基于中醫(yī)脾虛量表的結(jié)直腸癌患者臨床特征、腸道菌群及免疫功能相關(guān)性研究?

閆蘊(yùn)孜， 孫凌云， 閆韶花， 吳 娜， 寧春暉， 楊宇飛△

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)西苑臨床醫(yī)學(xué)院， 北京 100029；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京 100091)

結(jié)直腸癌是最常見(jiàn)的惡性消化道腫瘤之一。據(jù)最新數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率分別居全部惡性腫瘤的第4位和第5位，且發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。中醫(yī)認(rèn)為結(jié)直腸癌病位在腸，病本在脾。“脾主運(yùn)化”是脾最主要的生理功能，是指脾將水谷精微消化吸收并傳輸至全身的功能，其包括營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收和物質(zhì)轉(zhuǎn)化為能量的過(guò)程。有研究表明，能量代謝在腫瘤發(fā)病過(guò)程中扮演著重要角色[2]。因此，“脾失健運(yùn)”可能通過(guò)能量代謝參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展[3]。

近年來(lái)有相關(guān)研究表明，腸道微生物參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)脾虛與腸道微生物之間存在著密切關(guān)系[4，5]。此外，中醫(yī)認(rèn)為“脾為之衛(wèi)”“四季脾旺不受邪”，素體脾氣虛弱易招致外邪侵襲，這也說(shuō)明脾對(duì)邪氣具有抵御力。所以，脾主運(yùn)化水谷、抵御外邪與腸道微生物的代謝以及機(jī)體免疫功能調(diào)節(jié)具有相似之處。由此可見(jiàn)，脾虛、腸道菌群與宿主免疫之間可能存在一定的相關(guān)性，平衡穩(wěn)定的腸道菌群及免疫功能可能是維持“脾主運(yùn)化”的一個(gè)重要條件?；谏鲜隼碚摶A(chǔ)及團(tuán)隊(duì)前期研究，采用團(tuán)隊(duì)自制中醫(yī)脾虛量表(traditional chinese medicine spleen deficiency scale, TCM-SDS)[6]，計(jì)劃從腸道菌群及細(xì)胞免疫角度進(jìn)一步探索結(jié)直腸癌患者脾氣虛證的生物學(xué)特征，為進(jìn)一步研究脾氣虛證的生物學(xué)機(jī)制提供客觀科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 病例來(lái)源

納入2018年3月至2020年12月期間在中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院、北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院門診及病房就診的96例結(jié)直腸癌患者。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

有明確病理學(xué)診斷的結(jié)直腸癌患者；具備明確的臨床或病理學(xué)TNM(tumor node metastasis，TNM)分期；年齡18～80歲，性別不限；簽署知情同意書且依從性良好的患者。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

既往合并其他原發(fā)惡性腫瘤史；正處于化療期、放療期、靶向治療及免疫治療期的患者；合并嚴(yán)重心血管系統(tǒng)并發(fā)癥、腦血管系統(tǒng)并發(fā)癥、活動(dòng)性肝炎、嚴(yán)重肝腎功能異常; 任何不穩(wěn)定情況或可能危害患者安全及其研究依從性的情況，如精神分裂癥等嚴(yán)重精神疾病患者; 在入組治療開(kāi)始特定期間內(nèi)接受下列任何治療的受試者: (1)在2周內(nèi)曾接受抗生素口服或靜脈輸液治療;(2)正在接受腸道菌群調(diào)節(jié)劑(如培菲康、乳酸菌素片)。

1.4 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1 結(jié)直腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部醫(yī)政司《中國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤診治規(guī)范》[7]結(jié)直腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.4.2 TNM分期標(biāo)準(zhǔn) 參照美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)第八版分期標(biāo)準(zhǔn)[8]。

1.5 相關(guān)信息采集

1.5.1 中醫(yī)脾虛量表 本研究采用中醫(yī)脾虛量表(TCM-SDS)進(jìn)行分析，共5個(gè)條目。問(wèn)卷采用5分制選項(xiàng)，分別為 “沒(méi)有=1、偶爾=2、有時(shí)=3、經(jīng)常=4、總是=5”以評(píng)判患者脾氣虛的程度。研究分析過(guò)程中將對(duì)該量表分別計(jì)算總分，并且轉(zhuǎn)化為最高分為10分的分值以便進(jìn)行分析與比較，同時(shí)將計(jì)算該量表平均值，將入組患者劃分為“脾氣虛”“非脾氣虛”組進(jìn)行二分類變量的檢驗(yàn)(詳見(jiàn)表1)。

