新疆紫草的紅外指紋圖譜及高效薄層色譜研究*

閆曉彩，丁文歡，敬曉莉，徐海燕

（新疆醫(yī)科大學 中醫(yī)學院，新疆 烏魯木齊 830011）

紫草作為一種傳統(tǒng)中藥，在國內(nèi)外均有研究。在國內(nèi)，新疆紫草主要分布于天山南北坡和西藏的西部，國外如尼泊爾、巴基斯坦、阿富汗等地也有分布。其主要生長于高海拔地區(qū)的山地、草地及草甸等處。紫草含有醌類、酯類、酚酸類、脂肪族及黃酮、多糖[1-6]等成分，其中國內(nèi)外對其醌類成分研究較多。發(fā)現(xiàn)紫草的醌類成分具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤以及促進傷口愈合[7]等作用。

本研究采用紅外光譜法及HPTLC 法，簡單、快速的建立紫草的紅外圖譜及薄層色譜，為不同產(chǎn)地新疆紫草的快速鑒別提供了幫助，也為后續(xù)研究提供了一種高效、快速的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器及材料

SpectrumⅡ型傅里葉變換紅外光譜儀（美國Perkin Elmer 公司）；YP-2 型壓片機（上海山岳科學儀器有限公司）；AB265-S（1/10 萬）型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；多功能粉碎機（上海緣沃工貿(mào)有限公司）；KQ5200DE 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀儀器有限公司）；HH-S4 型數(shù)顯恒溫水?。ń饓嗅t(yī)療儀器廠）；薄層色譜展開缸（100mm×200mm；中國上海）；移液管；100μL 微量進樣器（中國上海安亭微量進樣器廠）；CAMAG 掃描儀、CAMAG 數(shù)字成像系統(tǒng)、CAMAG 半自動定位儀器，均來自瑞士CAMAG。

KBr（光譜純 經(jīng)過研磨后烘干并密封備用）；HPTLC 硅膠G 板（20210319 安徽良辰硅源材料有限公司）；凈化水（新疆醫(yī)科大學中心實驗室自制）；石油醚、甲醇、乙酸乙酯、二甲苯、甲酸，純度大于99%，天津市北聯(lián)精細化學品開發(fā)有限公司；左旋紫草素、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧、乙酰紫草素、β,β-二甲基丙烯酰紫草素，均為10mg，純度＞98%，Tauto Biotech。

表1 新疆紫草編號及來源Tab.1 Numbers and sources of Arnebia euchroma

1.2 樣品處理

1.2.1 紅外光譜樣品制備 將新疆紫草粉碎后過200 目篩，取1g 置于EP 管中，密封保存。為減少H2O的影響，實驗前將藥材置于60℃烘箱進行干燥4h，KBr 置于120℃烘箱干燥5~6h（KBr 應(yīng)少量多次進行干燥）。

1.2.2 薄層色譜樣品制備 稱取樣品各1g，加入40mL 石油醚，100Hz 超聲40min，過濾后將濾液置于蒸發(fā)皿中水浴蒸干，用甲醇將其溶解并定容至1mL，濃度為1g·mL-1。

1.2.3 標準品制備 分別稱取5.00mg 左旋紫草素、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧、乙酰紫草素及β,β-二甲基丙烯酰紫草素4 種化學成分，用甲醇將之溶解，定容至5mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅外光譜采集

先將光譜儀預熱1h。以空白KBr 為背景，將片制成厚度約為1mm 透明薄片，20s 后取出。將完好壓片放入紅外光譜分析儀中掃描，掃描條件：以400~4000cm-1作為掃描范圍，掃描次數(shù)為16 次，分辨率為4cm-1。新疆紫草以每份2.0mg 與KBr 按1∶80比例混合，研磨均勻后進行壓片、掃描，得光譜圖并導出數(shù)據(jù)。

2.1.1 各紫草的紅外光譜及特征 將峰值及編號輸入OriginPro 8.5.1 軟件，以波長為橫坐標，透射率為縱坐標，設(shè)置各樣本間距為0.15，制作不同產(chǎn)地新疆紫草的紅外光譜，見圖1。

圖1 新疆紫草紅外光譜圖Fig.1 Infrared spectra of Arnebia euchroma

由圖1 可見，除個別新疆紫草外，所有紫草均在3400、2920、1735、1615、1513、1425、1376、1260、1053、600、535cm-1附近有吸收。其中，超3/4 的新疆紫草在2852、465cm-1附近有吸收；超1/2 的新疆紫草770、672cm-1附近有吸收；X-6、X-7、X-9、X-10、X-15、X-16 在810-831cm-1之間有吸收；X-5、X-7、X-16 在1335cm-1附近有吸收；X-3、X-5、X-8 在1155 cm-1附近有吸收；只有X-6 在1105cm-1附近有吸收；部分新疆紫草在1033cm-1附近有吸收。

