和人工種養(yǎng)相結合的資源產(chǎn)業(yè)是甘草中藥資源發(fā)展的必經(jīng)之路［18］。甘草種子發(fā)芽特性研究是甘草中藥材質量形成的起點和建立甘草種子種苗標準的基礎，對甘草中藥資源種群建構具有重要意義［19］。本實驗通過對野生烏拉爾甘草種子進行不同處理，探討提高烏拉爾甘草種子發(fā)芽率的最適條件，以期為甘草人工育苗、栽培過程及甘草規(guī)范化種植提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試野生烏拉爾甘草種子于2020 年3 月采自新疆烏魯木齊縣（東經(jīng)87°40′83"，北緯43°47′06"），經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學藥學院王繼濤高級實驗員鑒定為豆科植物甘草（G. uralensis）種子。收獲凈種后，經(jīng)打磨后放入編織袋內(nèi)，于2～8℃冷柜貯藏。試驗在陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，于2020年9月-2021年6月份進行。

1.2 主要儀器與試劑

RTOP-400Y 智能人工氣候箱（浙江托普云農(nóng)科技股份有限公司）、90 mm 玻璃培養(yǎng)皿、聚乙二醇-6000（PEG-6000）、氯化鈉（NaCl）、碳酸鈉（Na2CO3）、30%雙氧水（H2O2）、鹽酸（HCl）、氫氧化鈉（NaOH）、萘乙酸（NAA）、3-吲哚乙酸（IAA）、褪黑素（MT）均為分析純。

1.3 方法

采用紙皿法，選取大小一致，籽粒飽滿的野生烏拉爾甘草種子消毒（7.5% H2O2浸泡30 min，蒸餾水沖洗4～5 次至無味），用無菌濾紙吸干水分備用。將消毒后的甘草種子置于鋪有雙層無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿30 粒種子，加10 mL 溶液。溫度、pH、NaCl、PEG-6000 和雙重脅迫及MT、NAA 和IAA 實驗置于人工氣候箱中培養(yǎng)，光照12 h/黑暗12 h，光照強度3000 lx，濕度60%，以種子胚根突出種皮的長度為種子長度的1/2 為標準，3 次重復，記錄發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽時滯。計算公式如下：

發(fā)芽率（%）=7 d 內(nèi)發(fā)芽的總粒數(shù)/供試種子總數(shù)×100%

發(fā)芽勢（%）＝3 d 內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%

發(fā)芽時滯（d）=第1 粒種子發(fā)芽時間-種子種植的時間

1.3.1 種子形態(tài)特征觀察及千粒測重

采用四分法隨機挑選6 粒的烏拉爾果甘草種子，用體視顯微鏡對其形態(tài)特征進行觀察。千粒測重采用五百粒法［20］，四分法隨機取500粒，放到培養(yǎng)皿上稱重，重復5次，計算種子質量。

1.3.2 溫度對種子發(fā)芽的影響

將烏拉爾甘草種子分別置于5、10、15、20 和25℃人工氣候箱中培養(yǎng)，計算發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽時滯。

1.3.3 pH對種子發(fā)芽的影響

用稀鹽酸和NaOH 溶液調(diào)整蒸餾水pH 值為2、4、6、8、10，分別將烏拉爾甘草種子置于不同pH 的溶液中，在25℃人工氣候箱中培養(yǎng)。

1.3.4 水分脅迫對種子發(fā)芽的影響

在25℃光照培養(yǎng)箱中，將烏拉爾甘草種子置于0（CK）、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g/mL 不同濃度的PEG-6000溶液中進行發(fā)芽試驗。

1.3.5 鹽脅迫對種子發(fā)芽的影響

將烏拉爾甘草種子置于0（CK）、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4 mol/L 不同濃度的NaCl 溶液中，在25℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.6 干旱和鹽雙重脅迫對種子發(fā)芽的影響

將烏拉爾甘草種子置于NaCl 濃度為0.1、0.15、0.2 mol/L 和PEG-6000 濃度為0.05、0.10、0.15 g/mL共九個處理組（見表1），蒸餾水組為對照，在25℃人工氣候箱中培養(yǎng)。

