棉大卷葉螟求偶行為節(jié)律和性信息素鑒定

朱俁偉, 司玉曉, 鄧 穎, 李 瑜, 鄧建宇, 董雙林, 閆 祺,*

(1. 南京農業(yè)大學植物保護學院, 南京 210095; 2. 浙江農林大學現(xiàn)代農學院, 杭州 311300)

棉大卷葉螟Syleptaderogata屬鱗翅目(Lepidoptera)螟蛾科(Pyralidae)，在我國除寧夏、青海、新疆等地區(qū)未見報道外，其余省區(qū)均有分布(陸佩玲等, 2008)，以幼蟲吐絲綴葉危害棉花、秋葵、冬寒菜、蜀葵、朱槿等農林植物。大發(fā)生時一片葉上可達數(shù)個葉卷，嚴重時吃光所有葉片，僅留枝、莖，影響作物產(chǎn)量與質量。隨著轉Bt基因抗蟲棉的普遍種植，棉田殺蟲劑使用量大幅下降，使得棉大卷葉螟在棉花上的發(fā)生和危害呈上升趨勢(陳建等, 2008)。

目前，棉大卷葉螟的防控主要依靠化學防治，但由于棉大卷葉螟幼蟲有卷葉取食的習性，降低了與化學藥劑的接觸率，防治效果并不理想，且長期使用化學藥劑，極易帶來環(huán)境污染，生態(tài)系統(tǒng)破壞，最終危害人類健康，為此，探索開發(fā)新型綠色環(huán)保的害蟲防治方法十分必要。昆蟲性信息素在害蟲治理上具有安全高效、無污染、專一性強等優(yōu)點，有著廣泛的應用前景，而昆蟲性信息素產(chǎn)品開發(fā)應用的基礎是昆蟲性信息素化學組分結構的鑒定。至今為止，全世界己鑒定的昆蟲性信息素或類似物超1 000種，我國投入使用的性信息素產(chǎn)品有100多種(El-Sayed, 2020)，如:徐善忠等(2019)利用有效成分為Z11-16∶Ald和Z13-18∶Ald的混合制劑干擾稻縱卷葉螟Cnaphalocrosismedinalis和二化螟Chilosuppressalis的交配，防治效果顯著;程英等(2019)利用斜紋夜蛾Prodenialitura性誘劑對貴州地區(qū)辣椒斜紋夜蛾進行蟲情預測，及時準確地反映貴州不同地區(qū)辣椒斜紋夜蛾的種群消長情況并作出預報預測。

目前國內外對于棉大卷葉螟的研究多為形態(tài)特征、生物學特性、吐絲機理等方面。雖然張清泉(2011)利用棉大卷葉螟雌蛾性腺浸提液在野外成功誘捕到一定數(shù)量的棉大卷葉螟，但關于棉大卷葉螟性信息素鑒定方面的研究尚未見文獻報道。鑒于性信息素應用于防治害蟲防治的諸多優(yōu)點，本文將重點對棉大卷葉螟雌蛾的求偶行為及其動態(tài)、性信息素組分的鑒定開展研究，以期為開發(fā)棉大卷葉螟性信息素誘芯并應用于田間種群的高效監(jiān)測和綠色防控提供依據(jù)和指導。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

棉大卷葉螟幼蟲采集自南京郊區(qū)的棉花Gossypiumspp.田或秋葵Abelmoschusesculentus田。試蟲采回飼養(yǎng)于養(yǎng)蟲室內，溫度為25±1℃，相對濕度為60%±10%，光周期為14L∶10D。初孵幼蟲飼養(yǎng)于培養(yǎng)皿中(直徑7 cm)，每個培養(yǎng)皿放入1～2片秋葵、冬葵寄主葉片，以及約15頭幼蟲，每2 d換一次新鮮葉片。待幼蟲生長至3齡后，轉移到飼養(yǎng)盒(10 cm×20 cm×5 cm)中，繼續(xù)用新鮮寄主葉片飼養(yǎng)，每盒10頭左右，直至幼蟲化蛹。之后將蛹取出，區(qū)分雌雄后，分別置于飼養(yǎng)盒(10 cm×20 cm×5 cm)中待其羽化。每日光期開始后檢查并取出羽化的成蟲，按照1∶1的雌雄比例置于交配籠(13 cm×25 cm×11 cm)中交配，每個交配籠中放10對，成蟲用10%的蜂蜜水補充營養(yǎng)。