2.1.2 各紫草的相似度分析 利用SPSS 統(tǒng)計軟件，均以1 號產(chǎn)地紫草為對照，進行相似度分析，結(jié)果見表2。

表2 新疆紫草的相似度分析Tab.2 Similarity analysis of Arnebia euchroma

由表2 可得，各紫草的相似度均大于0.97，即藥材的質(zhì)量存在較小的差異。

2.1.3 各紫草的聚類分析 利用SPSS 21.0 軟件將新疆紫草進行聚類分析。用平均連接法樹狀圖，以歐式距離平方為基準進行分析，結(jié)果見圖2。

圖2 新疆紫草聚類分析圖Fig.2 Analysis of Arnebia euchroma cluster analysis

由圖2 可知，當歐式距離為15 時，新疆紫草可以分為3 類；當歐式距離為20 時，新疆紫草可以分為兩類；當歐式距離大于25 時，新疆紫草才可以歸為1 類。

2.2 高效薄層色譜法的檢測結(jié)果

樣品需經(jīng)過濾膜（0.22μm）過濾。經(jīng)過多次調(diào)整，最終確定了展開條件以石油醚∶二甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸為6∶4∶0.5∶0.5 最佳。各樣品設(shè)置點樣量為2μL,白光照射，獲得其日光圖，見圖3。

圖3 標準品及樣品日光圖Fig.3 Chromatograms of the standardsand samples taken under white light

將4 種化學成分的標準品與樣品在400~700nm處用TLC 掃描儀掃描，測定最大吸收波長為522nm。

2.2.1 方法學考察

（1）線性 分別精確吸取左旋紫草素、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧及乙酰紫草素標準溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0μL；β,β-二甲基丙烯酰紫草素0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μL。以標準品的質(zhì)量作為橫坐標，峰面積值為縱坐標，繪制標準曲線。4 種成分的回歸方程分別為y=5313x+6307.4，R2=0.9912；y=4851.4x+3953.8,R2=0.9947；y=4431x+5690.9,R2=0.9902 和y=5081.1x+1178.2，R2=0.9987。

（2）精密度 精確吸收各標準品溶液2.0μL 進樣6 次后，檢測其峰面積，發(fā)現(xiàn)4 種化學成分的RSD分別為2.57%、2.37%、2.67%及2.71%，均小于5%。

（3）穩(wěn)定性 精確吸收同一批樣品（X-7），檢測在0、6、12h 時的峰面積，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，X-7 中4 種化學成分的RSD 分別為0.07%、2.85%、2.02%、0.86%。

（4）重復性 根據(jù)供試品制備方法提取6 份同一樣品（X-7），進樣6 次后，檢測其峰面積，發(fā)現(xiàn)4種化學成分的RSD 分別為2.75%、2.85%、1.16%及1.79%。

（5）加標回收率 通過線性已知各樣品含量，稱量約為1g 的X-4 粉末，分別加入約為樣品含量的80%、100%和120%的4 種化學成分標準溶液。各平行制備3 個樣品，通過峰面積計算回收率，結(jié)果見表3。

表3 加標回收率結(jié)果Tab.3 Results of the recovery test

由表3 可知，左旋紫草素的回收率在98.00%~102.06%之間，平均回收率為99.68%；β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧的回收率在98.16%~101.65%之間，平均回收率為100.21%；乙酰紫草素的回收率在96.32%~102.92%之間，平均回收率為100.20%；β,β-二甲基丙烯酰紫草素的回收率在96.04%~100.94%之間，平均回收率為98.10%。說明該方法對4 種化學成分的測定準確可靠。

（6）含量測定 在522 nm 處掃描測定18 批新疆紫草中4 種化學成分的峰面積，并將其帶入對應(yīng)的線性方程，計算其含量，結(jié)果見表4。

表4 各樣品中4 種成分含量測定結(jié)果（mg·g-1）Tab.4 Results of the content of the four components ineach sample（mg·g-1）

2.3 討論

經(jīng)研究報道，左旋紫草素具有抗宮頸癌及抑制破骨細胞分化的作用[8,9]。β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧具有抗食管癌的作用[10]，乙酰紫草素、β,β-二甲基丙烯酰紫草素均具有抗結(jié)腸癌的作用[11]。其中乙酰紫草素還具有抑制乳腺癌的發(fā)生、改善肺炎、抗黑色素瘤等多種抗癌作用。

與《中國藥典》相比，展開劑石油醚∶二甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸為6∶4∶0.5∶0.5 的條件下，分離度更好且二甲苯比苯的毒性更低，更有益于人體健康與綠色環(huán)境。

3 結(jié)論

（1）本研究采用紅外光譜，將光譜圖進行13 點平滑，基線校正后，對18 批新疆紫草進行對比分析，發(fā)現(xiàn)各紫草間的相似度較高。故紅外光譜無法更好的區(qū)分各紫草，其只能證明各紫草中所含官能團差異較小。

（2）高效薄層色譜研究發(fā)現(xiàn)，18 批新疆紫草中左旋紫草素的含量在0.05~1.47mg·g-1之間；β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧的含量在0.36~2.53mg·g-1之間；乙酰紫草素的含量在0.14~6.32mg·g-1之間；β,β-二甲基丙烯酰紫草素的含量在0.49~13.89mg·g-1之間。由此可見，不同產(chǎn)地的新疆紫草間4 種化學成分的含量差異較大。