表1 雙重脅迫實驗設計Table 1 Double stress experiment design

1.3.7 覆土厚度對種子發(fā)芽的影響

將烏拉爾甘草種子播于育苗盤，分別覆蓋細沙土0、0.5、1、1.5、2 cm，在組織培養(yǎng)室內(nèi)光照12 h/黑暗12 h進行種子出苗試驗。

1.3.8 褪黑素對種子發(fā)芽的影響

將烏拉爾甘草種子分別置于0、50、100、300、500 μmol/L 的褪黑素溶液中浸泡24 h，用蒸餾水洗凈，水分揮干后，在0.2 mol/L 的NaCl溶液中培養(yǎng)，于25℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.9 萘乙酸對種子發(fā)芽的影響

將種子分別置于0、5、50、100、300、500 mg/L 的萘乙酸溶液中浸泡24 h 后，用蒸餾水洗凈，水分揮干后在25℃光照培養(yǎng)箱中進行發(fā)芽試驗。

1.3.10 3-吲哚乙酸對種子發(fā)芽的影響

將烏拉爾甘草種子分別置于0、5、50、100、300、500 mg/L 的3-吲哚乙酸溶液中浸泡24 h，用蒸餾水洗凈，水分揮干后在25℃光照培養(yǎng)箱中進行發(fā)芽試驗。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2019 整理原始數(shù)據(jù)，DPS7.05 統(tǒng)計軟件進行方差分析（ANOVA）和多重比較。

2 結果與分析

2.1 烏拉爾甘草種子形態(tài)特征及千粒重

野生烏拉爾甘草種子呈圓腎形，表面黃綠色或褐色，表面光滑，種臍周邊有一微隆起暗色環(huán)，種脊棕色條狀隆起，千粒重為8.0042 g±0.1722 g。

表2 烏拉爾甘草種子形態(tài)特征觀察Table 2 Morphological characteristics of G. uralensis seeds

2.2 溫度對烏拉爾甘草種子發(fā)芽的影響

由表3可知，不同溫度條件下，烏拉爾甘草種子發(fā)芽存在顯著差異。隨著溫度的升高，烏拉爾甘草種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率逐漸增加，發(fā)芽時滯減少。20℃和25℃時發(fā)芽勢和發(fā)芽率無顯著差異，15℃時種子發(fā)芽勢降低至26.67%，發(fā)芽時滯增長至4 天，5℃時種子發(fā)芽時滯達10 天，可見低溫對烏拉爾甘草種子發(fā)芽具有明顯抑制作用。

表3 溫度對烏拉爾甘草種子發(fā)芽的影響Table 3 The effect of temperature on the germination of G.uralensis seeds

2.3 pH對烏拉爾甘草種子發(fā)芽的影響

由表4 可知，烏拉爾甘草種子在pH 值為2～10之間均能發(fā)芽，pH 值為4、6 和8 時烏拉爾甘草種子發(fā)芽勢無顯著差異，發(fā)芽率較高且差異性較小，說明烏拉爾甘草種子在pH 值為4～8 的環(huán)境中發(fā)芽能力較強。pH 值為2 時發(fā)芽勢和發(fā)芽率顯著降低，說明pH較低的環(huán)境可抑制烏拉爾甘草種子發(fā)芽。

圖1 烏拉爾甘草種子Fig. 1 Pictures of G. uralensis seeds

表4 pH對烏拉爾甘草種子發(fā)芽的影響Table 4 The effect of pH on the germination of G. uralensis seeds

2.4 水分脅迫對烏拉爾甘草種子發(fā)芽的影響

由表5可知，隨著PEG 濃度的升高，烏拉爾甘草種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢逐漸降低，發(fā)芽時滯增加。從發(fā)芽勢分析，當PEG 濃度≤0.15 g/mL 時，烏拉爾甘草種子發(fā)芽勢均保持在68.89%以上，當濃度增加至0.2 g/mL 時發(fā)芽勢顯著降低至38.89%；從發(fā)芽率分析，當PEG 濃度為0.05 ～0.15 g/mL 時，烏拉爾甘草種子發(fā)芽率無顯著性差異，當濃度增加至0.25 g/mL時發(fā)芽率顯著降低至27.78%，較0.15 g/mL 下降50%。由此可知，PEG-6000 溶液的濃度為0.2 g/mL時是種子發(fā)芽能力顯著降低的轉折點，高于此濃度時種子發(fā)芽受到顯著抑制。

表5 水分脅迫對烏拉爾甘草種子發(fā)芽的影響Table 5 The effect of water stress on the germination of G. uralensis seeds