表1 中醫(yī)脾虛量表

1.5.2 糞便樣本采集及腸道菌群檢測(cè) 研究所用的糞便采集試管套裝均由美吉生物醫(yī)藥科技有限公司提供。受試者需采集排便后10 min內(nèi)的糞便，且避免尿液污染。在取樣后(常溫保存)14 d內(nèi)寄送至研究者手中。研究者對(duì)糞便樣本進(jìn)行編號(hào)標(biāo)注后統(tǒng)一寄送至美吉生物醫(yī)藥科技有限公司。糞便腸道菌群樣本均由中國(guó)上海美吉生物公司采用16SrRNA分析方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.3 血液標(biāo)本采集 采集受試者入組當(dāng)天靜脈血2 mL裝入EDTA-K2抗凝管(紫色試管帽)，由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院血液實(shí)驗(yàn)室、北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院血液實(shí)驗(yàn)室(流式細(xì)胞儀型號(hào)：Navios Beckman Coulter)分別對(duì)受試者樣本進(jìn)行檢測(cè)，抗體選用CD3、CD25，HLA-DR，采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)T(CD3+CD4-CD8-/CD3+CD4+CD8+/CD3+CD4+CD8-/CD3+CD4-CD8+)、B 淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

1.6.2 糞便菌群樣本分析 將統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)上傳至美吉生物云平臺(tái)(http://cloud.majorbio.com)，利用云平臺(tái)上的分析軟件進(jìn)行腸道菌群樣本分析?；?OTU 聚類分析結(jié)果，可以進(jìn)行多樣性指數(shù)分析，2組間多樣性指數(shù)差異采用 Studentt檢驗(yàn)或 Wilcoxon 秩和檢驗(yàn);基于分類學(xué)信息可以進(jìn)行群落結(jié)果的統(tǒng)計(jì)，對(duì)于多組間差異性檢驗(yàn)采用 Kruskal-Wallis 秩和檢驗(yàn) (Kruskal-Wallis H test)，2組間差異性檢驗(yàn)采用 Student t 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 人口學(xué)信息

本研究共納入96例結(jié)直腸癌患者，其中男性64例(66.70%)，女性32例(33.30%)(詳見(jiàn)表2)。

表2 受試者人口學(xué)信息特征

2.2 基于TCM-SDS量表的結(jié)直腸癌患者臨床特征分析

原發(fā)腫瘤部位、手術(shù)情況、病理類型、分化程度、是否造瘺、基因狀態(tài)、微衛(wèi)星狀態(tài)各組間在脾氣虛程度得分比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(詳見(jiàn)表3)。

表3 脾氣虛程度與結(jié)直腸癌患者臨床特征差異性分析

2.2.1 基于TCM-SDS量表脾氣虛分組的結(jié)直腸癌患者臨床特征分析 96例患者TCM-SDS量表平均分值為(3.92±1.71)，將TCM-SDS量表>3.9的患者劃分為“脾氣虛組”，將<=3.9分患者劃分為“非脾氣虛組”，對(duì)2組臨床特征及基本信息進(jìn)行差異性比較。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌患者脾氣虛組與非脾氣虛組在原發(fā)腫瘤部位、手術(shù)情況、病理類型、分化程度、基因狀態(tài)以及微衛(wèi)星狀態(tài)方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(詳見(jiàn)表4)。

表4 脾氣虛與非脾氣虛結(jié)直腸癌患者臨床特征差異性分析

2.2.2 基于TCM-SDS量表脾氣虛分組與TB淋巴細(xì)胞亞群的差異性分析 統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，脾氣虛組與非脾氣虛組在淋巴細(xì)胞(Lymphocyte)、雙陰性T細(xì)胞(double-negative T-cell,DNT)、輔助性T細(xì)胞(helper T cell，TH)、細(xì)胞毒T細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocyte,TC)、雙陽(yáng)性T細(xì)胞(double-positive T cell,DPT)、總T細(xì)胞(T-lymphocyte)、總B細(xì)胞(B lymphocyte)以及自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK)的比較中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；脾氣虛組與非脾氣虛組在NKT細(xì)胞絕對(duì)值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(45.5,IQR 50.8 vs. 28 IQR 52, U=208，P=0.049)(詳見(jiàn)表5圖1)。

