響應面法優(yōu)化分子蒸餾提純煙梗浸膏的工藝

冀唯妮，余其昌，黃 菲，孔浩輝，周 瑢，易聰華

1.華南理工大學化學與化工學院，廣州市天河區(qū)五山路381號 510640

2.廣東中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，廣州市荔灣區(qū)東沙環(huán)翠南路88號 510385

煙梗是卷煙工業(yè)的副產(chǎn)物，煙草行業(yè)每年產(chǎn)生的煙梗廢料有數(shù)十萬噸［1-2］。在煙梗的眾多利用途徑中，利用煙梗提取純化制備煙草精油是一種資源綜合利用的途徑。近年來，隨著電子煙市場的不斷擴大，國際上對煙草精油的需求量也呈逐年增加趨勢。可以看出，有效利用煙梗廢料不僅可以減輕其對環(huán)境的污染，還能降本增效［3］。然而，隨著煙草精油市場需求量的不斷擴大，相關工業(yè)企業(yè)對煙草精油質量的要求也越來越高，因此煙梗粗提物及其相關產(chǎn)物的進一步精煉純化對于高質量煙草精油的開發(fā)具有重要意義。

目前，國內利用煙草工業(yè)廢料制備煙草精油的相關研究主要集中于提取方法研究方面，采用的提取方法主要是水蒸氣蒸餾法［4］、超聲輔助溶劑法［5］、超臨界萃取法等［6-7］，所得產(chǎn)品為煙草浸膏；粗提物浸膏的提純方法主要是大孔吸附樹脂純化、濃縮精制等，但是上述方法的純化過程較復雜，且耗時長［8］。分子蒸餾法是在近年來被用于精油精制的新技術［9-10］，其原理是基于各物質分子具有不同的分子自由程，當蒸發(fā)面與冷凝面之間的距離小于輕分子的自由程而大于重分子的自由程時，可實現(xiàn)輕重組分的分離。該方法具有蒸餾溫度低、真空度高、在蒸發(fā)面停留時間短、分離效率高等優(yōu)點，尤其適用于沸點高且易氧化物質的分離［11-13］。本項目組在前期的研究中采用超臨界CO2萃取法制備了煙梗浸膏［14］，但目前采用分子蒸餾法從煙梗浸膏中制備煙梗精油的研究較少。為此，采用分子蒸餾法對煙梗浸膏進行分離提純研究，以煙梗精油得率及精油中新植二烯、西柏三烯醇類物質的含量（質量分數(shù)）為指標，通過冷凝口溫度、旋轉刮膜轉速、進料速率和蒸餾溫度等工藝參數(shù)的單因素實驗和響應面實驗進行分子蒸餾工藝優(yōu)化，并對優(yōu)化工藝條件下制備的煙梗精油進行GC/MS分析及再造煙葉加香應用，以期為提高煙梗浸膏的利用價值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

煙梗樣品（2015年云南無等級煙梗）。

二氧化碳（99.9%，廣州卓正氣體有限公司）；無水乙醇、丙酮（AR，廣州化學試劑廠）；乙酸苯乙酯（AR，日本TCI公司）；無水硫酸鈉（AR，廣州化學試劑廠）。

FZ102微型植物試樣粉碎機（上海書培實驗設備有限公司）；SFE221-50-06超臨界CO2萃取裝置（南通華興石油儀器有限公司、華南理工大學聯(lián)合研制）；MD-S80分子蒸餾裝置（華工-漢維新型分離技術工程開發(fā)中心）；QP-2010氣相色譜-質譜聯(lián)用儀（日本Shimadzu公司）；RK3AKWT凱塞法自動抄紙系統(tǒng)（美國PTI公司）。

1.2 方法

1.2.1 超臨界CO2萃取法制備煙梗浸膏

參照本項目組的方法制備煙梗浸膏［14］。步驟：取適量煙梗于40℃鼓風干燥箱中干燥12 h，使用微型植物試樣粉碎機將煙梗磨成粉末并過380 μm（40目）篩；稱量200 g煙梗粉末，加入煙梗質量20%的85%（體積分數(shù)）乙醇為夾帶劑，混合均勻后靜置過夜；設定萃取溫度60℃、萃取壓力32 MPa、CO2流量 24 L/h，萃取 2.5 h；將萃取液在40℃下減壓蒸餾除去夾帶劑，并于40℃真空干燥箱中干燥12 h，即得到煙梗浸膏。

