5種銅綠假單胞菌高危克隆的流行及耐藥情況

岳卓 張浩然 白芳

(南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300071)

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一種普遍存在的革蘭陰性細菌，是引起人類機會性感染的最相關(guān)病原體之一[1]，是與醫(yī)院獲得性感染有關(guān)的最主要的生物之一。銅綠假單胞菌是急性醫(yī)院感染中最常見、最嚴重的原因之一，特別是影響免疫功能低下(尤其是中性粒細胞減少)的患者或重癥監(jiān)護病房(ICU)的患者。

細菌耐藥發(fā)生發(fā)展過程與臨床抗菌藥物的使用密切相關(guān)，在青霉素還未正式應(yīng)用于臨床的1940年，Abraham和Chain首先在大腸埃希菌發(fā)現(xiàn)青霉素酶；1956年Newton與Abraham在蠟樣芽胞桿菌發(fā)現(xiàn)頭孢菌素酶，細菌耐藥問題逐漸引起重視[2]。早期細菌耐藥的表現(xiàn)主要為某種細菌對某類藥物耐藥，之后逐漸出現(xiàn)對多種抗生素具有耐藥性的多種多重耐藥(multi-drug resistant, MDR)(對3類或3類以上抗菌藥物中的每一類抗菌藥物至少一種藥物獲得性不敏感的細菌)和XDR(對至多2類之外的其他類抗菌藥物中的每一類抗菌藥物至少一種藥物不敏感)[3]。20世紀60～70年代，金黃色葡萄球菌和一般的腸道革蘭陰性桿菌由于能產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶使青霉素類和第一代頭孢菌素抗菌作用下降。20世紀80年代后期至90年代，革蘭陰性桿菌如肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌產(chǎn)生的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶和誘導(dǎo)性β-內(nèi)酰胺酶可水解包括氧亞氨基類(頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢噻肟、氨曲南等)在內(nèi)的大多數(shù)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥[4]。細菌耐藥性已成為全球范圍內(nèi)的重大公共衛(wèi)生威脅。歐洲學(xué)者吉姆奧尼爾(Lord Jim O'Neil)預(yù)測，照此趨勢發(fā)展下去，到2050年死亡人數(shù)將達到每年1000萬，并將首次超過癌癥死亡人數(shù)[5]。

多位點序列分型(multilocus sequence typing,MLST)是一種基于核酸序列測定的細菌分型方法，通過PCR擴增多個管家基因內(nèi)部片段，測定其序列，分析菌株的變異，從而進行分型。銅綠假單胞菌的MLST提供的分子分型數(shù)據(jù)具有高度的可區(qū)分性和實驗室間的通用性，可以用于了解銅綠假單胞菌流行情況[6]，其中的幾種序列類型經(jīng)常與世界各地醫(yī)院的感染暴發(fā)相關(guān)[7]。目前國際流行的臨床檢出率較高的銅綠假單胞菌高?？寺∮蠸T175、ST111、ST235、ST308和ST664型等，針對這5種高?？寺∫延泻芏鄨蟮溃移鋸V泛的耐藥性使得這些克隆危害很大。因此本文對這5種高?？寺∵M行系統(tǒng)性綜述，包括其流行情況、耐藥譜、耐藥機制及治療手段。希望為高危克隆的甄別和防治提供理論借鑒，為臨床大夫用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 高危險銅綠假單胞菌克隆流行情況

5種高危險銅綠假單胞菌具體流行地區(qū)及所引發(fā)的感染性疾病如表1及圖1所示。其中，ST235型(圖1)分布最為廣泛，在除南極洲外六大洲多個國家均可找到，且非零星分布。其次是ST111型(圖1)銅綠假單胞菌，其在除大洋洲、南極洲外其他五大洲均曾檢測到。Roy等[8]曾于2016年研究分布在美國、西班牙、法國等的274株銅綠假單胞菌，在攜帶基因島1(genomic islands 1, GI1)和基因島2(genomic islands 2,GI2)的69株銅綠假單胞菌中，有ST235型26株，引起了腹腔內(nèi)感染、尿路感染、呼吸道感染、角膜/眼部感染，從直腸拭子、傷口拭子、血液都有分離到該菌株；ST111型19株(50.0%)，引起了尿路感染，從痰液中也有分離到該菌株。Yin等[9]曾從一個中國燒傷中心燒傷患者的血液和傷口表面分離得到ST111型菌株，這些菌株是引起傷口感染的主要因素。

