新生兒重癥監(jiān)護(hù)室金黃色葡萄球菌定植菌株的耐藥性及生物膜形成能力研究

李文婷 耿文靜 姚開(kāi)虎 周婧婧 楊鑫 孫靜 馬香,*

(1 山東大學(xué)齊魯兒童醫(yī)院，濟(jì)南 250022；2 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院，北京 100045)

金黃色葡萄球菌作為一種機(jī)會(huì)性致病菌，可以引發(fā)一系列社區(qū)和醫(yī)院獲得性感染，也可以在人體的皮膚和黏膜無(wú)癥狀定植，鼻前庭是最主要的定植部位[1]。通常情況下，金葡菌的定植者是無(wú)癥狀的健康狀態(tài)，與細(xì)菌形成共生關(guān)系，但定植狀態(tài)會(huì)增加感染的風(fēng)險(xiǎn)[2-3]，報(bào)道顯示60%～93%的金葡菌感染起源于內(nèi)源性定植菌株[4]。主動(dòng)篩查金葡菌定植狀況并有針對(duì)的進(jìn)行去定植治療可以降低相關(guān)感染的發(fā)生率、死亡率和醫(yī)療成本。據(jù)了解，我國(guó)目前針對(duì)住院患兒金葡菌定植的主動(dòng)監(jiān)測(cè)及感染防控措施較少，且定植的相關(guān)研究主要關(guān)注MRSA[5]，缺少M(fèi)SSA的相關(guān)報(bào)道。前期本課題組已對(duì)北京兒童醫(yī)院NICU患兒鼻部金葡菌定植菌株的基因型和毒力特征進(jìn)行了研究及報(bào)道[6]，發(fā)現(xiàn)ST59-IVa-t437和ST188-t189分別是MRSA、MSSA最常見(jiàn)的流行克隆，定植株的毒力基因攜帶率較高，為進(jìn)一步了解我國(guó)NICU患兒的金葡菌定植菌株的耐藥譜及生物膜形成能力，本研究對(duì)MRSA及MSSA進(jìn)行藥物敏感性實(shí)驗(yàn)及生物膜形成能力檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 患者和鼻拭子標(biāo)本

收集2015年5月20日—2016年3月20日北京兒童醫(yī)院新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房(NICU)住院的患兒病例，符合以下標(biāo)準(zhǔn)者納入本次研究：①年齡：出生至生后28 d；②入院時(shí)間＜24 h；③獲得父母或法定監(jiān)護(hù)人的知情同意。具有以下則排除：存在可能會(huì)影響采取鼻拭子的情況(例如：重度呼吸窘迫和其它臨床醫(yī)師認(rèn)定的因素)；父母或法定監(jiān)護(hù)人不同意參加該調(diào)查。采集的鼻拭子標(biāo)本暫時(shí)于-20℃低溫貯藏，冷凍狀態(tài)下轉(zhuǎn)運(yùn)至北京兒童醫(yī)院微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)和鑒定。

1.2 金葡菌的培養(yǎng)、鑒定及基因分型

通過(guò)菌落形態(tài)學(xué)、凝固酶試驗(yàn)及nuc基因檢測(cè)對(duì)菌落進(jìn)行金葡菌鑒定，采用頭孢西丁紙片(3Pg，Oxoid)法和mecA基因檢測(cè)篩查MRSA。頭孢西丁紙片法按照2014年美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)判定[7]，抑菌環(huán)直徑≤21 mm為MRSA，≥22 mm為MSSA。前期實(shí)驗(yàn)對(duì)分離株進(jìn)行了進(jìn)行多位點(diǎn)序列、金葡菌蛋白A基因及agr分型，對(duì)MRSA進(jìn)行葡萄球菌染色體盒及其亞型分型[6]。

1.3 抗生素敏感性檢測(cè)

對(duì)頭孢西丁紙片法篩選出的MSSA，根據(jù)2014年CLSI制定的標(biāo)準(zhǔn)[7]采用E-test法檢測(cè)菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素(青霉素、苯唑西林、頭孢呋辛、頭孢曲松)和非β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素(利福平、復(fù)方磺胺甲惡唑、紅霉素、莫匹羅星)共8種抗生素的最低抑菌濃度(MIC)值；MRSA菌株除上述8種抗生素外，增加對(duì)美羅培南、萬(wàn)古霉素、利奈唑胺、夫西地酸和替加環(huán)素的MIC檢測(cè)。莫匹羅星、替加環(huán)素、夫西地酸的敏感性依照歐洲抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)[8]界定。質(zhì)控菌株為ATCC29213。根據(jù)所測(cè)菌的MIC，計(jì)算MIC50及MIC90。