1.2 棉大卷葉螟求偶行為及其動態(tài)節(jié)律

將羽化當日的雌蛾單頭放入已編號的塑料杯(杯底直徑6 cm、杯口直徑9 cm、杯高12 cm)中，塑料杯底部中央放置浸有10%蔗糖溶液的脫脂棉球，將培養(yǎng)皿倒扣塑料杯。從暗期開始前0.5 h到暗期結束后0.5 h，每隔30 min觀察記錄1次雌蛾的求偶情況，以棉大卷葉螟雌蛾腹部末端產(chǎn)卵器持續(xù)伸出或者產(chǎn)卵器有規(guī)律地伸縮為標準(王焱等, 2009)。觀察時用紗布遮擋紅光燈燈源，以避免強光干擾雌蛾的求偶行為。從下一個暗期記為1日齡開始，連續(xù)觀察7 d，共觀察20頭處女雌蛾。

1.3 棉大卷葉螟雌蛾性信息素的提取

選取3-4日齡未交配的棉大卷葉螟雌蛾，在暗期開始后4-5 h之間提取性信息素腺體。用手輕輕擠壓雌蛾腹部，迫使其性信息素腺體完全伸出腹部(圖1)，用解剖剪將腺體剪下，放入含有約1 mL正己烷的樣品瓶中，每瓶放入5個腺體，使腺體完全浸泡在正己烷中，靜置30 min后取出腺體。將6個樣品瓶的浸提液分別過濾合并后，用氮氣濃縮至1 mL左右，密封并儲存在-20℃冰箱中備用。

圖1 棉大卷葉螟雌蛾性信息素腺體

1.4 棉大卷葉螟雌蛾性腺浸提液的GC-EAD分析

氣相色譜-觸角電位聯(lián)用儀(GC-EAD)所用GC為安捷倫7890B，色譜柱為HP-5MS(30 m×0.25 mm, 0.25 μm; J&W Scientific, Folsom, CA, USA)，分流器(OSS-2, SGE, 澳大利亞)接出口端，1∶1分流，一部分進入FID氫火焰離子檢測器，另一部分經(jīng)過加熱套管加熱通過潔凈的氣流吹向固定在EAG裝置上的雄蛾觸角。昆蟲觸角電位儀(EAG)為德國Syntech公司生產(chǎn)，采用IDAC-4信號放大器采集數(shù)據(jù)。氣相色譜儀條件：檢測器為FID氫火焰離子檢測器，氮氣作為載氣，采用無分流進樣，進樣口溫度為220℃，檢測器溫度260℃。GC柱箱升溫程序：起始溫度80℃，保持1 min，以8℃/min的速率升溫至210℃，保持10 min，最后以15℃/min的速率升溫至260℃，保持2 min。GC-EAD分析時，選擇處于暗期3 h左右3日齡未交配的棉大卷葉螟雄蛾，將1根雄蛾的觸角用解剖剪從基部剪下后，用刀片在觸角兩端分別切除約1 mm，利用導電膠(Spectra 360)將觸角固定在電極兩端，然后將電極插入EAG探頭中。手動進樣2 μL性腺浸提液(約為3頭雌蛾當量，3 FE)，經(jīng)分流后一部分進入FID氫離子檢測器，另一部分經(jīng)過加熱套管加熱吹向雄蛾觸角，記錄到的觸角電位通過信號放大器IDAC-4采集數(shù)據(jù)，使用EAG Pro軟件同步記錄GC圖譜和EAG圖譜。

1.5 棉大卷葉螟雌蛾性腺浸提液的GC-MS分析

氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(GC-MS)所用GC為安捷倫7890A串聯(lián)安捷倫MS 5977B，GC-MS中的色譜柱與GC-EAD相同，以氮氣為載氣。電離方式為電子轟擊電離(EI)，電離能量為70 eV，離子源發(fā)生器溫度為220℃，質量掃描范圍為m/z33～400 amu。GC柱箱升溫程序：起始溫度80℃，保持1 min，以8℃/min的速率升溫至210℃，保持10 min，最后以15℃/min的速率升溫至250℃保持2 min。采用手動進樣，每次進樣量為2 μL(約3 FE)。通過對比GC-EAD圖譜和GC-MS總離子流圖(TIC)的峰形和保留時間(RT)，分析候選化合物的特征離子碎片，匹配儀器聯(lián)機的Nist14數(shù)據(jù)庫中的標準化合物質譜圖來確定性信息素組分的具體化學結構。