圖1 脾氣虛組與非脾氣虛組NKT細(xì)胞分布差異(左：2組NKT細(xì)胞絕對(duì)值差異性比較分析；右：代表性NKT淋巴細(xì)胞流式圈門圖)

表5 脾氣虛組與非脾氣虛組TB淋巴細(xì)胞亞群的差異性分析

2.3 結(jié)直腸癌脾氣虛與非脾氣虛患者腸道菌群分布差異

納入分析96例患者中共83例完成了糞便菌群樣本采集，共包含1336600條DNA序列。利用美吉生物云平臺(tái)(http://cloud.majorbio.com)進(jìn)行生物信息分析，OTU物種分析顯示所有樣本中共包含微生物物種門水平27種，綱水平53種，目水平137種，科水平259種，屬水平615種，種水平1260,OTU水平3203種。Rank-Abundance曲線提示，所有樣本中種類較豐富(詳見(jiàn)圖2)。Pan/Core曲線分析提示曲線平滑，所查樣本量充足(詳見(jiàn)圖3)。

圖2 Rank-Abundance curves

圖3 Pan/Core曲線

2.3.1 物種組成分析 在屬(Genus)水平對(duì)脾氣虛組與非脾氣虛組進(jìn)行物種組成Venn圖分析，結(jié)果顯示2組共有2066個(gè)共同菌種，脾氣虛組具有特殊菌種720個(gè)，非脾氣虛組具有特殊菌種1048個(gè)(詳見(jiàn)圖4)。

圖4 脾氣虛與非脾氣虛組腸道菌群物種分布Venn圖

群落Bar圖組成分析結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌脾氣虛組、非脾氣虛組患者腸道菌群樣本中優(yōu)勢(shì)物種在屬(Genus)水平的組成相同，包含有擬桿菌屬(Bacteroids)、普雷沃菌屬(Prevotella)、志賀菌屬(Escherichia-Shigella)以及糞球桿菌屬(Feacalibacterium)，但是其相對(duì)豐度不同(詳見(jiàn)圖5)。TNM分期群落Pie圖顯示，與脾氣虛組患者腸道菌群比較，非脾氣虛組患者腸道群落中的擬桿菌屬占比增加為29.79%；而普雷沃菌屬、志賀菌屬以及糞球桿菌屬占比減少，分別為3.72%、4.83%、3.86%(詳見(jiàn)圖6)。

圖6 脾氣虛組與非氣虛組腸道菌群樣本優(yōu)勢(shì)物種分布Pie圖

2.3.2 物種組成差異分析 采用Student’s-t檢驗(yàn)對(duì)結(jié)直腸癌患者脾氣虛組、非脾氣虛組患者腸道菌群在屬水平物種進(jìn)行差異性分析，結(jié)果顯示非脾氣虛組中雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)豐度顯著低于脾氣虛組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(詳見(jiàn)圖7)。

圖7 脾氣虛組與非氣虛組腸道菌群物種差異分析

3 討論

3.1 TB淋巴細(xì)胞亞群與結(jié)直腸癌脾氣虛證的相關(guān)性探討

研究結(jié)果中，脾氣虛組與非脾氣虛組在NKT細(xì)胞水平上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，脾氣虛組NKT細(xì)胞絕對(duì)值水平較非脾氣虛組高。NKT細(xì)胞屬于特殊的T細(xì)胞亞群，具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性。NKT細(xì)胞可以被IL-2(Interleukin-2、IL-2)、IL-15(Interleukin-15，IL-15)和IFN-γ(interferon γ，IFN-γ)等細(xì)胞因子激活產(chǎn)生應(yīng)答[9]，活化后的NKT細(xì)胞可以通過(guò)分泌穿孔素、顆粒酶或Fas/FasL途徑殺傷某些腫瘤和病原體感染的靶細(xì)胞，也可通過(guò)分泌IL-4(Interleukin-4，IL-4)或IFN-γ參與體液免疫活細(xì)胞應(yīng)答，增強(qiáng)機(jī)體抗感染和腫瘤的作用[10]；從中醫(yī)方面來(lái)說(shuō)，中醫(yī)認(rèn)為結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展多為“因虛致積”[11，12]，多因體內(nèi)正氣不足導(dǎo)致人體防御能力下降。由此可見(jiàn)，正氣虧虛導(dǎo)致的免疫功能下降是惡性腫瘤發(fā)病的基礎(chǔ)，所以NKT細(xì)胞絕對(duì)值的變化，可能是反映脾氣虛變化的生物學(xué)指標(biāo)。