1.4 結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)生物膜形成能力

生物膜定量檢測(cè)參照結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)[9]。菌株在含0.25%葡萄糖的TSB液中37℃過(guò)夜培養(yǎng)，調(diào)整菌液濃度為McFarland等級(jí)0.5濃度(～1.5×108CFU/mL)，并在含0.25%葡萄糖的TSB中稀釋至最終濃度106CFU/mL。在無(wú)菌96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中37℃培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)液并用0.9%氯化鈉輕輕洗滌3次，并用甲醇固定15 min。風(fēng)干后，將孔用0.1%結(jié)晶紫染色5 min，再用無(wú)菌PBS洗滌3次，自然風(fēng)干，隨后于33%冰乙酸中作用 30 min，590 nm條件下用酶標(biāo)儀測(cè)定培養(yǎng)孔中溶液的吸光度值(A值)，平行3個(gè)重復(fù)，計(jì)算其平均值。以未接種菌的培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照，A值反映生物膜與接觸表面黏附的牢固程度，依據(jù)臨界Ac值(Ac是由空白孔的平均值加上其3倍的標(biāo)準(zhǔn)差)，可將生物被膜分成以下4類(lèi)：A≤Ac為不黏附(0)，Ac＜A≤2Ac為弱黏附(+)，2Ac＜A≤4Ac 為中等黏附(++)，A＞4Ac為強(qiáng)黏附(+++)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用WHONET 5.6軟件錄入數(shù)據(jù)并進(jìn)行敏感性分析。采用SPSS19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組間中位數(shù)比較用秩和檢驗(yàn)。率的比較用卡方檢驗(yàn)或Fisher's確切概率分析。P＜0.05 時(shí)，表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 金葡菌的培養(yǎng)與鑒定

536份鼻拭子標(biāo)本共分離出金葡菌96株，NICU新生兒鼻前庭金葡菌的定植率為17.9%，其中 MRSA有28株(29.2%)，MSSA 68株(70.8%)。MRSA均為mecA陽(yáng)性，且頭孢西丁抑菌環(huán)≤21 mm。

2.2 抗生素敏感性檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 MRSA與MSSA藥敏結(jié)果

如表1所示，所有的MRSA菌株對(duì)青霉素耐藥，對(duì)苯唑西林耐藥率為57.1%，中介率28.6%，有4株(14.3%)為苯唑西林敏感甲氧西林耐藥金葡菌(OS-MRSA)。對(duì)頭孢曲松的耐藥率為78.6%，中介率14.3%。MRSA對(duì)紅霉素耐藥率為92.9%，對(duì)夫西地酸耐藥率3.6%，對(duì)其他抗菌藥物包括慶大霉素、利福平、復(fù)方磺胺甲惡唑、莫匹羅星、左氧氟沙星、美羅培南、萬(wàn)古霉素、利奈唑胺及替加環(huán)素均敏感。在所有MSSA菌株中，對(duì)青霉素的耐藥率為82.4%，對(duì)頭孢曲松耐藥率為8.8%，對(duì)紅霉素耐藥率47.1%，中介率27.9%，對(duì)慶大霉素的耐藥率為16.2%，對(duì)其余抗菌藥物包括苯唑西林、利福平、復(fù)方磺胺甲惡唑、莫匹羅星及左氧氟沙星均敏感。

表1 藥物敏感性檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Antimicrobial susceptibility test results

MRSA與MSSA在9種抗菌藥物不敏感率比較中，MRSA對(duì)苯唑西林、頭孢曲松和紅霉素的不敏感率顯著高與MSSA，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.2 OS-MRSA藥物敏感性

28株MRSA中檢測(cè)出4株OS-MRSA，檢出率為14.3%，4株均經(jīng)菌落形態(tài)學(xué)、凝固酶試驗(yàn)及nuc基因驗(yàn)證確定為金葡菌，多重PCR驗(yàn)證均含有mecA基因，頭孢西丁紙片法抑菌環(huán)直徑均≤21 mm。在4株OS-MRSA中，ST59-IVa-t437(3/4)為最常見(jiàn)的流行克隆，另有一株ST22-V-t309。4株菌株對(duì)頭孢西丁耐藥，其抑菌環(huán)直徑分別為16、17、16和18 mm，對(duì)苯唑西林均敏感，MIC值分別為1.5、1、2和2 mg/L。同時(shí)耐青霉素(MIC 4～＞32 mg/L)和頭孢曲松(MIC 6～＞32 mg/L)。3株OS-MRSA對(duì)紅霉素耐藥，1株對(duì)紅霉素中介(表2)。