1.6 棉大卷葉螟雌蛾性腺浸提液和10,12-16∶Ald混合標準樣品的GC分析

分析10,12-16∶Ald的4種同分異構體標準品混合溶液(含E10,E12-16∶Ald,E10,Z12-16∶Ald,Z10,Z12-16∶Ald和Z10,E12-16∶Ald 4種組分)所用GC為賽里安456-GC。氣相色譜條件：檢測器為FID氫火焰離子檢測器；各性信息素組分的分離依靠BR-5石英毛細管色譜柱，進樣口溫度為220℃，檢測器溫度為250℃，以氮氣作為載氣，采用不分流手動進樣。GC柱箱升溫程序：起始溫度60℃，保持2 min，以3℃/min的速率升溫至180℃，最后以10℃/min的速率升溫至250℃保持5 min。 Comp. II和10,12-16∶Ald的4種同分異構體的保留指數(shù)(Kovats indix, KI)的計算以色譜圖上位于待測物質兩側的相鄰正構烷烴的保留值為基準，用對數(shù)內插法求得。

1.7 棉大卷葉螟雄蛾觸角對標準化合物的EAG分析

昆蟲觸角電位儀(EAG)為德國Syntech公司生產(chǎn)，采用IDAC-4信號放大器采集數(shù)據(jù)。分別配制E10,Z12-16∶Ald的濃度為0.01, 0.1, 1, 10和100 ng/μL的正己烷溶液，放在4℃冰箱中冷藏備用。將濾紙剪成約0.8 cm×5 cm的紙條，用移液槍將所配的E10,Z12-16∶Ald溶液以及正己烷分別在不同的濾紙條上滴加10 μL。待濾紙條上的正己烷揮發(fā)2 min后，將濾紙條放進巴氏玻璃管中。EAG分析時，選擇處于暗期4 h左右3日齡未交配的棉大卷葉螟雄蛾，將雄蛾的觸角用解剖剪從基部剪下后，用刀片在觸角兩端分別切除約1 mm，利用導電膠(Spectra 360)將觸角固定在電極兩端，然后將電極插入EAG探頭中。 將裝有濾紙的巴氏玻璃管口打開，按照空氣、正己烷、濃度由低到高的E10,Z12-16∶Ald的順序刺激觸角，測出一組EAG值，以不同雄蛾的觸角為重復，測得5組EAG數(shù)據(jù)。記錄到的觸角電位通過信號放大器IDAC-4采集數(shù)據(jù)，使用EAG Pro軟件記錄數(shù)據(jù)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

求偶起止時間、持續(xù)時間以及觸角電位反應等實驗數(shù)據(jù)采用單因素方差分析[最小顯著性差異法(least significant difference, LSD)]。 所有數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2016初步統(tǒng)計，然后用SPSS 17.0 Windows數(shù)據(jù)包分析處理，用Graphpad Prism 8軟件作圖。

2 結果

2.1 棉大卷葉螟雌蛾求偶行為

對20頭棉大卷葉螟處女雌蛾連續(xù)觀察7 d表明，雌蛾在求偶時，觸角左右擺動，雙翅高高抬起，快速振動，產(chǎn)卵器持續(xù)外伸。在暗期內不同時間段，各日齡雌蛾的求偶行為呈現(xiàn)明顯的時動態(tài)節(jié)律；在暗期開始0.5 h，各日齡雌蛾均無求偶行為；此后個體求偶率逐漸增加，在暗期中期(4-7.5 h)達到最大，期間(5-5.5 h)出現(xiàn)短暫下降，總體表現(xiàn)為雙峰型；暗期7.5 h至暗期結束，求偶率不斷下降，進入光期后所有雌蛾無求偶行為(圖2)。

圖2 棉大卷葉螟雌蛾求偶行為節(jié)律

不同日齡雌蛾的求偶節(jié)律相似，但最高個體求偶率存在明顯差異(圖2)。1日齡雌蛾的求偶率最高為50%，隨日齡的增加求偶率逐漸升高，至2日齡的60%并在3日齡達到最大為70%；從4日齡開始求偶率逐漸下降，至7日齡求偶率降至40%。

通過對棉大卷葉螟各日齡雌蛾的平均求偶起始時間及持續(xù)時間進行分析(圖3)，結果表明1日齡雌蛾的平均求偶起始時間(暗期開始后4.78 h)顯著遲于3-5日齡(P<0.05)，3-7日齡間的差異則不顯著；各日齡雌蛾平均求偶終止時間均在暗期后的7-8 h，以4日齡雌蛾最晚，此后雌蛾平均求偶終止時間逐漸提前，但各日齡之間不存在顯著性差異。從平均求偶持續(xù)時間來看，1-3日齡雌蛾隨日齡增長而逐漸延長，在3日齡雌蛾求偶持續(xù)時間達到最大(3.5 h)；此后，雌蛾求偶持續(xù)時間逐漸下降，至7日齡僅為1.94 h；3-4日齡雌蛾平均求偶持續(xù)時間與1日齡、7日齡雌蛾之間存在顯著差異(P<0.05)。綜合分析表明，3-4日齡雌蛾維持較高的求偶率和持續(xù)求偶時間，表明3-4日齡為棉大卷葉螟雌蛾求偶高峰日齡。