1.2.2 分子蒸餾法分離純化煙梗浸膏

取50 g煙梗浸膏（m1）進行分子蒸餾。打開真空擴散泵和脫氣閥，脫除浸膏中殘留的溶劑及小分子物質，使真空度恒定在10 Pa（0.1 mbar），然后進行分子蒸餾。分別考察進料速率（15、20、25、30、35、40 g/min）、蒸餾溫度（110、120、130、140、150 ℃）、冷凝口溫度（20、30、40、50、60 ℃）、刮膜轉速（150、200、250、300、350 r/min）對煙梗浸膏蒸餾效率的影響。所有實驗均重復3次。蒸餾結束后，保留輕組分，準確稱量其質量（m2），即為精制的煙梗精油。精油得率Y按公式（1）計算：

1.2.3 煙梗精油的成分分析

準確稱量煙梗精油0.1 g，加入2.0 mL丙酮并超聲10 min使精油充分溶解；加入20 μL質量濃度為20 g/L的乙酸苯乙酯（內標）溶液（溶劑為丙酮），再加入適量無水Na2SO4，靜置12 h；以0.45 μm有機相微孔濾膜過濾，進行GC/MS檢測。GC/MS分析條件為：

色譜柱：DB-5毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口：260 ℃；載氣：氦氣，流速1 mL/min；升溫程序：50℃保持3 min，以10℃/min升至180℃，保持20 min，以5℃/min升至260℃，保持2 min；進樣量：1 μL，分流比 10∶1。傳輸線溫度：280℃；電離方式：EI；電離能量：70 eV；離子源溫度：200 ℃；掃描范圍：35～600 amu；溶劑延遲：3 min。經(jīng)過NIST14譜庫檢索定性。

1.2.4 Box-Behnken實驗設計

利用響應面法中的Box-Behnken組合設計，對蒸餾溫度、刮膜轉速及冷凝口溫度設計三因素三水平的中心組合響應面實驗，以煙梗精油得率為響應值（Y），其中各組實驗中進料速率均采用30 g/h，實驗設計見表1。

按照方程式（2）對本實驗結果進行多元回歸擬合：

表1 Box-Behnken實驗設計的因素和水平Tab.1 Factors and levels of Box-Behnken experimental design

式中：Y 為響應值；Xi和 Xj為獨立變量，i和 j為實驗設計變量；b0為模型距；bi、bii和 bij分別為變量的回歸系數(shù)、線性系數(shù)和二次交互項系數(shù)。

1.2.5 再造煙葉加香評吸

（1）參考文獻［15］的方法制備再造煙葉片基。稱取一定量煙梗樣品，按液固比為6∶1的比例加入蒸餾水；置于65℃水浴中浸泡20 min預處理，過濾后用盤磨機進行盤磨，設定盤磨間隙為0.2 mm；將盤磨后的煙梗樣品置于50℃烘箱中干燥12 h，用PFI磨打漿，控制漿料的初始質量濃度為10%，打漿度40～50°SR；將上述漿液疏解抄片，設定疏解器轉速為8 000 r/min，制得直徑為20 cm的再造煙葉片基，定量為80 g/m2；將再造煙葉片基置于90℃真空條件下干燥15 min，于25℃下保存待用。

（2）再造煙葉片基加香。將煙梗浸膏/精油用95%乙醇進行稀釋；稱取一定量再造煙葉片基；按照再造煙葉片基質量的10%將浸膏/精油均勻噴灑在再造煙葉片基上，于75℃下烘干；置于恒溫恒濕箱中，在溫度（22±1）℃，濕度（60±2）%條件下平衡48 h，待用。

（3）感官評吸實驗。將加香后的再造煙葉切絲，人工卷制成卷煙，進行感官評吸。參考再造煙葉感官評價方法行業(yè)標準［16］并稍作改動，評價涉及香氣、煙氣、雜氣、刺激性和吸味等5個指標，其中香氣30分、煙氣15分、雜氣15分、刺激性15分、吸味25分，總分100分。評吸人員共7人，均具有評吸人員資格證，評吸結果取平均值。