表2 OS-MRSA分子特征與藥物敏感性Tab.2 The molecular characteristics and antibiotic resistance of oxacillin-susceptible mecA-positive S.aureus

2.3 生物膜形成能力檢測(cè)

2.3.1 MRSA與MSSA菌株生物膜形成能力的比較

根據(jù)結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)結(jié)果，96株金葡菌中有88株(91.7%)為生物膜陽(yáng)性，8株(8.3%)為生物膜陰性。MRSA、MSSA 的生物膜陽(yáng)性率分別為89.3%(25/28)、92.6%(63/68)。將 88株金黃色葡萄球菌形成生物被膜的能力分為強(qiáng)(+++)、中等(++)、弱 (+)三組，其中強(qiáng)產(chǎn)膜菌株、中產(chǎn)膜菌株和弱產(chǎn)膜菌株分別為有21株(23.9%)、 62株(70.5%)、5株(5.7%)。其中，25株生物膜陽(yáng)性MRSA菌株中1株(3.6%)為強(qiáng)產(chǎn)膜菌株，24株(85.7%)為中產(chǎn)膜菌株。63株生物膜陽(yáng)性的MSSA菌株中，強(qiáng)、中、弱產(chǎn)膜菌株分別5株(7.4%)、38株(55.9%)、20株(29.4%)。MRSA和MSSA在生物膜形成能力方面沒(méi)有顯著差異(P=0.66)(圖1)。

2.3.2 不同ST型菌株生物膜形成能力的比較

25株生物膜陽(yáng)性的MRSA菌株中，96%(24/25)的ST59菌株、95.8%(23/24)的SCCmec-IV菌株和90.5%(19/21)的spa-t437菌株能形成中等以上生物膜。不同基因型的聯(lián)合分析表明，ST59-SCCmecIVt437克隆菌株中有83.8%(19/20)為中等以上生物膜形成菌。進(jìn)一步比較不同ST型的生物膜形成能力，發(fā)現(xiàn)它們之間存在顯著差異(P=0.0276)(表3)，其中ST188與其他型別之間存在顯著差異(P=0.0254)，其余任兩組之間沒(méi)有顯著差異(圖2)。

表3 生物膜形成能力Tab.3 The biofilm formation ability

2.3.3 產(chǎn)膜菌株與非產(chǎn)膜菌株的耐藥率

對(duì)比產(chǎn)膜菌株與非產(chǎn)膜菌株的藥敏情況，生物膜陽(yáng)性菌株對(duì)青霉素、苯唑西林、慶大霉素、頭孢曲松和紅霉素的耐藥率分別為87.5%、15.9%、12.5%、21.6%和60.2%。生物膜陰性菌株對(duì)青霉素、苯唑西林、頭孢曲松、紅霉素的耐藥率分別為7.5%、25%、37.5%和62.5%，而對(duì)慶大霉素均敏感，但藥敏差異不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)。

表4 產(chǎn)膜菌株與非產(chǎn)膜菌株的藥敏比較Tab.4 Comparison of the antimicrobial susceptibility between biofilm-forming and non-biofilm-forming isolates