圖3 不同日齡棉大卷葉螟雌蛾求偶起止及持續(xù)時間比較

2.2 棉大卷葉螟雌蛾性腺浸提液的GC-EAD分析

根據(jù)雌蛾求偶行為節(jié)律觀察結果，在暗期4-5 h之間以正己烷為溶劑浸提3-4日齡棉大卷葉螟處女雌蛾的性信息素腺體，并對腺體浸提液進行GC-EAD分析，選用3日齡雄蛾觸角進行實驗。GC-EAD結果顯示，在保留時間11.90 min以及14.45 min處存在著能引起雄蛾觸角電位反應的活性物質Comp. I和Comp. II(圖4)，該結果具有3次以上的重復。

圖4 棉大卷葉螟雄蛾觸角對雌蛾性信息素腺體浸提液的GC-EAD分析圖譜

2.3 棉大卷葉螟雌蛾性腺浸提液的GC-MS分析

圖5 棉大卷葉螟處女雌蛾性信息素腺體浸提液的總離子流圖

圖6 棉大卷葉螟雌蛾性信息素組分Comp. II的質譜圖

表1 棉大卷葉螟雌蛾性信息素組分Comp. II和10,12-16∶Ald同分異構體在BR-5色譜柱上的保留時間和保留指數(shù)

2.4 雄蛾觸角對E10,Z12-16∶Ald標準品的觸角電位反應

配制濃度為1 ng/μLE10,Z12-16∶Ald標準品溶液10 μL進行EAG分析，以空氣和溶劑正己烷作為對照，選用3日齡雄蛾觸角。結果顯示，與對照相比，10 ngE10,Z12-16∶Ald可以引起棉大卷葉螟雄蛾觸角顯著的觸角電位反應(圖7)。

圖7 棉大卷葉螟雄蛾觸角對E10,Z12-16∶Ald (10 ng)的觸角電位反應

進一步對棉大卷葉螟雄蛾進行了不同劑量的E10,Z12-16∶Ald的觸角電位實驗，結果顯示，隨著刺激劑量的增加，雄蛾觸角對E10,Z12-16∶Ald的觸角電位反應不斷增強，呈現(xiàn)出明顯的劑量效應(圖8)。

3 討論

一般而言，雌蛾的求偶行為伴隨著性信息素的釋放，求偶高峰期也是性信息素釋放的高峰期，因此在求偶高峰期提取性信息素能達到最佳提取效果。受自身性成熟特性和外界環(huán)境的影響，不同昆蟲求偶的日、時節(jié)律均存在較大差異。就昆蟲發(fā)生求偶行為的日齡看，豹蠹蛾Zeuzeraleuconotum羽化當天即可求偶，在2日齡時就已經(jīng)處于求偶高峰期(劉金龍等, 2013)。而黃野螟Heortiavitessoides可能由于雌蛾性腺沒有發(fā)育成熟，在羽化當日沒有求偶行為(王忠等, 2018)，小地老虎Agrotisipsilon雌蛾在羽化當天的暗期開始求偶，在3日齡暗期7-9 h時求偶最活躍(向玉勇, 2007)。而棉大卷葉螟在羽化當天沒有求偶行為，求偶率自1日齡時開始逐漸升高，最大值出現(xiàn)在3日齡時，最大求偶率為70%，隨后開始下降。雌蛾求偶起止時間、持續(xù)時間的結果也表明，3-4日齡的雌蛾具有更高的求偶趨性，這與很多其他蛾類昆蟲如甜菜夜蛾Spodopteraexigua(Dong and Du, 2001)類似。蛾類昆蟲通常在暗期進行求偶，在暗期不同時段也呈現(xiàn)節(jié)律性變化。棉大卷葉螟雌蛾的求偶高峰期在暗期中期(4-7.5 h)，與雌雄蛾間交配行為的高峰時段(暗期2-3 h)(張清泉, 2009)稍有差異，推測可能由于觀察棉大卷葉螟交配實驗所設置的光周期為13L∶11D，從而導致交配高峰時段的提前。