2 結果與討論

2.1 分子蒸餾法制備煙梗精油的單因素實驗結果

2.1.1 冷凝口溫度對精油得率及香味物質含量的影響

由于新植二烯和西柏三烯醇類物質是本方法所得煙梗精油中含量最高的香味物質和香味前體物質［17-18］，因此在進行單因素實驗時，也對新植二烯和西柏三烯醇類物質的含量進行統(tǒng)計，并作為重要參考指標。為研究冷凝口溫度對精油得率及香味物質的影響，設定刮膜轉速300 r/min、蒸餾溫度110℃、進料速率30 g/h，測定冷凝口溫度分別為20、30、40、50、60和70 ℃時的精油得率及香味物質含量，結果如圖1所示。由圖1可以看出，當冷凝口溫度為20℃時，精油得率為0。隨著冷凝口溫度的升高，精油得率與新植二烯、西柏三烯醇類物質的含量均先增加后降低。在50℃時，精油得率達到最高，但60℃時急劇降低；在40～50℃時，新植二烯和西柏三烯醇類物質的含量較高，冷凝口溫度＞60℃時，其含量降低，但降幅較小。綜合考慮，選擇冷凝口溫度40～60℃進行響應面法工藝優(yōu)化實驗。

圖1 冷凝口溫度對精油得率及香味物質含量的影響Fig.1 Effects of condensate temperature on essential oil yield and aroma substance content

2.1.2 刮膜轉速對精油得率及香味物質含量的影響

為研究刮膜轉速對精油得率及香味物質含量的影響，設定蒸餾溫度110℃、進料速率30 g/h、冷凝口溫度50℃，測定冷刮膜轉速分別為150、200、250、300和350 r/min時的精油得率及香味物質含量。結果（圖2）表明，隨著刮膜轉速的增加，精油得率與新植二烯、西柏三烯醇類物質的含量均先增加后降低，其中精油得率在刮膜轉速250 r/min時最大，為7.54%；新植二烯和西柏三烯醇類物質的含量在刮膜轉速300 r/min時最高。綜合考慮，選擇刮膜轉速200～300 r/min進行響應面法工藝優(yōu)化實驗。

圖2 刮膜轉速對精油得率及香味物質含量的影響Fig.2 Effects of film scraping speed on essential oil yield and aroma substance content

2.1.3 進料速率對精油得率及香味物質含量的影響

為研究進料速率對精油得率及香味物質含量的影響，設定冷凝口溫度50℃、刮膜轉速250 r/min、蒸餾溫度120℃，測定進料速率分別為15、20、25、30、35和40 g/h時精油的得率及香味物質含量。結果（圖3）表明，隨著進料速率的增加，精油得率與新植二烯、西柏三烯醇類物質的含量均先緩慢增加后降低。進料速率增至30 g/h時，精油得率與新植二烯、西柏三烯醇類物質的含量均達到最高?？傮w上，進料速率為15～30 g/h時，其對精油得率的影響較小?？紤]到該因素對精油得率和香味物質含量均無顯著影響，因此在后續(xù)實驗中選擇進料速率為30 g/h。

圖3 進料速率對精油得率及香味物質含量的影響Fig.3 Effects of feed speed on essential oil yield and aroma substance content

2.1.4 蒸餾溫度對精油得率及香味物質含量的影響

為研究蒸餾溫度對精油得率及香味物質含量的影響，設定冷凝口溫度50℃、刮膜轉速250 r/min、進料速率30 g/h，測定蒸餾溫度分別為110、120、130、140、150和160℃時的精油得率及香味物質含量。結果（圖4）表明，隨著蒸餾溫度的升高煙梗精油得率呈增加趨勢，但新植二烯、西柏三烯醇類物質含量降低。當蒸餾溫度為110℃時，所得輕組分顏色為淺黃色，其香氣濃郁且具有極強的揮發(fā)性；但重組分中還有濃郁的煙梗氣味，說明重組分中還殘留大量香味物質。當蒸餾溫度升至140℃時，精油得率為9.02%，此時輕組分香氣豐滿且持久，其顏色為金黃色，說明大分子香味物質被蒸餾出來，提升了輕組分的香氣飽和度。當蒸餾溫度繼續(xù)升高時，精油得率繼續(xù)增加，160℃時精油得率為9.89%，但新植二烯和西柏三烯醇類物質的含量較140℃時顯著降低，且此時輕組分呈較為渾濁的棕褐色膏狀，說明蒸餾溫度過高，使浸膏中的蠟質被蒸出，而蠟質會掩蓋煙梗精油的特征香氣，導致精油品質降低。因此，綜合考慮，選擇120～140℃進行響應面法工藝優(yōu)化實驗。