3 討論

MRSA所引發(fā)的感染可呈散發(fā)或暴發(fā)流行，常常治療困難，且病死率較高，對(duì)MRSA的藥物敏感性監(jiān)測(cè)顯得尤為重要。本研究藥敏顯示，除青霉素、苯唑西林、紅霉素和頭孢曲松外，MRSA對(duì)其他抗菌藥物均保持敏感, 尤其是對(duì)慶大霉素、復(fù)方磺胺甲惡唑、利福平和左氧氟沙星的敏感性，顯著高于兒童MRSA感染株的藥敏報(bào)道[10]，也高于同期國(guó)內(nèi)其他MRSA藥物敏感性的報(bào)道。蔣漓麗等[11]報(bào)道MRSA 對(duì)慶大霉素、左氧氟沙星耐藥率均大于75% ,對(duì)復(fù)方磺胺甲惡唑稍敏感，耐藥率仍達(dá)39.6%。吳宇等[12]報(bào)道MRSA除對(duì)青霉素、苯唑西林、紅霉素耐藥率較高外，對(duì)慶大霉素、左氧氟沙星耐藥率也均高于80%。菌株來(lái)源、克隆群構(gòu)成差異可能是產(chǎn)生不同研究結(jié)果的原因。2017年CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)報(bào)道[13]，MSSA對(duì)青霉素、紅霉素和慶大霉素的耐藥率分別為89.9%、53.3%和11.9%。本研究中MSSA對(duì)青霉素、紅霉素和慶大霉素的耐藥率分別為82.4%、75%和16.2%，與同期國(guó)內(nèi)情況基本一致。整體而言，相比兒童感染分離株，本研究中定植金葡菌尤其是MRSA，除對(duì)青霉素、紅霉素及頭孢類(lèi)耐藥仍較高，對(duì)其他抗生素敏感性較好，可能得益于近年來(lái)臨床合理用藥等措施。

近年來(lái)，很多國(guó)家或地區(qū)逐漸報(bào)告了OS-MRSA菌株，巴西[14]和印度[15]OS-MRSA的在金葡菌中的比例高達(dá)33.7%和14.68%。我國(guó)1項(xiàng)10個(gè)城市2068株金葡菌的篩查中，廣州、武漢OS-MRSA檢出率高達(dá)35%、18%[16]，該報(bào)道中CC59-SCCmecV-t437是OSMRSA 的主要克隆型，本研究中4株OS-MRSA中3株為ST59-SCCmecIV-t437，但克隆的基因環(huán)境與OSMRSA的相關(guān)性仍有待進(jìn)一步研究。

本研究金葡菌的生物膜陽(yáng)性率高達(dá)91.7%，明顯高于Neopane等[17]報(bào)道的69.8%及我國(guó)覃金球等[18]報(bào)道的51.72%。覃金球等[18]和Yang等[19]發(fā)現(xiàn)MRSA產(chǎn)膜能力強(qiáng)于MSSA，本研究及Naicker等[20]并未發(fā)現(xiàn)兩者在產(chǎn)膜方面存在明顯差異，但MRSA和MSSA的生物膜形成機(jī)制的確不同，MSSA菌株形成生物膜由細(xì)胞間多糖抗原介導(dǎo)，而MRSA菌株生物膜形成則與細(xì)胞外DNA、錨定蛋白等相關(guān)[21]。值得注意的是，OS-MRSA生物膜的形成機(jī)制與MRSA不同，且β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素可誘導(dǎo)OSMRSA生物膜的形成[22]，臨床治療時(shí)需予以重視。此外，Naicker等[20]發(fā)現(xiàn)MLST-CC5可能與高生物膜形成有關(guān)。本研究中，83.8%的ST59-SCCmecIVt437克隆株中有中等以上生物膜形成菌，ST188亦較其他型具有較強(qiáng)生物膜形成能力，優(yōu)勢(shì)克隆的強(qiáng)生物膜形成能力可能是其在我國(guó)流行廣泛的部分原因。覃金球等[18]研究表明，產(chǎn)膜菌與非產(chǎn)膜菌比有更高的耐藥率，本研究及Brahma等[15]研究并未發(fā)現(xiàn)生物膜形成能力與藥物敏感性的關(guān)聯(lián)，研究表明，生物膜是通過(guò)改變內(nèi)部微環(huán)境、被膜菌的表型變異、基質(zhì)屏障、主動(dòng)外排系統(tǒng)以及群體感應(yīng)系統(tǒng)等機(jī)制對(duì)抗藥物的殺菌作用，因而體外實(shí)驗(yàn)存在較多局限性。

本研究提供了近一年的NICU金葡菌定植率及定植菌株的耐藥性及生物膜形成能力，尚沒(méi)有對(duì)定植患兒進(jìn)行前瞻性觀察，還不能回答定植者在后續(xù)住院過(guò)程中發(fā)生感染的概率及感染類(lèi)型等情況，未來(lái)還需進(jìn)一步開(kāi)展研究，明確金葡菌定植與感染的相關(guān)關(guān)系，為制訂臨床干預(yù)措施提供參考，對(duì)預(yù)防和控制菌株播散或暴發(fā)等具有重要意義。