鱗翅目昆蟲性信息素大多屬于10～23個碳原子的直鏈不飽和化合物(Andoetal., 2004)，使用GC-MS分析性信息素的化學結構十分高效，但由于在質譜電子轟擊(EI)條件下，不飽和脂肪族化合物碳碳雙鍵不容易發(fā)生裂解，化合物在形成分子離子后氫原子容易發(fā)生沿碳鏈重排，所以僅憑對質譜圖的分析難以確定化合物具體的順反構型(Ando and Yamakawa, 2011)。一種確定提取物中候選性信息素組分雙鍵構型的方法是通過已知化合物來確定，即通過比較已知化合物和待定組分的保留時間(RT)或保留指數(shù)(KI)進行確定具體構型。如Do等(2011)在鑒定梨潛皮細蛾Spulerinaastaurota性信息素的過程中，利用GC比較4種共軛雙鍵位于第9和11位的十六碳烯醇同分異構體(E9,E11-16∶OH,E9,Z11-16∶OH,Z9,E11-16∶OH和Z9,Z11-16∶OH)在不同色譜柱條件下的保留時間與保留指數(shù)，從而確定Z9,Z11-14∶OH為梨潛皮細雌蛾性信息素主組分。Yan等(2014, 2018)通過同樣的方法確定了甘薯莖螟Palpitanigropunctalis、二點委夜蛾Athetislepigone等害蟲性信息素組分的順反構型。另一種確定提取物中候選性信息素組分雙鍵構型的方法則是利用氣相色譜-傅里葉變換紅外光譜聯(lián)用技術(GC-FT/IR)。對于性信息素組分的長鏈不飽和醛、醇、乙酸酯等結構，除了羧基、羥基有特定的紅外吸收譜之外，順式雙鍵和反式雙鍵的紅外特征吸收譜也不相同。自Zarbin等(2012)和Soldi等(2012)將GC-FT/IR相繼用于鑒定半翅目昆蟲Edessameditabunda和Phthiapicta的性信息素甲基支鏈的鑒定之后，Shibasaki等(2013)首次將該技術用于鱗翅目昆蟲Monemaflavescens的性信息素順反異構的鑒定中。本研究通過比較Comp. II與10,12-16∶Ald的4種同分異構體在色譜柱上的保留時間和保留指數(shù)，從而確定了Comp. II為E,Z構型。

鱗翅目是昆蟲綱第二大目，已描述約15萬種，目前已鑒定出超過700種蛾類的性信息素，各個種間性信息素的組分和比例都不盡相同，這與種群間的生殖隔離有密不可分的關系。盡管許多昆蟲的性信息素中存在相同的主組分，但次要組分在昆蟲性信息素的種特異性中也起著重要的作用(Chenetal., 2018)。10,12-16∶Ald作為一種鱗翅目昆蟲中常見的性信息素組分，其4種不同的構型及其他次要組分是特定昆蟲能夠特異性識別自身性信息素的重要原因之一。據(jù)報道，華麗野螟Agathodesostentalis(Wakamura and Arakaki, 2004)、綠翅絹野螟Diaphaniaangustalis(Maetal., 2017)、豆野螟Marucatestulalis(Schl?geretal., 2015)等蛾類的性信息素主要組分均為E10,E12-16∶Ald；E10,Z12-16∶Ald也廣泛存在于其他鱗翅目昆蟲中，比如煙草天蛾Manducasexta(Starrattetal., 1979)、翠紋鉆夜蛾Eariasvittella(Corketal., 1988)、三角斑褐蠶蛾Trilochavarians(Daimonetal., 2012)等；Hemarisdiffinis以Z10,E12-16∶Ald作為性信息素主要組分(Reedetal., 1987)。那么對于這些含有相同主組分的昆蟲而言，其他次要組分(如10,12-16∶OH,10,12-16∶OAc或其他化合物)則在特異性識別同類和順利交配中發(fā)揮著重要作用。本研究對棉大卷葉螟性信息素提取物的GC-EAD分析中有2種能引起觸角電位反應的物質(Comp. I和II)，但只對含量較高的主組分Comp. II(E10,Z12-16∶Ald)進行了化學鑒定，Comp. I在腺體中的含量較低，未能在GC-MS分析中獲得有效的質譜圖。對于Comp. I，我們按照保留時間、同科他種的性信息素文獻數(shù)據(jù)做了一些推測，對化合物E10-16∶Ald和Z12-16∶Ald等做了分析，但它們的保留時間均與Comp. I不完全匹配，E8,Z10-14∶Ald,E8-14∶Ald和Z10-14∶Ald也是可能的候選化合物，但因無法獲得該化合物，未做進一步分析，今后如能對該活性物質的結構進行鑒定，則有望用于性誘劑的研發(fā)，進而為棉大卷葉螟的性信息素綠色防控技術提供理論基礎。