2.5 鹽脅迫對烏拉爾甘草種子發(fā)芽的影響

由表6 可知，隨著NaCl 濃度的升高，烏拉爾甘草種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢呈逐步降低的趨勢，發(fā)芽時滯增加。當NaCl濃度≤0.15 mol/L時，甘草種子發(fā)芽勢保持在75.56%以上，發(fā)芽率為83.33%以上，當濃度增加至0.2 mol/L 時發(fā)芽勢和發(fā)芽率顯著降低；當NaCl濃度增加至0.4 mol/L時，發(fā)芽勢僅為1.11%，發(fā)芽率為12.22%，表明烏拉爾甘草具有一定的抗鹽堿能力，但NaCl濃度＞0.2 mol/L時烏拉爾甘草種子發(fā)芽會受到明顯抑制。

表6 NaCl對烏拉爾甘草種子發(fā)芽的影響Table 6 The effect of NaCl on the germination of G. uralensis seeds

2.6 干旱和鹽雙重脅迫對烏拉爾甘草種子發(fā)芽的影響

由表7 可知，烏拉爾甘草種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率隨著雙重脅迫的加劇總體呈下降趨勢，雙重脅迫處理下烏拉爾甘草種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率顯著降低，發(fā)芽時滯增加。在輕度脅迫（N1P1）下烏拉爾甘草種子發(fā)芽率較CK 組差異較小。在中度脅迫下，隨著PEG-6000 濃度增加（N2P1、N2P2、N2P3）烏拉爾甘草種子各處理較CK 組發(fā)芽勢顯著下降，發(fā)芽率差異較??；隨著NaCl 濃度增加（N1P2、N2P2、N3P2）烏拉爾甘草種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率較CK 組顯著下降。重度脅迫（N3P3）下，烏拉爾甘草種子發(fā)芽勢僅為8.89%，發(fā)芽率僅為46.67%，表明烏拉爾甘草種子具有一定的耐旱和耐鹽堿特性，但較高濃度下的干旱和鹽交互脅迫會抑制拉爾甘草種子發(fā)芽，且鹽脅迫對甘草種子發(fā)芽影響更強。

表7 PEG-6000和NaCl雙重脅迫對種子發(fā)芽的影響Table 7 The effect of PEG-6000 and NaCl dual stress on the seed germination of G. uralensis seeds

2.7 覆土厚度對烏拉爾甘草種子發(fā)芽的影響

覆土厚度對烏拉爾甘草種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢有一定的影響（表8），在不同覆土厚度下烏拉爾甘草種子均可發(fā)芽，其中最適覆土厚度為0.5 cm，出苗率為62.22%；覆土厚度為0 cm 時，發(fā)芽時滯僅為1.67 d，發(fā)芽率與0.5 cm 覆土厚度無顯著差異，但由于出苗后胚根裸漏于空氣中，存在死苗現(xiàn)象。隨著覆土厚度增加，烏拉爾甘草種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢呈下降趨勢，發(fā)芽時滯增加。

2.8 褪黑素對鹽脅迫下烏拉爾甘草種子發(fā)芽的影響

由結果2.5 可知，0.2 mol/L NaCl 濃度下烏拉爾甘草種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢顯著降低，褪黑素預處理可顯著緩解0.2 mol/L NaCl 處理（CK 組）下對烏拉爾甘草種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢的抑制作用。50 ～500 μmol/L 褪黑素預處理的發(fā)芽勢比CK 組的發(fā)芽勢顯著提高了22.22% ～28.89%，發(fā)芽率顯著提高11.11%～17.78%，這說明褪黑素處理可顯著提高鹽脅迫下烏拉爾甘草種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢，降低發(fā)芽時滯，其中100 ～300 μmol/L預處理效果最佳。

表9 褪黑素對鹽脅迫下烏拉爾甘草種子發(fā)芽的影響Table 9 The effect of melatonin on the germination of G. uralensis seeds under salt stress

2.9 萘乙酸對烏拉爾甘草種子發(fā)芽的影響

由表10 可知，NAA 預處理后，隨著NAA 濃度增加烏拉爾甘草種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率均表現(xiàn)出逐漸降低的趨勢。當NAA 濃度為5 mg/L 時烏拉爾甘草種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率與CK 組無顯著差異；當NAA濃度＞50 mg/L時烏拉爾甘草種子發(fā)芽與CK組相比發(fā)芽勢和發(fā)芽率顯著降低；當NAA 濃度為300 mg/L時較空白組發(fā)芽勢和發(fā)芽率下降幅度為63.33%和45.56%，表明NAA 濃度≥50 mg/L 時可抑制烏拉爾甘草種子發(fā)芽。