表1 5種高危險銅綠假單胞菌克隆的流行情況Tab.1 The prevalence of 5 high-risk Pseudomonas aeruginosa clones

Cabot等[1]于2016年研究發(fā)現(xiàn)克隆ST175型(圖1)廣泛分布與歐洲國家，在西班牙和法國尤為嚴重。Viedma等[10]曾于西班牙183例攜帶銅綠假單胞菌患者身上分離到104例ST175型菌株，引起的感染類疾病包括：下呼吸道感染25例，尿路感染19例，腹腔內(nèi)感染7例，傷口感染4例。

克隆ST308型曾于2005—2010年在法國醫(yī)院檢出，并在該地醫(yī)院燒傷重癥監(jiān)護室、創(chuàng)傷重癥監(jiān)護室等暴發(fā)，在菌種感染暴發(fā)期結(jié)束后仍有零星發(fā)現(xiàn)，這些菌株從血液、膿腫以及醫(yī)生設(shè)備中分離到，造成血液感染、傷口感染、呼吸道感染[11]。Botelho等[12]曾在尿液、足部傷口、氣管中分離到ST308型銅綠假單胞菌。在尿液與支氣管中分離到ST111型銅綠假單胞菌。Fournier等[13]曾在9名法國醫(yī)院收治患者陰道分泌物分離到ST308型菌株。

Bour等[14]曾于2017年1月—2019年4月從毛里求斯遣返的3名患者與從阿富汗遣返的1名患者體內(nèi)分離到4株ST664型銅綠假單胞菌(圖1)，分別來自直腸拭子、血液在內(nèi)的多個身體部位、糖尿病足感染和腎絞痛患者的尿液。Agila等[15]曾于2014—2017年從印度7家醫(yī)院分離到507株銅綠假單胞菌，其中大部分為ST235型、ST357型和ST664型菌株。李振鵬等[16]曾在我國天津市一家燒傷?？漆t(yī)院的燒傷患者傷口與血液中分離到ST664型菌株。

在銅綠假單胞菌的多個高危險克隆中，ST235型分布最為廣泛，在六大洲的許多國家發(fā)現(xiàn)；其次是ST111型，在五大洲均曾檢測到。ST308型菌株曾在四個大洲中發(fā)現(xiàn)，但主要集中在西歐。ST175型菌株主要集中在北美洲與西歐，ST664型菌株主要集中在亞洲南部。一方面西歐已經(jīng)是銅綠假單胞菌高危險克隆的重災(zāi)區(qū)，需要通過改變醫(yī)療手段等方式進行控制，但這也可能源于不同地區(qū)檢驗及科研能力的差異；另一方面5種高危險克隆在各個大洲的流行地區(qū)一般較為集中，即一地暴發(fā)XDR與MDR菌株后，周邊地區(qū)需引起重視，如有必要應(yīng)提供醫(yī)療力量輔助耐藥菌株暴發(fā)地區(qū)，防止其進一步向外蔓延。

研究者已在呼吸道、尿液、血液中分離到5種高危險銅綠假單胞菌，且其他感染部位如傷口、燒傷部分、腹腔也與外界空氣接觸或間接接觸。在臨床防治XDR、MDR菌株時，一方面要注意對患者的治療手段，另一方面要加強空氣或公共設(shè)施如水龍頭、門把手等部位的消毒滅菌，防止耐藥菌株在醫(yī)院內(nèi)擴散，波及其他免疫力較低的患者。

2 高危險銅綠假單胞菌克隆耐藥譜

銅綠假單胞菌作為醫(yī)院中常見菌株，可以產(chǎn)生抗生素滅活酶及抗生素修飾酶干擾抗生素殺菌效應(yīng)，或通過改變抗生素作用位點及阻礙抗生素與作用位點結(jié)合獲得抗藥性。另外，銅綠假單胞菌還可以在藥物壓力下獲得外源抗藥基因，產(chǎn)生多重耐藥或泛耐藥菌。5種高危險銅綠假單胞菌克隆具體耐藥譜如表2所示。

表2 臨床銅綠假單胞菌分離物的抗菌藥敏性和分子分型結(jié)果總結(jié)Tab.2 Summary of antimicrobial susceptibility and molecular typing results of the clinical P.aeruginosa isolates

