新鞘氨醇單胞菌預(yù)處理對木材結(jié)構(gòu)及酶解的影響?

曹舒祺 陳夢婕 侯賢鋒 孫 瑾

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)材料與能源學(xué)院，廣東 廣州 510642）

木質(zhì)纖維素是重要的再生資源，對于緩解能源緊缺壓力和解決環(huán)境污染問題有重要意義[1-2]。然而，木質(zhì)纖維素具有獨特的保護性壁壘結(jié)構(gòu)[3-4]，阻礙了其生物質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，因而難以直接利用。因此，需要通過物理法、化學(xué)法和微生物法[5]對木質(zhì)纖維素進行預(yù)處理。物理法主要是減小樣品顆粒尺寸，改變木質(zhì)原料的結(jié)構(gòu)，不會去除非纖維素部分（木質(zhì)素和半纖維素等），且所需能耗和成本較高[6-7]?；瘜W(xué)法主要是通過化學(xué)試劑破壞木質(zhì)素和半纖維素的結(jié)構(gòu)，從而暴露出纖維素，增加其可及性。然而，化學(xué)處理不僅會污染環(huán)境，還會產(chǎn)生副產(chǎn)物，抑制后續(xù)發(fā)酵過程[8-9]。

微生物法是一種環(huán)保、溫和且低成本的預(yù)處理方法[10-11]，可以有效避免物理法和化學(xué)法存在的問題，具有良好的應(yīng)用前景。微生物法主要包括真菌預(yù)處理和細菌預(yù)處理兩種方式[12-13]。相比于真菌，細菌生長迅速，具有良好的環(huán)境適應(yīng)能力，生長過程對pH和溫度要求較低，同時可產(chǎn)生多種酶，增強預(yù)處理效果[14]。目前，用于預(yù)處理的細菌有梭菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、新鞘氨醇桿菌屬等[15-19]。Bahiru等[20]從白蟻體內(nèi)分離出水稻蒼白桿菌 BMP03 和芽孢桿菌 BMP01，用于稻草秸稈的預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素去除率可達53.74%，還原糖產(chǎn)量提高了69.96%。目前，細菌預(yù)處理研究主要集中于稻草秸稈[20-21]和玉米秸稈[1,17]等農(nóng)業(yè)廢棄物，對木材結(jié)構(gòu)及酶解效果的影響尚不清楚。

本研究采用新鞘氨醇單胞菌分別對針葉材（馬尾松）和闊葉材（尾葉桉）進行處理。通過化學(xué)成分分析、傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）分析、X射線衍射（XRD）分析、掃描電子顯微鏡（SEM）觀察、水解糖化測試，研究新鞘氨醇單胞菌預(yù)處理對兩種木材化學(xué)結(jié)構(gòu)、微觀形態(tài)、酶解效率等的影響，以期為細菌預(yù)處理木材研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

尾葉桉（Eucalyptus urophylla）和馬尾松（Pinus massoniana）木粉購自廣東省云浮市。將木粉在90 ℃的條件下烘干8 h，而后經(jīng)行星式球磨機熱磨，用分篩機分選200目樣品備用。新鞘氨醇單胞菌（Novosphingobiumsp.）購自廣東省微生物保藏中心，序列號為GIM 1.338。本試驗中所用化學(xué)試劑均為分析純。

Spectrum 100 傅里葉變換紅外光譜（PerkinElmer，美國），Ulitma IV X射線衍射儀（Rigaku，美國）S-570 掃描電子顯微鏡（Zeiss，德國），UV-5800 紫外分光光度計（上海元析），DGL-35B高壓滅菌鍋（上海力辰），pHS-3C pH計（上海儀電）。

1.2 菌種培養(yǎng)

在30 ℃，120 r/min的搖床中進行新鞘氨醇單胞菌的培養(yǎng)，所用的培養(yǎng)基為溶菌肉湯培養(yǎng)基（LB）和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，預(yù)處理試驗所用的培養(yǎng)基為無機鹽培養(yǎng)基。其中，LB培養(yǎng)基的成分為：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，蒸餾水1 L。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的成分為：牛肉膏3 g/L，NaCl 5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，蒸餾水1 L。無機鹽培養(yǎng)基為：(NH4)2SO42 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO40.2 g/L，CaCl20.1 g/L，F(xiàn)eSO40.05 g/L，MnSO40.02 g/L，KH2PO41 g/L，蒸餾水1 L。上述培養(yǎng)基均用1 M的NaOH溶液調(diào)pH值至7.0～7.2。在溫度為121 ℃的高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌20～30 min。將新鞘氨醇單胞菌接種到滅菌的LB培養(yǎng)基中，在溫度為30 ℃，轉(zhuǎn)速為120 r/min的搖床內(nèi)培養(yǎng)18 h后，用紫外分光光度儀測定600 nm處菌液的光密度值（OD），待菌液的OD值達到1.0時，可用于預(yù)處理試驗。