表10 萘乙酸對烏拉爾甘草種子發(fā)芽的影響Table 10 The effect of naphthaleneacetic acid on the germination of G. uralensis seeds

2.10 3-吲哚乙酸對烏拉爾甘草種子發(fā)芽的影響

由表13 可知，烏拉爾甘草種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢呈先上升后下降的趨勢。在IAA濃度為50 mg/L時，烏拉爾甘草種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢最高，與CK 相比發(fā)芽勢增加4%，發(fā)芽率則無顯著性差異。高濃度的IAA 對甘草發(fā)芽具有抑制作用，當IAA 濃度大于300 mg/L 時，烏拉爾甘草種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率呈下降趨勢。

表11 3-吲哚乙酸對烏拉爾甘草種子發(fā)芽的影響Table 11 The effect of 3-indoleacetic acid on the seed germination of G. uralensis seeds

3 結論與討論

種子是藥材生產(chǎn)最基本、最重要的生產(chǎn)資料，種子質量的優(yōu)劣是決定植株生長發(fā)育好壞、產(chǎn)量高低的關鍵因素，也是決定藥材質量和品質的先決條件，而發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽時滯是檢驗種子質量的重要指標［21-23］。本研究發(fā)現(xiàn)，烏拉爾甘草種子在10℃以上發(fā)芽時滯較短，在20 ～25℃發(fā)芽勢和發(fā)芽率較高，種苗狀態(tài)好。甘草可適應pH 范圍較寬，可在pH 值為4～8 的環(huán)境中生長。不同濃度鹽脅迫、干旱脅迫和鹽干旱雙重脅迫處理下甘草種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢呈持續(xù)下降的趨勢，低濃度脅迫處理下對種子發(fā)芽影響不顯著，高濃度則會明顯抑制甘草種子發(fā)芽，說明甘草種子具有一定的抗鹽和抗旱能力，這與王妍等［24］研究結果相似。覆土厚度在0.5 cm 左右時，甘草種子出芽率高，發(fā)芽時滯短，不覆土不利于甘草幼苗生長，覆土過厚則不利于甘草種子發(fā)芽。

植物在逆境脅迫下體內(nèi)多種酶的平衡被打破，從而積累有害物質［25］。植物激素是調(diào)控種子休眠與發(fā)芽的最重要因素，可以打破種子的休眠狀態(tài)，加快細胞分裂，緩解或解除種子脅迫，為種子發(fā)芽創(chuàng)造條件［26-27］。100 ～300 μmol/L 褪黑素浸種預處理可顯著提高鹽脅迫下甘草種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢，低濃度和高濃度的褪黑素處理則對甘草種子發(fā)芽影響較小。這可能是因為鹽脅迫下，種子內(nèi)部滲透系統(tǒng)失衡，細胞內(nèi)Na+劇集過多，產(chǎn)生過多氧自由基進而對細胞膜造成損害［28］，植物為緩解氧化脅迫帶來的傷害，通過提高自身抗氧化酶的含量，從而減少氧自由基的積累［29］。褪黑素為吲哚類化合物，具有抗氧化作用［30］，可直接消除氧自由基及后續(xù)產(chǎn)物，同時激活種子抗氧化系統(tǒng)，清除組織內(nèi)多余氧離子，維持細胞氧化系統(tǒng)平衡［31］。大量研究指出褪黑素還可緩解干旱脅迫［32］、鎘脅迫［33］和低溫脅迫［34］等對豆科植物種子發(fā)芽和生理特性的影響。萘乙酸對烏拉爾甘草種子發(fā)芽表現(xiàn)出抑制作用，且濃度越高，抑制作用越明顯?？赡苁前l(fā)芽階段的種子組織內(nèi)乙烯含量較高，乙烯抑制生長素的合成與運輸，NAA 又可誘導乙烯合成，進而加速種子器官衰老和降低種子活力［14］。IAA 具有雙重作用，低濃度可促進種子發(fā)芽，高濃度則阻礙種子水分吸收，抑制種子發(fā)芽［35］。

在甘草人工種植過程中，甘草宜在3 ～4 月春播，選擇灌溉便利，土壤微堿性為宜，如砂質土壤等。播種前可考慮用外源植物激素預處理甘草種子，以提高種子發(fā)芽率，降低發(fā)芽時滯，提高甘草的抗逆能力，但需注意植物生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度。播種時將甘草種子均勻地播于平地表面，以蓋住種子為宜，耱平即可。