Cabot等[1]曾對從法國與西班牙收集的22株ST175型銅綠假單胞菌進行耐藥性研究，發(fā)現(xiàn)其具有青霉素、頭孢菌素、碳青霉烯、氨基糖苷和氟喹諾酮類抗菌藥物耐藥性。Viedma等[10]曾發(fā)現(xiàn)西班牙104株ST175型銅綠假單胞菌其中75%對阿米卡星敏感，100%對黏菌素敏感，且發(fā)現(xiàn)29株ST235型菌株均具有哌拉西林/他唑巴坦耐藥性。

Croughs等[19]曾發(fā)現(xiàn)ST111型銅綠假單胞菌中存在金屬-β-內(nèi)酰胺酶，Guzvinec等[20]對15株ST111型銅綠假單胞菌的耐藥性研究中發(fā)現(xiàn)，其對青霉素，頭孢菌素，碳青霉烯，氨基糖苷和氟喹諾酮類抗菌藥物均存在耐藥性；Witney等[21]發(fā)現(xiàn)其對除黏菌素外的大多數(shù)抗菌藥物存在耐藥性。

ST235的一些重要特征是對氟喹諾酮類藥物，氨基糖苷類藥物和β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥性[22-24]。Schaumburg等[25]發(fā)現(xiàn)其對頭孢類抗菌藥物存在耐藥性。Brüggemann等[26]發(fā)現(xiàn)其對氟喹諾酮類抗菌藥物存在耐藥性。Vatansever等[27]報道了ST235型銅綠假單胞菌對碳青霉烯類與黏菌素類抗菌藥物的耐藥性，銅綠假單胞菌ST235全球高?？寺≈姓诔霈F(xiàn)黏菌素類耐藥性。Roy等[28]發(fā)現(xiàn)其對幾乎所有的一線抗生素都表現(xiàn)出耐藥性，包括慶大霉素、哌拉西林、丁噴丁、美羅培南、頭孢他啶和黏菌素。

Abdouchakour等[11]曾對46株ST308型銅綠假單胞菌進行研究，發(fā)現(xiàn)其對氨基糖苷類、氟喹諾酮類、碳青霉烯類和頭孢菌素類抗菌藥物具有耐藥性，對黏菌素類抗菌藥物敏感。Wang等[29]對一株從狗身上分離出攜帶blaIMP-45的多藥耐藥ST308型銅綠假單胞菌研究發(fā)現(xiàn)，該菌對幾乎所有測試的β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物均表現(xiàn)出耐藥性或高最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)值，包括青霉素類、頭孢菌素類和碳青霉烯類抗菌藥物，同時對氨基糖苷類、氟喹諾酮類和黏菌素類抗菌藥物具有耐藥性，但對氨曲南敏感。不過ST308型銅綠假單胞菌對黏菌素類抗生素普遍為敏感，僅存在少數(shù)耐藥現(xiàn)象。

Bour等[14]曾對4株ST664型銅綠假單胞菌進行研究，發(fā)現(xiàn)其對頭孢菌素類、青霉素類抗菌藥物存在耐藥性，不過對黏菌素類抗菌藥物敏感。李振鵬[16]等曾發(fā)現(xiàn)ST664型菌株對氨基糖苷類、頭孢菌素類、碳青霉烯類和氟喹諾酮類抗菌藥物存在耐藥性，但對阿米卡星和多黏菌素B敏感。

在5種高危險銅綠假單胞菌克隆當(dāng)中，ST235型為泛耐藥克隆，該克隆對本文研究的6類抗菌藥物均耐藥，一旦感染可用藥物極少，非常危險；其余4型ST175型、ST111型、ST308型和ST664型均為多重耐藥菌株，它們對臨床治療銅綠假單胞菌的一線抗生素頭孢菌素和氟喹諾酮耐藥，某些分離株還對治療MDR-銅綠假單胞的碳青霉烯類抗生素耐藥，但它們對多黏菌素普遍敏感，提示多黏菌素是治療ST175型、ST111型、ST308型和ST664型銅綠假單胞菌感染的首選藥物。除了多黏菌素以外，在世界各地的許多醫(yī)院中，對所有抗生素的耐藥性并不罕見，而且PDR偶爾也已有報道[30-32]。