1.3 細菌預(yù)處理

在500 mL的三角瓶內(nèi)配制200 mL的無機鹽培養(yǎng)基，將pH調(diào)至7.0～7.2。分別稱取2 g的尾葉桉和馬尾松木粉，裝入離心管中，放入高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌。待無機鹽培養(yǎng)基冷卻至室溫時，取20 mL OD值達到1.0的菌液，加入含有木粉的無機鹽培養(yǎng)基中。放入溫度為30 ℃，轉(zhuǎn)速為120 r/min的搖床內(nèi)，待第5 d時取出，用于后續(xù)測試和分析。

1.4 酶促水解

稱取處理過和未處理的木粉各0.1 g，纖維素酶30 mg，20 mL pH為4.8的檸檬酸鈉緩沖液。放入溫度為50 ℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min的搖床內(nèi)，72 h后取出，用3,5-二硝基水楊酸法 （DNS） 測糖產(chǎn)量。

1.5 分析方法

1.5.1 化學(xué)成分分析

采用范式洗滌法測量樣品的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量。即用酸性洗滌劑和中性洗滌劑洗滌樣品獲得酸性洗滌纖維（ADF）和中性洗滌纖維（NDF）。將ADF經(jīng)5 mL 72%硫酸溶液酸浸3 h，而后加入45 mL蒸餾水過夜，即獲得酸不溶木質(zhì)素（ADL）。將ADL在550 ℃馬弗爐內(nèi)燒制2.5 h，即可獲得灰分。上述NDF和ADF的差值，ADF和ADL的差值，ADL和灰分的差值分別為半纖維素、纖維素和木質(zhì)素的含量。

1.5.2 FT-IR測試

采用FT-IR觀察處理前后木粉化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化。將待測樣品和KBr粉末按1∶100的比例混合均勻，壓制成片后進行掃描，波長范圍4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1。

1.5.3 XRD測試

采用XRD觀察處理前后木粉的結(jié)晶度變化，掃描范圍10°～45°，掃描速度8°/min。結(jié)晶度（CrI）計算按照Segal公式計算：

式中：I002為2θ=22.48°的強度值；Iamp為2θ＝18.50°的強度值。

1.5.4 SEM表征

采用SEM觀察處理前后木粉樣品表面微觀結(jié)構(gòu)的變化。測試前，需要對樣品進行噴金處理，以免測試過程對樣品表面結(jié)構(gòu)造成損傷。

2 結(jié)果與分析

2.1 化學(xué)成分分析

如表1所示，經(jīng)過新鞘氨醇單胞菌處理后，兩種木材的木質(zhì)素含量均降低。這是因為新鞘氨醇單胞菌通過降解木質(zhì)素將其作為自身生長所需的碳源，同時對木質(zhì)素產(chǎn)生一定的礦化作用[22]。木質(zhì)素含量的降低意味著纖維素表面的保護壁壘降解，這將有利于提高纖維素的可及性，從而增強其酶解效率。經(jīng)計算，預(yù)處理后，尾葉桉的木質(zhì)素含量下降了13.6%，而馬尾松木質(zhì)素含量僅下降了6.4%，表明新鞘氨醇單胞菌對闊葉材預(yù)處理效果高于針葉材。

表1 預(yù)處理前后尾葉桉和馬尾松樣品中主要化學(xué)成分Tab.1 The chemical composition of Eucalyptus urophylla and Pinus massoniana before and after pretreatment

2.2 FT-IR分析

圖1為處理前后馬尾松和尾葉桉木粉的紅外光譜圖。預(yù)處理前，兩種樹種顯示出不同的特征峰，主要源于其木質(zhì)素結(jié)構(gòu)差異[23]。細菌預(yù)處理后，這兩種樹種的特征峰變化顯著且較為相似。

圖1 處理前后尾葉桉和馬尾松FT-IR圖譜Fig.1 The FT-IR spectra of Eucalyptus urophylla and Pinus massoniana before and after pretreatment