圖4 蒸餾溫度對精油得率及香味物質含量的影響Fig.4 Effects of distillation temperature on essential oil yield and aroma substance content

2.2 分子蒸餾工藝的響應面優(yōu)化

2.2.1 工藝優(yōu)化結果及方差分析

響應面實驗結果（表2）顯示，精油得率為3.79%～9.33%。采用Design Expert 8.0軟件建立回歸模型及方程，計算實驗數(shù)據(jù)的方差并進行分析，根據(jù)P值比較各因素的差異顯著性，結果見表3。

表2 煙梗精油得率的Box-Behnken實驗結果Tab.2 Results of Box-Behnken test for yield of tobacco stem essential oil

表3 響應面回歸方程方差分析Tab.3 Variance analysis of response surface regression equation

由表3可知：該模型P<0.000 1，與響應值關系為極顯著；決定系數(shù)R2=0.998 0，修正后的R2=0.995 5，說明該模型可以解釋99.55%的響應值變化，擬合度非常精確；失擬項P=0.059 5，差異不顯著（P>0.05）?？梢?，該模型較穩(wěn)定且誤差小，適用于各參數(shù)在一定范圍內響應值的預測。根據(jù)F值可知，各因素對煙梗精油得率的影響程度大小順序為蒸餾溫度>刮膜轉速>冷凝口溫度。由表3中建立的回歸模型進行二次多項式回歸分析，可得出如下方程：Y=-221.446 5+2.487 1A+0.260 8B+1.142 2C+3.65×10-4AB-1.125×10-3AC+4.35×10-4BC-8.892 5×10-3A2-6.677×10-4B2-0.013 69C2。通過Design-expert 8.0的優(yōu)化功能可得到分子蒸餾提取煙梗精油的最佳工藝條件：蒸餾溫度140℃、刮膜轉速246.38 r/min、冷凝口溫度39.38℃，此時精油得率理論值可達10.53%。根據(jù)實際操作情況將各參數(shù)調整為蒸餾溫度140℃、刮膜轉速246 r/min、冷凝口溫度39℃，進行分子蒸餾實驗，重復3次，所得精油得率為（10.49±0.05）%，且與該模型預測值差異不顯著（P>0.05），說明模型較可靠。

2.2.2 響應曲面法分析各因素的交互作用

2.2.2.1 蒸餾溫度和刮膜轉速的交互作用

圖5為冷凝口溫度40℃時，蒸餾溫度與刮膜轉速交互作用的響應曲面及等高線圖。可以看出，等高線為橢圓形，說明蒸餾溫度與刮膜轉速交互作用顯著。當蒸餾溫度較低時，隨著刮膜轉速增加，精油得率變化較小，可能是因為溫度低造成蒸餾不徹底，使得變化趨勢不顯著。當蒸餾溫度較高時，精油得率隨著刮膜轉速的增加先增大后減小，適當增加刮膜轉速可使蒸發(fā)面液膜分布均勻，有利于蒸發(fā)過程的進行，但當轉速過大時又會使得原料液滴飛濺，進而導致精油得率下降。

圖5 蒸餾溫度與刮膜轉速對精油得率影響的交互作用Fig.5 Interaction between distillation temperature and scraping film speed on essential oil yield

2.2.2.2 蒸餾溫度與冷凝口溫度的交互作用

圖6為刮膜轉速250 r/min時，蒸餾溫度與冷凝口溫度的等高線及響應曲面圖?？梢钥闯?，等高線圖近似圓形，說明上述兩個因素交互作用并不顯著。在一定的蒸餾溫度下，隨著冷凝口溫度的增加，精油得率先增大后減小，可能是因為冷凝口溫度低造成原料黏度大而流動性小，而冷凝口溫度過高又會使輕組分不能完全冷凝而被真空擴散泵迅速抽走。當冷凝口溫度一定時，精油得率隨著蒸餾溫度升高而增大，該趨勢在較低溫度時更為顯著。

圖6 蒸餾溫度與冷凝口溫度對精油得率影響的交互作用Fig.6 Interaction between distillation temperature and condensate temperature on essential oil yield