3 高危險銅綠假單胞菌克隆耐藥機制

銅綠假單胞菌的耐藥機制主要有三點：①在基因組上編碼了內(nèi)在的抗生素抗性機制[33-35]，常見的機制有：誘導(dǎo)型AmpC頭孢菌素酶的產(chǎn)生，外排泵的組成型(MexAB-OprM)或誘導(dǎo)型(MexXY)表達以及其外膜通透性降低；這些機制導(dǎo)致銅綠假單胞菌對抗生素的基礎(chǔ)低敏感性。②銅綠假單胞菌可以通過染色體基因適應(yīng)性突變，產(chǎn)生對抗生素的耐藥性。如：肽聚糖循環(huán)基因(ampD、dacB、ampR)選擇突變導(dǎo)致AmpC的組成性過度表達、孔蛋白OprD的突變失活、喹諾酮抗生素靶標(biāo)基因gyrA、gyrB、parC、parE的突變、雙組分系統(tǒng)pmrB基因突變導(dǎo)致多黏菌素耐藥、外排泵調(diào)控子mexZ基因突變導(dǎo)致MexXY的過表達等。③銅綠假單胞菌中水平獲得性抗性。最令人關(guān)注的是獲得性β-內(nèi)酰胺酶、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended spectrum beta-lactamase, ESBL)和碳青霉烯酶；特別是Ambler分類B類的金屬β-內(nèi)酰胺酶(metallo-β-lactamase, MBL)，該酶可以水解包括碳氫霉烯抗生素在內(nèi)的絕大多數(shù)β-內(nèi)酰胺類抗生素，著名的新德里超級細菌金屬β-內(nèi)酰胺酶-1(NDM-1)便屬于這類[36]。ESBLs和碳青霉烯酶通常與氨基糖苷抗性決定簇一起編碼在I類整合子中。通常，這些整合子存在于染色體定位的可轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)中，但在大多數(shù)情況下仍未探索用于水平轉(zhuǎn)移的機制[37]。銅綠假單胞菌中主要的β-內(nèi)酰胺酶如表3所示。

表3 銅綠假單胞菌中主要的β-內(nèi)酰胺酶Tab.3 The main β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa

ST111型銅綠假單胞菌的耐藥性主要來源于水平獲得性β-內(nèi)酰胺酶，在ST111菌株中已經(jīng)檢測到多個來自A，B和D類的獲得性β-內(nèi)酰胺酶。Wendel等[38]描述了德國三級醫(yī)院中首次廣泛耐藥的GIM-1(German imipenemase-1)銅綠假單胞菌菌株的暴發(fā)，這是一種由MBL GIM-1介導(dǎo)的碳青霉烯耐藥性。Roy等[8]報道了來自歐洲不同國家的7株ST111菌株均在GI2中攜帶Tn6163樣轉(zhuǎn)座子，其中包含一個編碼對慶大霉素/妥布霉素(aacA4)，羧芐西林(blaP1b)和鏈霉素/壯觀霉素(aadA2)耐藥的aacA4-blaP1b-aadA2盒式陣列。檢測到的A類ESBL包括GES和VEB酶；在哥倫比亞的ST111分離物中檢測到KPC-2碳青霉烯酶[39]。但是，到目前為止，在多達16個國家中檢測到的MBL VIM-2仍是ST111分離物中最分散的獲得性β-內(nèi)酰胺酶[22]。