由圖1可知，經(jīng)新鞘氨醇單胞菌處理后，木質(zhì)素的特征峰強度明顯降低。如3 400 cm-1代表羥基中O--H的伸縮振動[24]，該處特征峰強度降低，表明木材中部分木質(zhì)素和多糖被降解。1 650、1 507 cm-1和1 460 cm-1處特征峰分別代表具有芳香結(jié)構(gòu)的共軛木質(zhì)素側(cè)鏈上烷基的C==O，芳香環(huán)骨架C==C的伸縮振動和紫丁香基基團的甲基和亞甲基的變形[25]。經(jīng)過預(yù)處理后，這些特征峰強度均有所減弱，表明木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。也就是說，細菌預(yù)處理破壞了木質(zhì)素的化學(xué)結(jié)構(gòu)。木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的破壞有利于削弱木質(zhì)素對纖維素的保護作用，促進纖維素酶的進入，從而提高酶解效果。值得注意的是，由圖1可知，預(yù)處理的尾葉桉在1 375 cm-1（表示愈創(chuàng)木基和紫丁香基的縮合，以及紫丁香基CH2彎曲振動[21,26]）處的特征峰強度減弱，這種情況在馬尾松的紅外圖譜中并不明顯。這表明，新鞘氨醇單胞菌預(yù)處理對尾葉桉中木質(zhì)素的破壞更嚴重，這與化學(xué)成分分析結(jié)果一致。

2.3 XRD分析

在XRD衍射譜中，22.48°被視為I002晶面，18.50°被視為無定形區(qū)。由圖2可知，兩種木材預(yù)處理前后的XRD峰形均未發(fā)生明顯變化。通過計算可知，尾葉桉的結(jié)晶度為55.34%，預(yù)處理后結(jié)晶度上升至56.49%；馬尾松的結(jié)晶度為47.68%，預(yù)處理后結(jié)晶度上升至53.52%。結(jié)晶度的增加是由于細菌預(yù)處理去除了無定形部分（木質(zhì)素），使得結(jié)晶纖維素的比例相對增大[27-28]。這表明新鞘氨醇單胞菌預(yù)處理破壞了針葉材（馬尾松）和闊葉材（尾葉桉）的非結(jié)晶區(qū)。

圖2 預(yù)處理前后尾葉桉和馬尾松X射線衍射圖譜Fig.2 The XRD pattern of Eucalyptus urophylla and Pinus massoniana before and after pretreatment

2.4 SEM分析

如圖3所示，預(yù)處理后兩種木材的形態(tài)和顯微結(jié)構(gòu)都發(fā)生了變化。處理前，兩種木材樣品的表面均呈現(xiàn)連續(xù)、平整的形態(tài)（圖3a、c），而在預(yù)處理后木材樣品表面可觀察到孔洞、溝槽等明顯的形態(tài)變化（圖3b、d）。這主要是因為細菌預(yù)處理降解并礦化了部分木質(zhì)素，導(dǎo)致原本光滑連續(xù)的表面出現(xiàn)了許多裂紋，使包裹于其中的纖維素暴露[22]。此外，通過對比處理后的馬尾松和尾葉桉樣品，可以發(fā)現(xiàn)，尾葉桉的表面破損更為嚴重（3b、d），這與上述的成分分析和FT-IR的結(jié)論一致。

圖3 預(yù)處理前后木材樣品掃描電鏡圖Fig.3 The SEM of Eucalyptus urophylla and Pinus massoniana before and after pretreatment

2.5 酶解效果

為探討新鞘氨醇單胞菌預(yù)處理對這兩種木材的酶解效果的影響，對預(yù)處理前后的尾葉桉和馬尾松進行了酶促水解糖化研究，結(jié)果如表2所示。未處理尾葉桉產(chǎn)生的還原糖為186.4 mg/g，預(yù)處理后還原糖為236.5 mg/g。馬尾松預(yù)處理后，其還原糖產(chǎn)量從287.9 mg/g增加到315.1 mg/g。這說明，預(yù)處理后針葉材和闊葉材的酶促水解效果均得到提高。根據(jù)計算，預(yù)處理后尾葉桉和馬尾松的還原糖產(chǎn)量分別提高了26.9%和9.4%。可見，新鞘氨醇單胞菌預(yù)處理對尾葉桉的作用效果更加明顯，使其微觀結(jié)構(gòu)破壞更嚴重，從而使得尾葉桉的酶解效果提升更為顯著。

表2 預(yù)處理前后木材樣品的糖轉(zhuǎn)化率Tab.2 The reduce sugar yield of wood sample before and after pretreatment

3 結(jié)論

本研究采用新鞘氨醇單胞菌處理針葉材和闊葉材樣品，分析了預(yù)處理前后木材的化學(xué)結(jié)構(gòu)、微觀形態(tài)及酶解效率變化。結(jié)果表明，預(yù)處理后兩種木材的木質(zhì)素結(jié)構(gòu)均被破壞，致使木材的結(jié)晶指數(shù)增大，同時木材表面出現(xiàn)裂紋、孔洞、溝槽等現(xiàn)象，增加了纖維素的可及性，從而提高了木材的酶解效果。相對于針葉材，新鞘氨醇單胞菌預(yù)處理對闊葉材的木質(zhì)素及微觀結(jié)構(gòu)破壞更為明顯。本研究可為木材的細菌預(yù)處理提供參考。