2.2.2.3 刮膜轉速與冷凝口溫度的交互作用

圖7為蒸餾溫度130℃時，刮膜轉速與冷凝口溫度的響應曲面及等高線圖?？梢钥闯觯雀呔€圖近似圓形，說明上述兩個因素交互作用并不顯著。煙梗精油得率隨著刮膜轉速和冷凝口溫度升高先增大后減小，這是因為適當?shù)靥岣吖文まD速和冷凝口溫度可使液膜在蒸發(fā)面上形態(tài)薄且分布均勻，同時可提升原料流動性，從而促進蒸餾進行；但轉速過快及冷凝口溫度過高會使液滴飛濺及輕組分不能及時冷凝，從而降低精油得率。

圖7 刮膜轉速與冷凝口溫度對精油得率影響的交互作用Fig.7 Interaction between scraping film speed and condensate temperature on essential oil yield

2.3 煙梗浸膏分子蒸餾所得精油的成分

取超臨界CO2萃取所得的煙梗浸膏，采用分子蒸餾最佳工藝條件進行分離提純，并將所得的精油進行GC/MS檢測，通過檢索NIST14譜庫對化學成分進行定性，以內標法對成分含量進行半定量分析，結果如表4所示。

由表4可知，煙梗浸膏經(jīng)分子蒸餾所得精油中共檢出24種物質，其中3種氮氧雜環(huán)類、1種烯烴類、3種羥基類、5種醛酮類、6種酯類和6種酸類物質。將分子蒸餾所得精油與超臨界CO2萃取法所得浸膏的成分及含量進行對比發(fā)現(xiàn)，這24種成分的濃度均有大幅提升，其中桉葉油醇的富集倍數(shù)最高，達到112倍。除了含量較高的棕櫚酸的富集倍數(shù)僅為4倍，其他成分的富集倍數(shù)均在10～50倍之間。同時，在分子蒸餾的精油中還新檢測出3,5-二羥基-2-甲基-4H-吡喃-4-酮、5-羥甲基糠醛、香蘭素、肉桂酸和2,7,11-西柏三烯-4-醇等香味物質，這是由于其在超臨界CO2萃取法所得浸膏中含量較低，未被檢出，但經(jīng)分子蒸餾富集后其含量提升，從而被檢出。另外，一些在浸膏中含量極低的物質，如石竹烯、2-茨醇、橙花叔醇、2-茨酮和月桂酸等，在分子蒸餾后未檢出，這可能是由于其含量較低，且在蒸餾過程中發(fā)生了揮發(fā)損失。綜上所述，分子蒸餾不僅可以使煙梗浸膏中特征香味物質得到有效富集，而且有利于保持煙梗精油的本香。

表4 煙梗浸膏及其精油中的揮發(fā)性化學成分Tab.4 Volatile constituents from extract and essential oil of tobacco stem

2.4 煙梗浸膏及其精油的再造煙葉加香效果

將分子蒸餾所得精油及超臨界萃取所得煙梗浸膏應用于再造煙葉的加香實驗，并進行感官評吸。結果（表5）表明，與添加浸膏的再造煙葉相比，添加精油的再造煙葉的香氣品質提升，雜氣減少，且發(fā)酵性酸香增加，總體感官舒適性提升。

表5 再造煙葉加香效果比較①Tab.5 Comparison of flavoring effects of reconstituted tobacco （分）

3 結論

采用響應面法優(yōu)化了分子蒸餾工藝提純煙梗浸膏工藝，確定的工藝條件為：蒸餾溫度140℃，刮膜轉速246 r/min，冷凝口溫度39℃。此條件下煙梗精油得率為10.49%±0.05%，且與模型預測值差異不顯著。與煙梗浸膏相比，分子蒸餾后所得精油中檢測出的24種成分的濃度均有大幅提升，其中桉葉油醇的富集倍數(shù)最高，達到112倍。此外，在分子蒸餾的精油中還新檢測出3,5-二羥基-2-甲基-4H-吡喃-4-酮等香味物質，表明分子蒸餾使煙草中的特征香味物質得到了有效富集。與添加煙梗浸膏的再造煙葉產(chǎn)品相比，添加分子蒸餾所得精油后，再造煙葉產(chǎn)品的香氣品質明顯改善，雜氣降低，感官舒適性提升。本研究結果可為提升煙梗浸膏的利用價值提供參考。