迄今為止，在ST235分離物中已報道了近100種不同的水平獲得性抗性元件和多達39種不同的獲得性β-內(nèi)酰胺酶[22]。Hishinuma等[40]曾以99株ST235型銅綠假單胞菌作為實驗材料，研究發(fā)現(xiàn)在99菌株中g(shù)yrA和parC基因中喹諾酮耐藥性決定區(qū)域均出現(xiàn)點突變，ParC蛋白亞單位第87位絲氨酸變?yōu)榱涟彼?。且曾在對喹諾酮敏感的菌株中發(fā)現(xiàn)類似突變，但也在其中發(fā)現(xiàn)外排泵出現(xiàn)異常。Treepong等[7]對ST235型銅綠假單胞菌的起源及其成功的分子基礎(chǔ)進行了研究，發(fā)現(xiàn)染色體突變對抗生素的累積耐藥性：在對菌株喹諾酮耐藥決定區(qū)的非同義突變的搜索中，發(fā)現(xiàn)隨著時間推移，耐喹諾酮類菌株中逐漸出現(xiàn)GyrA，GyrB，ParC和ParE中的突變；存在的β-內(nèi)酰胺耐藥性突變有AmpC調(diào)控子突變、AmpD轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子突變和影響孔蛋白活性的突變；ST235菌株的獲得性基因賦予其對氨基糖苷，廣譜β-內(nèi)酰胺，碳青霉烯和氟喹諾酮類藥物的抗性。Vatansever等[27]發(fā)現(xiàn)了OXA-48和NDM-1在多黏菌素耐藥的ST235銅綠假單胞菌中并存的現(xiàn)象，這些菌株中的pmrAB和phoPQ序列中有許多插入和缺失，從而導(dǎo)致其被上調(diào)，多黏菌素的MIC與pmrAB-phoPQ雙組分系統(tǒng)的表達有關(guān)，該雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)的過表達通過減少銅綠假單胞菌外膜的負電荷來促進對多黏菌素的抵抗。Holger等[26]通過全基因組測序?qū)呐R床分離菌株進行分析，發(fā)現(xiàn)3株ST235型菌株，這些菌株具有最多種多樣的獲得性抗性相關(guān)基因，包括插入序列int1，tn7和tn21，并且還包含aac(6')Ib-cr，其編碼一種氨基糖苷修飾N-乙?；D(zhuǎn)移酶，據(jù)報道可賦予對氟喹諾酮抗性。Hishinuma等[40]對2012年至2016年獲得的1476株耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌進行了鑒定，發(fā)現(xiàn)有104個(7.0%)帶有blaGES-5，其中有99株ST235型菌株，這些菌株帶有編碼碳青霉烯酶和ESBL的基因blaGES-5，blaPAO，blaOXA-488和氨基糖苷耐藥性基因aac(6')-Ib；同時發(fā)現(xiàn)在gyrA和parC的喹諾酮耐藥性決定區(qū)域均具有點突變。在其獲得性β-內(nèi)酰胺酶中，包括許多A類ESBL， 其中PER-1是地理分布最廣泛的一種，而GES酶則更多樣化；在哥倫比亞的ST235分離物中檢測到A類碳青霉烯酶KPC-2[39,41-42]；然而，B類碳青霉烯酶在ST235分離株(包括多個IMP和VIM變體)中更為頻繁。實際上，VIM-2是ST235分離株中地理分布最廣的β-內(nèi)酰胺酶。D類酶也經(jīng)常被報道用于ST235；其中OXA-2是最常報道的，但是在多個國家中都檢測到ESBL變體，例如OXA-17。

ST175型銅綠假單胞菌的耐藥性主要是由適應(yīng)性突變引起的，如OprD失活、AmpC過表達、外排泵過表達。Cabot等[1]通過全基因組測序的方法，對ST175型銅綠假單胞菌的耐藥機制進行研究。研究發(fā)現(xiàn)，ST175型銅綠假單胞菌的耐藥性主要由突變導(dǎo)致。在所研究的22個分離株中，除一個分離株(PAmb75)外，所有樣品的AmpR蛋白中第154位甘氨酸變?yōu)榫彼釋?dǎo)致ampC的過表達，產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶將抗生素水解，使其對頭孢他啶和哌拉西林-他唑巴坦產(chǎn)生耐藥性；所有對亞胺培南耐藥的西班牙分離株，以及法國分離株之一，都在oprD中包含先前描述的Q142X突變，其余3個法國分離株顯示出另一種oprD突變W138X，從而表明碳青霉烯類耐藥性與oprD中無意義的突變相關(guān)；所有22個分離株均在mexZ中顯示了先前確定的G195E取代，以前已經(jīng)證明了這種取代與MexXY過表達有關(guān)，從而導(dǎo)致對頭孢吡肟和氨基糖苷耐藥；22個菌株均含有一個aadB基因，該基因編碼一個腺苷酸轉(zhuǎn)移酶，使ST175型銅綠假單胞菌產(chǎn)生氨基糖苷類耐藥性。此外，還有一些菌株中檢測到鏈霉素抗性基因aadA13和引起磷霉素抗性的glpT突變。同時，ST175型銅綠假單胞菌也存在一些水平獲得性β-內(nèi)酰胺酶。Mano等[43]在對日本產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶的銅綠假單胞菌分離物整合子的研究中，發(fā)現(xiàn)3株ST175型銅綠假單胞菌，它們具有MBL基因blaIMP-1，其GC陣列為blaIMP-1|aacA4'-3|aacA4′-3|catB6|blaCARB-12，使其對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，僅對阿貝卡星敏感。此外，還有研究表明，ST175型銅綠假單胞菌攜帶A類β-內(nèi)酰胺酶CARB-12[43]，B類MBL VIM-2[10,44-45]和VIM-20[46]。