3.2 腸道菌群對(duì)結(jié)直腸癌脾氣虛證的生物學(xué)特征預(yù)測(cè)

從群落組成分析結(jié)果來(lái)看，非脾氣虛組患者腸道群落中普雷沃菌屬、志賀菌屬以及糞球桿菌屬占比減少。有相關(guān)研究表明，普雷沃菌屬可以通過(guò)免疫炎癥反應(yīng)基因的表達(dá)影響結(jié)直腸癌的發(fā)展。志賀菌屬、糞球菌屬被證明與腸道感染以及促進(jìn)結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞增殖有關(guān)，大都是通過(guò)誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞內(nèi)超氧化物的形成，導(dǎo)致結(jié)腸上皮細(xì)胞的損傷造成炎癥感染[13，14]。結(jié)直腸癌脾氣虛證患者常以腹瀉、腹脹、腸鳴等癥狀為主，同時(shí)有大量實(shí)驗(yàn)研究表明，脾虛會(huì)影響腸道菌群物種豐富度及數(shù)量的變化[15-18]，說(shuō)明在脾虛狀態(tài)下機(jī)體代謝功能降低，其功能變化可能與腸道菌群組成及豐度變化有關(guān)。所以，通過(guò)這3種菌屬的豐度變化可以判斷，該菌屬可能會(huì)成為中醫(yī)治療結(jié)直腸癌脾氣虛的生物標(biāo)志物。

脾氣虛組腸道菌群中雙歧桿菌屬豐度較高，很多研究證明，益生菌對(duì)抑制腫瘤的發(fā)生或緩解治療相關(guān)副作用是有益的。雙歧桿菌常被用于圍手術(shù)期預(yù)防腹瀉、感染等術(shù)后并發(fā)癥，也有研究報(bào)道，其可以用于提高癌癥的治療效率[19]。有研究報(bào)道，脾氣虛會(huì)導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，益生菌數(shù)量減少，導(dǎo)致腸道內(nèi)短鏈脂肪酸水平的下降[20]。而本研究所納入的患者均經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的中藥治療以恢復(fù)手術(shù)導(dǎo)致的正氣虛損，中藥處方以健脾為主以恢復(fù)體內(nèi)正氣。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，以健脾為主的中藥復(fù)方能夠提高脾虛型小鼠腸道雙歧桿菌及乳酸桿菌的豐度[21-23]，所以脾氣虛組中雙歧桿菌屬豐度的增高可能與口服中藥治療相關(guān)，但其相關(guān)作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

本研究納入患者處在不同臨床分期和治療階段，所以脾氣虛的嚴(yán)重程度存在一定的差異。且此研究?jī)H對(duì)“脾氣虛證”進(jìn)行重點(diǎn)分析和探討，而在臨床實(shí)際中，患者的證型并不單一且無(wú)規(guī)范的統(tǒng)一診斷標(biāo)準(zhǔn)。在腸道菌群分析方面，本研究采用16SrRNA分析方法僅能夠?qū)颊吣c道菌群多樣性進(jìn)行觀察與分析，而對(duì)于菌群功能預(yù)測(cè)欠佳。此外，課題組前期研究基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn)，中藥干預(yù)后CD4T細(xì)胞絕對(duì)值明顯升高，并與放線菌中的雙歧桿菌具有顯著相關(guān)性，但此結(jié)果是否與機(jī)體脾虛狀態(tài)有關(guān)仍需進(jìn)一步研究。本研究納入不同醫(yī)院結(jié)直腸癌患者在TB淋巴細(xì)胞亞群的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)環(huán)境及試劑可能存在一定差異，但屬于可接受的系統(tǒng)誤差。未來(lái)我們可以通過(guò)對(duì)不同分期、不同治療階段進(jìn)行分層分析，以比較不同狀態(tài)下脾氣虛證的差異，并進(jìn)一步分析其與腸道菌群的相關(guān)性。此外，我們還可以通過(guò)宏基因組學(xué)方法進(jìn)一步分析，以更加深入了解結(jié)直腸癌脾氣虛證與腸道菌群的相關(guān)機(jī)制。