Vanesa等[47]曾以61株ST308型銅綠假單胞菌為實驗材料，雖然其均為多重耐藥且耐碳青霉烯，但并未發(fā)現(xiàn)存在碳青霉烯酶，但均發(fā)現(xiàn)其OprD孔蛋白出現(xiàn)異常，59%的菌株具有提前終止密碼子，并存在oprD基因被截斷的情況。這些會導(dǎo)致孔蛋白無法正常翻譯與表達，降低細菌外膜通透性，使碳青霉烯類抗生素?zé)o法順利進入細胞，即細菌內(nèi)碳青霉烯類抗生素濃度降低，無法起到殺菌作用，增強細菌耐藥性。Fournier等[13]報道了blmIMP-13在法國銅綠假單胞菌ST621，ST308和ST111間的傳播，通過野生型功能性孔蛋白OprD檢測到ST308型銅綠假單胞菌中存在blmIMP-37，增強了其對碳青霉烯類抗生素的耐藥性。已報道ST308型銅綠假單胞菌水平獲得性β-內(nèi)酰胺酶還有A類GES-7[42]，B類IMP-1[43]、IMP-8[48-49]、IMP-13[13]、IMP-45[29]、VIM-2[42]。

Bour等[14]對4株ST664型銅綠假單胞菌的多重耐藥菌株進行研究，這些菌株對多黏菌素和亞胺培南(其中2株)以外的所有測試的抗假單胞菌抗生素均具有抗性。其中兩株耐亞胺培南菌株編碼碳青霉烯類特異性孔蛋白OprD的基因序列存在突變；還有兩株菌株均在gyrA和parC的喹諾酮耐藥性決定區(qū)域分別顯示出標(biāo)準突變T83I和S87L，這說明這些細菌對環(huán)丙沙星的耐藥性很高，且兩株菌株均含有編碼16S rRNA甲基化酶基因rmtF2和氨基糖苷類修飾的決定因子aacA4-22。4株菌株中存在blaOXA-10基因，還發(fā)現(xiàn)在一個染色體定位的類似Tn1721轉(zhuǎn)座子上含有編碼罕見C類β-內(nèi)酰胺酶PAC-1的基因。blaPAC-1，blaOXA-10和rmtF2基因的共遺傳使銅綠假單胞菌對主要的抗假單胞菌青霉素，頭孢菌素和氨基糖苷具有高度的抗性。李振鵬等[16]在對泛耐藥的ST664型銅綠假單胞菌的研究中表明，該克隆攜帶11個耐藥基因，包括三個氨基糖苷抗性基因aph(3')-IIb，ant(2'')-Ia(aadB)和aac(3)-IId，三個β-內(nèi)酰胺抗性基因blaKPC-2，blaPAO(ampC)和blaOXA-50，一個潛在的氟喹諾酮抗性基因crpP，一個磷霉素抗性基因fosA，兩個苯酚抗性基因catB7和cmlA1，和一個磺酰胺抗性基因sul1。

銅綠假單胞菌中水平獲得性抗性的流行日益引起人們的關(guān)注。高風(fēng)險克隆與可轉(zhuǎn)移抗性機制，尤其是水平獲得的β-內(nèi)酰胺酶之間的聯(lián)系是不容置疑的。質(zhì)粒作為染色體外的遺傳元件，是介導(dǎo)抗菌素耐藥基因傳播的關(guān)鍵載體[16]。攜帶耐藥基因的質(zhì)粒能對包括β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類、喹諾酮類、磺胺類、四環(huán)素類、氯霉素類等抗生素產(chǎn)生耐藥性[50]。其介導(dǎo)的耐藥基因可隨移動遺傳元件(插入序列、轉(zhuǎn)座子)在細菌間發(fā)生水平傳播[51]，是社區(qū)和住院患者獲得性感染的主要致病機制。目前研究表明銅綠假單胞菌高?？寺≈写嬖诙鄠€整合子，但對其位置、遺傳環(huán)境和轉(zhuǎn)移機制的研究非常有限，許多研究沒有調(diào)查這些元件的位置是染色體的還是質(zhì)粒的。

目前已經(jīng)報道了質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶、耐喹諾酮基因、耐碳青霉烯基因等的傳播。pMG252是最早報道的可使細菌對喹諾酮類藥物的耐藥水平提高質(zhì)粒，劉鮮花等[52]對耐喹諾酮類藥物銅綠假單胞菌的質(zhì)?；蜓芯恐?，檢出含有qnrA、qnrB、qnrD和qnrS/aac(6')-Ib-cr基因的菌株，其中qnrA、qnrB和aac(6')-Ib-cr具有較高的攜帶率，表明其在耐藥機制中發(fā)揮重要的作用。吳俊等[53]通過對泛耐藥銅綠假單胞菌的研究，確定了大型質(zhì)粒介導(dǎo)的金屬β-內(nèi)酰胺酶在銅綠假單胞菌的傳播，近年也有大型質(zhì)粒相關(guān)報道，其通常屬于IncP-2型質(zhì)粒[54]，且以質(zhì)粒DNA為模板進行同源性分析示同一克隆株，證明其可導(dǎo)致整個病區(qū)流行傳播及其后散發(fā)流行。5種高危險銅綠假單胞菌克隆質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因情況如表4所示。

表4 5種高危險銅綠假單胞菌克隆質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因情況Tab.4 Plasmid-mediated resistance genes of 5 high-risk Pseudomonas aeruginosa

Libisch等[55]在ST235型銅綠假單胞菌中質(zhì)粒檢測結(jié)果表明，blaPER-1和整合子B位于其結(jié)合質(zhì)粒上，可對頭孢他啶抗性進行轉(zhuǎn)移。Correa等[56]在對ST235和ST111型銅綠中耐藥基因研究中發(fā)現(xiàn)，blaVIM-2和blaKPC-2位于大多數(shù)分離株的染色體中(70%)，在其余分離物中，這些基因位于長度可變的質(zhì)粒(80～190 kb)中。Kim等[57]在發(fā)現(xiàn)來自泰國的1株ST235型銅綠假單胞菌中blaVIM-2基因的位于130kb的線性質(zhì)粒上。

李振鵬等[16]對ST664型銅綠假單胞菌中的3種共存質(zhì)粒進行研究，發(fā)現(xiàn)碳青霉烯酶基因blaKPC-2與其他3個耐藥性基因共同編碼于一個475 kb的大質(zhì)粒中，該大質(zhì)粒自身雖缺少接合轉(zhuǎn)移元件，但可利用輔助質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)進行種間的質(zhì)粒傳播。

質(zhì)粒的介導(dǎo)成為細菌產(chǎn)生耐藥性的重要影響因素，促進的耐藥基因的擴散。獲得性抗性在高風(fēng)險克隆中的傳播，使其有更多機會獲得新的遺產(chǎn)物質(zhì)，得到更廣泛的傳播。通過抗生素的正向選擇，細菌能更好的適應(yīng)宿主環(huán)境，給臨床治療帶來巨大的困難。目前對質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥基因的傳播機制研究較少，尤其是對泛耐藥銅綠假單胞菌高?？寺?。需要進一步加強這方面的研究，為抗生素或其他抗菌藥物的研發(fā)及臨床上治療高?？寺∷幬锸褂锰峁┮欢◣椭?。

4 抗生素治療方案

銅綠假單胞菌作為醫(yī)院中常見致病菌，是細菌感染治療的重點之一。但隨著抗生素的不斷使用，銅綠假單胞菌的耐藥譜不斷擴大，多重耐藥菌與泛耐藥菌不斷出現(xiàn)，各種抗菌藥物效果大不如前，只有少量仍有良好的殺菌效果。5種高危險銅綠假單胞菌治療藥物如表5所示。Viedma等[10]曾對104株ST175型銅綠假單胞菌進行檢測，發(fā)現(xiàn)其中75%對阿米卡星敏感。Cabot等[1]曾對14株ST175型菌株進行檢測，發(fā)現(xiàn)其中1例對黏菌素表現(xiàn)為中度敏感(4 μg/mL)，其余均為敏感(≤1 μg/mL)。對14株ST111型菌株進行檢測，發(fā)現(xiàn)其均對哌拉西林/他唑巴坦(≤32 μg/mL)及黏菌素(≤2 μg/mL)敏感。Hishinuma等[40]對99株ST235型與3株ST2233型進行耐藥性檢測，發(fā)現(xiàn)其中75%對氨曲南敏感。Abdouchakour等[11]曾對46株ST308型銅綠假單胞菌進行研究，發(fā)現(xiàn)其對黏菌素類抗菌藥物敏感。李振鵬等[16]曾發(fā)現(xiàn)ST664型菌株對阿米卡星(≤2 μg/mL)、多黏菌素B(≤2 μg/mL)敏感。

表5 5種高危險銅綠假單胞菌克隆可用抗生素Tab.5 Available antibiotics of 5 high-risk Pseudomonas aeruginosa clones

以上用藥方案是在現(xiàn)有耐藥譜和耐藥機制研究的基礎(chǔ)上提出的，屬于理論依據(jù)，然而實際用藥可能更為復(fù)雜。如臨床上常將多黏菌素與治療革蘭陽性細菌感染的萬古霉素聯(lián)用，一方面萬古霉素可提高多黏菌素藥效，另一方面，某些革蘭陽性細菌(如金葡菌)常與銅綠假單胞菌發(fā)生共感染，萬古霉素可同時控制革蘭陽性菌感染。

5 討論

綜上所述，隨著社會的不斷發(fā)展，現(xiàn)代醫(yī)療水平也隨之上升，人們對醫(yī)療的速度與質(zhì)量有著更高的要求。人們在因為手術(shù)、燒傷等原因經(jīng)歷銅綠假單胞菌感染后，醫(yī)生為了使患者更快的恢復(fù)，減少其它并發(fā)癥的產(chǎn)生，常常使用抗生素進行治療。但是隨著抗生素的使用頻率增加，非耐藥菌株快速被消滅，耐藥菌株短時間內(nèi)在種群中獲得優(yōu)勢地位并大量繁殖，抗生素的使用干擾了種群內(nèi)的生存競爭，同時降低了抗生素的滅菌效果。為了達到同樣的治療效果，醫(yī)生不得不加大抗生素的用量并將抗生素聯(lián)合使用，此方法可能導(dǎo)致多重耐藥與泛耐藥菌株產(chǎn)生。

現(xiàn)已在全世界多個地方發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌高危克隆的產(chǎn)生，即抗生素的濫用并不是一個偶然現(xiàn)象，并發(fā)現(xiàn)耐藥菌株暴發(fā)后并沒有局限在暴發(fā)區(qū)域，其可以通過特殊機制將自身耐藥基因傳遞給其他未接觸過抗菌藥物的菌株，使對抗菌藥物敏感的銅綠假單胞菌轉(zhuǎn)變?yōu)槟退幘?。為了阻止耐藥菌株的擴散，可以更加深入研究抗性傳播機制，通過相關(guān)藥物抑制基因轉(zhuǎn)移，減少耐藥菌株的數(shù)量。

另一方面，銅綠假單胞菌的耐藥性產(chǎn)生極為迅速，有多項研究表明，銅綠假單胞菌在抗菌藥物壓力下可以快速獲得相應(yīng)耐藥基因并對該抗菌藥物產(chǎn)生抗性。在銅綠假單胞菌感染治療初期，碳青霉烯類抗菌藥物治療效果較為明顯，但是隨著該抗菌藥物的大量使用，菌株逐漸獲得抗性，調(diào)查的5種銅綠假單胞菌高?？寺∮写蟛糠謱μ记嗝瓜╊惪咕幬锊幻舾小，F(xiàn)在抗菌藥物中多黏菌素等黏菌素類抗菌藥物菌株耐藥率較低，但在ST235型銅綠假單胞菌高?？寺≈幸呀?jīng)發(fā)現(xiàn)黏菌素類抗菌藥物耐藥基因，且ST235型菌株在世界范圍內(nèi)分布較為廣泛。

因此，人們對于耐藥菌株的出現(xiàn)要更加重視，控制抗菌藥物的使用頻率，減少高危克隆產(chǎn)生，醫(yī)院內(nèi)公共設(shè)施等注意消毒，防止耐藥菌株在醫(yī)院內(nèi)傳播。并對菌株耐藥機制與擴散機制進行更加深入的研究，從而更好地指導(dǎo)臨床抗菌藥物的使用以及新型抗菌藥物的研發(fā)。